СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ


RU (11) 2039819 (13) C1

(51) 6 C12N9/48, C12N9/64 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 10.08.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1995.07.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 4806987/13 
(22) Дата подачи заявки: 1990.03.29 
(45) Опубликовано: 1995.07.20 
(56) Аналоги изобретения: 1. Biochemistmy, 1973, 12, p. 1814-1822. 2. Европейский патент N 0402321, кл. C 12N 9/64, 1989. 
(71) Имя заявителя: Артюков Александр Алексеевич; Сахаров Иван Юрьевич 
(72) Имя изобретателя: Артюков Александр Алексеевич; Сахаров Иван Юрьевич 
(73) Имя патентообладателя: Артюков Александр Алексеевич; Сахаров Иван Юрьевич 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ 

Использование: биотехнология, а именно препаративная биохимия, изобретение может быть использовано в меховой и кожевенной промышленности, в ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: в качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас крабов. Выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0 30°С в течение 2 8 с, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01 0,4 мас. а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с мол. м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 кДа и ниже, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800 11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаративной биохимии, и используется для получения очищенной коллагеназы животного происхождения, которая находит применение в клеточной биотехнологии, меховой и кожевенной промышленности, парфюмерии, ветеринарии и медицине, в научно-исследовательской работе.

Известен способ получения коллагеназы, который заключается в выделении фермента из гепатопанкреаса краба Uca pugilator с помощью гомогенизации ткани в 10 объемах ацетона при -20оС, обработке осадка 10 объемами н-бутанола, затем 10 объемами ацетона при -20оС, после чего проводились сушка, растворение порошкообразного препарата, центрифугирование, осаждение из раствора фермента сульфатом аммония (70% от насыщения) при 0оС, гельфильтрация на сефадексе G 150, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматография на гидроксилапатите и повторная гель-фильтрация на сефадексе G75. Все хроматографические операции проводились при 4оС. В результате получен гомогенный препарат коллагеназы с удельной активностью 4020 единиц на 1 мг белка [1]

Недостатком данного метода является его многостадийность, применение в больших количествах органических растворителей, являющихся взрывоопасными (например ацетон, температура вспышки которого равна -18оС) и экологически грязными, а также необходимость создания низких температур на первых стадиях выделения коллагеназы.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов с помощью гомогенизации ткани в буферных водных растворах с рН 6-9,5, содержащих неионный детергент в количестве 0,1-5% и 0,1-2,0 М хлорида щелочного металла, после чего последовательно проводились микрофильтрация и ультрафильтрация с лимитом пропускания 5000 Да. В результате получен препарат коллагеназы с удельной активностью не ниже 10000 единиц на 1 мг белка [2]

Известный способ позволяет получать коллагеназу краба без применения органических растворителей, что является большим биотехнологическим достижением, все же и он не лишен серьезных недостатков. Так, в способе используются высокие концентрации поверхностно-активных веществ (неионный детергент) и солей (хлориды щелочных металлов), веществ, способных разрушить экологическое равновесие окружающей среды. Применение же очистных сооружений приведет к резкому удорожанию процесса выделения колагеназы. Другим серьезным недостатком является отсутствие стадии удаления липидов, содержание которых в гепатопанкреасе крабов очень высокое. Это существенно сказывается на стабильности конечного продукта из-за окисления липидов и эффективности проведения ультрафильтрации, так как рабочие мембраны быстро выходят из строя. Кроме того, последовательное проведение микрофильтрации и ультрафильтрации с лимитом пропускания 5 кДа позволяет отделять коллагеназу лишь от надмолекулярных высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных веществ. Невелика и скорость ультрафильтрации на мембранах с пределом пропускания 5 кДа.

Целью изобретения является повышение качества целевого продукта и упрощение процесса.

Это достигается тем, что замороженный гепатопанкреас крабов помещают в слабощелочной забуференный раствор и инкубируют при перемешивании в течение 2-8 ч при температуре 0-30оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. Для удаления липидов к полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана, рН 2,0-6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01-0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол. м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Все операции проводят при температуре выше 0оС. Удельная активность коллагеназы достигает 9800-11200 ед. на 1 мг белка. Целевой продукт не содержит липидов.

