СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ


RU (11) 2145712 (13) C1

(51) 7 G01N33/49 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 97113204/13 
(22) Дата подачи заявки: 1997.07.31 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1997.07.31 
(45) Опубликовано: 2000.02.20 
(56) Аналоги изобретения: Аутоантитела облученного организма /Под ред. Н.Н. Клемпарской. - М.: Атомиздат, 1972, с. 95 - 105. 
(71) Имя заявителя: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт 
(72) Имя изобретателя: Авилов В.М.; Равилов А.З.; Киршин В.А.; Низамов Р.Н.; Конюхов Г.В.; Акмуллина Н.В.; Курбангалеев Я.М.; Чернова Р.В.; Ветров В.П. 
(73) Имя патентообладателя: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт 
(98) Адрес для переписки: 420018, Казань, Научный городок, 2, Всероссийский научно- исследовательский ветеринарный институт 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к производству препаратов, предназначенных для диагностики радиационных поражений организма. Способ диагностики радиационных поражений организма заключается в проведении серологического анализа сыворотки крови облученных млекопитающих в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием противолучевого антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД) - сенсибилизированных противолучевыми антителами формалинизированных и танизированных эритроцитов барана. При наличии в исследуемой сыворотке млекопитающих радиоиндуцированных (лучевых) антигенов гемагглютинируют и по степени гемагглютинации (3-4+) и титру антигена( 1:8) ставят диагноз на радиационные поражения. Антительный эритроцитарный противолучевой диагностикум (АТЭД) для диагностики радиационных поражений организма получают путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана противолучевой сывороткой, полученной путем гипериммунизации кроликов лучевыми антигенами, адсорбированной поэтапно гетерологичными антигенами (тканевыми порошками - иммуносорбентами), центрифугированной и залитой фосфатно-буферным раствором с содержанием 0,5% нормальной лошадиной сыворотки и получаемый препарат консервируют 0,3%-ным фенолом. Способ диагностики и способ получения препарата для его осуществления позволяют экстренно ставить диагноз на лучевую болезнь, определить ее степень, а также прогнозировать ее исход. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к получению и производству препаратов, предназначенных для диагностики радиационных поражений организма.

Актуальной проблемой в ветеринарии и медицине является создание экспресс-методов диагностики острой лучевой болезни, которые не только прогнозировали бы ее исход, но и способствовали бы экстренному проведению лечебно-профилактических противорадиационных мероприятий.

В настоящее время известны способы диагностики радиационных поражений, однако они имеют свои недостатки.

Известен способ диагностики радиационных поражений овец путем гематологического анализа периферической крови и определения нейтрофильного индекса (см. кн. "Ветеринарная противорадиационная защита", - Под ред. В.А.Киршина и В.А.Бударкова. -М.: Агропромиздат, 1990, с.111).

Недостатком этого метода является ограниченность его применения, так как он расчитан только для диагностики лучевой болезни овец, а для остальных млекопитающих он непригоден.

Известен способ диагностики радиационных поражений людей путем выявления аутоантител в сыворотке крови методом непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ) на криостатных средах тимуса и 14-дневной культуре эпителиальных клеток тимуса новорожденных мышей (см. сб. тезисов "Иммунный статус человека и радиация", -М, 1991, - с. 31).

Однако криоконсервирование клеток и тканей, использование лабораторных животных, иммунофлуоресцентной и иммуногистохимической техники, являются очень дорогостоящими, сложными и длительными методами, оценка результатов которых к тому же субъективна.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ диагностики радиационных поражений организма, включающий серологический анализ молока облученных коров и обнаружение в нем иммунных комплексов - пострадиационных аутоантител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), в которой в качестве диагостикума используют сенсибилизированные лучевыми антигенами эритроциты барана и по титру антител ставят диагноз на лучевые поражения (см. кн. "Аутоантитела облученного организма". Под ред. Н.Н. Клемпарской, -М., Атомиздат, 1972. - с. 95-105).

Недостатком этого способа диагностики является невозможность экстренной постановки диагноза на радиационные поражения, невозможность определения их исхода и принятие экстренных лечебно-профилактических противорадиационных мероприятий, из-за вступления в реакции гемагглютинации с общетканевыми аутоантителами, образующимися в организме не только при поражении ионизирующими излучениями, но и при воздействии на него других физических (ожоги, травмы), химических (яды, токсины, отравляющие вещества) и биологических (вакцин, возбудителей инфекционных болезней и.т.д.) агентов, а аутоантитела, в силу функционирования иммунной системы в ответ на воздействие перечисленных агентов, образуются только через 10-20 дней после воздействия, все это исключает возможность экстренной постановки диагноза на радиационные поражения, и кроме того, этот способ ограничивает вид млекопитающих (лактирующих коров) и объект исследования (сыворотку молока).

Вместе с тем, из области радиационной иммунологии известно что при многократном введении в организм тканевых элюатов (антигенов) облученных млекопитающих можно получить противолучевые сыворотки, используемые как с лечебно-профилактической так и с диагностической целью (см. кн. "Аутоантитела облученного организма": Под ред. Н.Н. Клемпарской. - М., 1972 - с. 76-79). Однако полученные при этом гипериммунные сыворотки недостаточно специфичны, ибо, будучи получены на тканевые антигены, содержат общетканевые (гетерологичные) антитела, что снижает ценность этих сывороток.

Задачей изобретения является разработка простого и унифицированного способа, повышающего постановку прижизненного экспресс-диагноза на радиационные поражения в ранние сроки (в течение первых 3-х суток) после летального облучения организма.

Поставленная задача решается за счет использования серологического анализа сыворотки крови облученных млекопитающих в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), которую проводят с использованием противолучевого антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД), в котором в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные противолучевой сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана и по феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов судят о наличии радиоиндуцированного (лучевого) антигена (РИАГ) в исследуемых сыворотках, по степени гемагглютинации эритроцитов и по титру лучевого антигена в РНГА ставят диагноз на радиационные поражения, за диагностический титр радиоиндуцированных антигенов в РНГА принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1:8 и выше со степенью гемагглютинации эритроцитов в 3-4 креста, а в качестве дифференциального критерия летального облучения млекопитающих - 3-4-х кратное превышение диагностического титра РИАГ в сыворотке крони в РНГА (1:24- 1:32).

Сущность изобретения заключается также и в том, что в способе получения противолучевого антительного эритроцитарного препарата (АТЭД) для диагностики радиационных поражений организма, включающем извлечение из облученных тканей млекопитающих лучевого антигенного материала, гипериммунизацию им кроликов, приготовление адсорбента и очистку им гипериммунных сывороток, сенсибилизацию последними формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, согласно изобретению в качестве сенситина для сенсибилизации эритроцитов используют противолучевую гипериммунную сыворотку кроликов, получаемую путем 4-цикличного с интервалом в 4 дня между циклами внутривенного и внутрибрюшинного в дозе по 9-10 мг введения извлеченного из печени облученных в дозе 4,0-4,5 Гр и убитых через 3-4 дня после облучения морских свинок, адсорбированную поэтапно порошками из печени необлученных (1), иммунизированных бактериальными вакцинами (2) и обожженных (3) животных из расчета 10-11 мг/кг (1-й адсорбент), 6,0-7,0 мг/мл (2-й адсорбент) и 10-11 мг/мл (3-й адсорбент) по 15-20 мин при 37o 1oC и постоянном перемешивании с последующим 2-кратным центрифугированием сыворотки при 5929 g в течение 20-30 мин. Сенсибилизацию эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов разведенной физиологическим раствором (1:10) адсорбированной противолучевой сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов с последующим термостатированием смеси в течение 2,5-3 часов при температуре 37o 1oC и центрифугированием эритроцитов при 1000-1500 g в течение 10 мин, осадок после декантирования супернатанта заливают фосфатно-буферным раствором (ФБР) с pH 7,2 с содержанием 0,5% "нормальной" лошадиной сыворотки, повторяют эту операцию (сенсибилизацию) трижды и полученный продукт (противолучевой антительный эритроцитарный диагностикум-АТЭД) консервируют 0,3%-ным фенолом в холодильнике при 2-6oC.

Существенным отличием способа диагностики радиационных поражений организма и способа получения препарата для его осуществления является то, что для детектирования специфического (лучевого) радиоиндуцированного антигена в облученном организме вводится целенаправленная высокоспецифичная и чувствительная тест-система - (РНГА) с учетом сроков появления искомых антигенов и степени их концентрации от дозы летального облучения.

Сущность предлагаемого способа основана на том, что под воздействием ионизирующих излучении в организме происходит расщепление белков собственных тканей, аддукты которых, соединяясь ковалентной или ионной связью с реакционноактивными химическими группами и радикалами, образуют радиомодифицированные антигены с совершенно новыми свойствами, названными "лучевыми" антигенами, а также радиотоксинами. Сроки появления радиоиндуцированных антигенов и токсинов приходится на первые часы и сутки (до 10-12) после облучения, которые в дальнейшем, в результате функционирования иммунной системы организма, элиминируются или нейтрализуются аутоантителами, синтезированными в ответ на антигенное раздражение иммунокомпетентных клеток. Следовательно, логично было предположить, что поиск противолучевых антител у облученного организма в первые сутки после облучения может дать недостаточную информацию, ибо в ответ на воздействие мощного стресс-фактора образуются радиомодифицированные антигенные комплексы, которые могут быть детектированы с помощью специфических (гомологичных лучевому антигену) противолучевых антител, нагруженных (сенсибилизированных) на поверхности высокочувствительного иммуносорбента-формалинизированных и танизированных эритроцитов барана.

Использование полученного диагностикума (АТЭД) в иммунохимической тест-системе (РНГА) позволяет за 1,5-2 часа детектировать (обнаруживать) в сыворотке крови облученного организма специфические радиоиндуцированные (лучевые) антигены (РИАГ), которые появляются в первые часы и сутки после радиационного поражения и регистрируются во весь период разгара лучевой болезни (первые 10-14 суток после облучения).

Такая технология приводит к значительному упрощению способа, повышению экспрессности, производительности труда, достоверности результатов анализа, а также его унификации и расширению области применения.

Исключение использования криостатной, иммунофлуоресцентной и иммуногистохимической техники, дефицитных детергентов и лабораторных животных значительно упрощает технологию и обеспечивает улучшение экологических условий реализации способа.

Способ диагностики радиационных поражений организма и способ получения диагностического препарата осуществляется следующим образом.

Начальным этапом изготовления диагностического препарата (противолучевого антительного эритроцитарного диагностикума-АТЭД) является получение моноспецифической гипериммунной противолучевой сыворотки, которая служит источником специфических антител (сенситином) для сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, служащих биологическим иммуносорбентом (носителем) противолучевых антител.

Гипериммунную противолучевую сыворотку получают путем иммунизации кроликов тканевыми экстрактами, содержащими радиоиндуцированные ("лучевые") антигены, в качестве которых используют экстракт печени облученных гамма- или рентгеновыми лучами лабораторных животных (белых крыс, морских свинок или кроликов) Для этой цели лабораторных животных (например, морских свинок) облучают гамма-лучами в дозе 4,0-4,5 Гр при мощности экспозиционной дозы 5,6 Р/мин и на 3-4 сутки после облучения у них тотально извлекают печень и готовят из нее тканевой антиген по методике С.Я. Капланского и др. (см. ж-л "Биохимия", 1958, N 23, с. 114).

В полученном экстракте определяют белок по Лоури, содержание которого составляет, в зависимости от дозы и срока убоя после облучения, 25-55 мг/мл.

Полученный тканевой экстракт, содержащий радиоиндуцированные ("лучевые") антигены, стандартизируют путем разведения стерильным физиологическим раствором pH 7,2-7,4 до концентрации 5 мг/мл для гипериммунизации лабораторных животных (например, кроликов).

Гипериммунизацию кроликов живой массой 2,0-2,5 кг проводят по следующей схеме.

В течение первых трех дней животным ежедневно вводят внутривенно (в/в) по 1 мл тканевого экстракта (5 мг белка). После 4-дневного перерыва проводят второй курс иммунизации:

- в 1-й день второго курса кроликам вводят внутрибрюшинно (в/б) по 2 мл экстракта на 2-й и 3-й день по 1 мл внутривенно (в/в). Так же, как второй проводят третий и четвертый курсы иммунизации с промежутками между курсами в 4 дня. Цикл иммунизации длится 4 недели. На восьмой день после последней инъекции антигена (АГ) у кроликов берут кровь из ушной вены для определения противолучевых антител, которое проводят в реакции потребления комплемента (РПК) по методике А. А. Иванова (см. "Лабораторное дело", 1968, N 10, с. 611). В качестве положительного антигена (АГ) в реакции используют АГ облученных тканей (АОТ), в качестве отрицательного - АГ необлученных тканей (АНТ).

Кролики, в сыворотке которых обнаруживают антитела (AT) в достаточном титре (не менее 1: 300), обескровливают. Полученные иммунные сыворотки инактивируют путем прогревания при 56oC в течении 30 мин, разливают по флаконам или ампулам, консервируют борной кислотой и хранят в холодильнике при 4oC.

Ввиду того, что полученные гипериммунные сыворотки, наряду со специфическими антителами (противолучевыми), всегда содержат в большей или меньшей степени и другие неспецифические (общетканевые) антитела, они подлежат очистке от этих антител.

Применение известных способов удаления из гипериммунных сывороток неспецифических (общетканевых) антител при помощи адсорбции их нативными гетерологичными тканями (тканями необлученных животных) не приводят к положительным результатам.

Для решения этой задачи используют адсорбент-порошок печеночной ткани, полученный от интактных (необлученных), подвергнутых иммунизации бактериальными вакцинами и термическому (физическому или химическому ожогу) воздействию лабораторных или с.-х. животных.

Адсорбент (порошок печеночный ткани) готовят следующим образом: кусочки органа заливают 5%-ным раствором формалина (1:10) и оставляют на 5-6 суток для консервирования, затем отмывают их от консерванта физиологическим раствором, измельчают ножницами, заливают физиологическим раствором (1:4) и гомогенизируют в скоростном микроизмельчителе. Гомогенат центрифугируют 30 мин при 3020g, супернатант разливают тонким слоем по чашкам Петри и высушивают его при комнатной температуре 4-5 ч. Сушку можно проводить также на лиофильной установке или в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре (755)oC.

Полученный таким способом печеночный порошок используют в качестве иммуносорбента для очистки гипериммунных сывороток от неспецифических антител.

Адсорбцию сывороток проводят в 3 этапа следующим образом: к 1 см3 сыворотки добавляют порошок печени из расчета 10-11 мг адсорбента от необлученных (интактных животных, смесь ставят на магнитную мешалку и адсорбцию ведут в течение 15-20 мин при температуре (37 1)oC при постоянном помешивании.

По окончании адсорбции сыворотку центрифугируют при 5325g в течение 30 мин, осадок отбрасывают. В надосадочной жидкости растворяют второй адсорбент - порошок печени иммунизированных бактериальными вакцинами животных из расчета 6,5-7,0 мг/мл и проводят второй цикл адсорбции по вышеописанному методу.

По окончании второго цикла адсорбции смесь центрифугируют при 5925g в течение 30 мин. При этом адсорбент, возможные микробные контаминанты, попавшие в сыворотку в технологическом цикле, удаляют центрифугированием, а очищенные специфические антитела остаются в надосадочной жидкости (сыворотке).

После адсорбирования сыворотки фильтруют через асбестовые пластины марки СФ или мембранные фильтры N 2 с помощью аппарата Зейтца. Затем адсорбированную сыворотку проверяют на активность и специфичность в реакции потребления комплемента (РПК) и использованием положительного (гомологичного), отрицательного и гетерологичного антигенов. При этом устанавливают, что адсорбированные сыворотки сохраняют серологическую активность, хотя в цикле адсорбции происходит незначительное снижение титра (1:150-1:120 против 1:300 в исходе) сыворотки, однако при этом реакция с отрицательным и гетерологичным антигенами не происходит, что свидетельствует о полноте удаления из сывороток неспецифических общетканевых (гетерологичных) антител.

Сыворотки, сохранившие достаточную серологическую активность в РПК (на ниже 1:100) и по вступлении в перекрестные реакции с отрицательным и гетерологичным антигенами, используют в дальнейшем в качестве специфических антител (сенситина) для сенсибилизации эритроцитов барана с целью приготовления антительного противолучевого эритроцитарного диагностикума (АТЭД).

Для приготовления АТЭД в качестве иммуносорбента используют танизированные и формалинизированные по Фили и Чизмесу (см. кн. "Лабораторное дело", 1968, N 11. с. 604) эритроциты барана, на которых адсорбируют (нагружают) cенситин (адсорбированную по вышеописанной методике инактивированную противолучевую гипериммунную сыворотку кролика).

Сенсибилизацию (нагружение антителами) эритроцитов специфическими противолучевыми антителами осуществляют следующим образом: адсорбированную и инактивированную сыворотку разводят физраствором 1:10 и к ней добавляют буфер из расчета 5 см на 1 см разведенной сыворотки. Затем смешивают равные объемы 3% взвеси формалинизированных и танизированных эритроцитов и разведенной адсорбированной противолучевой сыворотки. Эритроцитарнув взвесь помещают в термостат при температуре 37oC на 2,5-3 часа. Сенсибилизацию ведут при постоянном перемешивании. По истечении этого времени эритроциты осаждают в течение 10 мин центрифугированием при 1000-1500g. Надосадочную жидкость и осадок заливают фосфатно-буферным раствором с pH 7,2 с содержанием 0,5% лошадиной сыворотки. Такую операцию повторяют 3 раза. Затем из осадка готовят 3%-ную взвесь эритроцитов на этом же фосфатно-буферном растворе с содержанием 0,5% "нормальной" лошадиной сыворотки.

Полученный таким образом противолучевой антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД) консервируют 0,3%-ным фенолом и хранят в холодильнике при температуре (2-6o)C и используют в качестве источника специфических антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для обнаружения радиоиндуцированных антигенов (РИАГ) в исследуемых сыворотках млекопитающих.

Постановку диагноза на радиационные поражения организма осуществляют следующим образом: у обследуемых млекопитающих берут периферическую кровь в объеме 5 см3 и получают из нее сыворотку общепринятым методом.

Полученную сыворотку используют в качестве антигена в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), постановку и оценку результатов которой проводят в соответствии с методическими указаниями М.М. Леви и Н.Н. Басовой (см.кн. "Лабораторное дело", 1968, N 11, с.674).

В качестве источника специфических (противолучевых) антител в РНГА используют полученный по вышеуказанному способу АТЭД.

Реакцию сопровождают соответствующими контролями:

1) сыворотка интактных млекопитающих (отрицательный контроль

2) сыворотка облученных млекопитающих (положительный контр;)

3) сыворотка иммунизированных бактериальными вакцинами;

4) сыворотка обожженных млекопитающих;

5) сыворотка подвергнутых химическому воздействию млекопитающих (гетерологичные контроли).

За положительную реакцию непрямой гемагглютинации принимают оседание сенсибилизированных противолучевыми антителами эритроцитов (АТЭД) на дне лунок иммунологических планшетов с оценкой в 3-4 креста в разведении испытуемых сывороток (антигена) 1:8 и выше при отрицательной реакции с гетерологичными и отрицательными антигенами.

Положительная реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с испытуемыми сыворотками в разведениях 1: 8 и выше (степень гемагглютинации 3-4 креста) свидетельствует о поражении организма ионизирующими излучениями, вызывающими острую лучевую болезнь (ОЛБ) средней и тяжелой степени тяжести.

При этом дифференциально-диагностическими критериями степени ОЛБ служат титры РНГА : 3-4-кратное превышение диагностического титра (1:24-1:32) свидетельствует о поражении организма летальными (смертельными), а титры в пределах 1:8-1:16 - о поражении сублетальными (несмертельными) дозами радиации.

Условия и режимы адсорбции (очистки) гипериммунной противолучевой сыворотки, сенсибилизации эритроцитов специфическим сенситином подобраны экспериментальным путем.

Способ диагностики радиационных поражений отобран на лабораторных (белых крысах и морских свинках) комиссионно апробирован на крупных млекопитающих (овцах и телятах). Животных облучали на гамма-установке "Пума" с источником излучения C137 при мощности дозы 5,6 Р/мин. Развитие лучевой болезни оценивали по клинико-гематологическим показателям, динамике гибели, патоанатомическому вскрытию и выживанию животных.

Пример 1. Получение лучевого антигена.

Лучевой антиген получали путем облучения морских свинок в дозах 3,5-5,0 Гр и на 2-6 сутки после облучения тотально извлекали печень и общепринятым методом готовили тканевой антиген. В полученном тканевом экстракте определяли белок по Лоури. Устанавливали, что наибольший выход антигенного материала (35-45 мг/мл) достигается при облучении морских свинок в дозах 4,0-4,5 Гр и убое животных на 3-4 сутки после облучения. Уменьшение дозы облучения (3,5 Гр) или ее увеличение (5,0 Гр), а также сокращение срока убоя (через 1-2 суток), как и его увеличение (через 5-6 суток) не обеспечивают выхода антигенного материала (концентрация тканевых белков при этих режимах на превышает 25-30 мг/мл).

Пример 2. Получение противолучевой гипериммунной сыворотки.

Гипериммунную противолучевую сыворотку получали путем многократного введения (гипериммунизации) полученного антигена кроликам, использовав при этом различные дозы и схемы его введения. При этом испытывали 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- цикличные курсы введения антигенного материала, использовав различные его варианты, полученные на 1, 2, 3, 4, 5, 6 сутки после облучения морских свинок, облученных в дозах 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 Гр. Активность сывороток определяли в реакции потребления комплемента (РПК).

Результаты опытов показали, что наибольший титр противолучевых сывороток (1: 300-1: 400) получали от кроликов, подвергнутых 4-цикличной иммунизации лучевым антигеном, предполагающей 3-кратное ежедневное введение АГ кроликам