В предложенном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Упрощение также достигается применением серийно выпускаемого оборудования для ультрафильтрации, что позволяет полностью автоматизировать весь технологический процесс.

Нижняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации ниже 0,01% резко падает его флокулирующая способность, и в результате этого происходит лишь незначительное удаление примесных соединений из раствора фермента.

Верхняя граница концентрации хитозана обусловлена тем, что при концентрации выше 0,4% наблюдается агрегация молекул хитозана, которые не обладают флокулирующими свойствами и, соответственно их применение не приводит к очистке колагеназы.

Нижняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что после добавления в раствор фермента хитозана с рН ниже 2,0 наблюдается инактивация коллагеназы.

Верхняя граница рН раствора хитозана обусловлена тем, что хитозан при рН выше 6,5 слаборастворим.

Нижняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре ниже 0оС водные растворы замерзают.

Верхняя граница температуры процесса гомогенизации определяется тем, что при температуре выше 30оС в данных условиях начинается наблюдаться инактивация коллагеназы краба.

Указанное время гомогенизации (2-8 ч) является минимальным временем, необходимым для полного растворения ткани, которое в свою очередь зависит от температуры процесса (при более низкой температуре необходимо вести дольше процесс, а при более высокой температуре гомогенизация заканчивается раньше). Сокращение времени гомогенизации приводит к неполному переходу фермента в раствор.

Выбор мембраны для ультрафильтрации на первой стадии, отсекающей вещества с мол. м. 100 кДа и выше, обусловлен тем, что эта мембрана, задерживая примесные соединения, совершенно не задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с меньшим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) частично задерживают коллагеназу краба. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.

Выбор мембраны для ультрафильтрации на второй стадии, отсекающей вещества с мол.м. 30 КДа и ниже, обусловлен тем, что эта мембрана, не задерживая примесные соединения, полностью задерживает коллагеназу краба, в то время как доступные в настоящее время мембраны с большим диаметром пор (отсекают вещества с мол.м. 50 или 40 кДа) часть коллагеназы задерживают, а часть пропускают. Мембраны с промежуточными диаметрами пор не выпускаются.

П р и м е р 1. 10 кг гепатопанкреаса камчатского краба помещают в 30 л забуференного трисом раствора рН 8,0 и инкубируют при перемешивании в течение 2 ч при температуре 30оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 5,5, доводя его конечную концентрацию до 0,2% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. выше 100 кДа, а затем примесные вещества с мол.м. ниже 30 кДа. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 11200 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

П р и м е р 2. 10 кг гепатопанкреаса краба-стригуна помещают в 30 л забуференного боратом раствора рН 7,8 и инкубируют при перемешивании в течение 8 ч при температуре 0оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 2,0, доводя его конечную концентрацию до 0,4% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 КДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 КДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 10800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.

П р и м е р 3. 10 кг гепатопанкреаса синего краба помещают в 30 л забуференного карбонатом раствора рН 8,3 и инкубируют при перемешивании в течение 3 ч при температуре 20оС до полной гомогенизации гепатопанкреаса. К полученному раствору при интенсивном перемешивании добавляют раствор хитозана рН 6,5, доводя его конечную концентрацию до 0,01% Образовавшийся нерастворимый материал отделяют, а полученный раствор подвергают ультрафильтрации, отделяя сначала примесные вещества с мол.м. 100 кДа и выше, а затем примесные вещества с мол.м. 30 кДа и ниже. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы равна 9800 ед. на 1 мг белка. Липиды в препарате отсутствуют. Таким образом, изобретение позволяет создать простой, легко масштабируемый и экологически чистый процесс выделения и очистки коллагеназы крабов при небольших затратах материалов, рабочего и технологического времени и сырья. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ, предусматривающий гомогенизацию гепатонкреаса промысловых крабов в забуференных водных растворах с последующей ультрафильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта и упрощения процесса, гомогенизацию осуществляют путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2 8 ч при температуре 0 - 30oС, к полученному раствору при перемешивании добавляют раствор хитозана с pH 2,0 6,5 до достижения концентрации 0,01 0,4 мас. и отделяют нерастворимый материал, а ультрафильтрацию ведут последовательно на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 КДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, и затем на мембране, отсекающей вещества с мол. м. 30 КДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану.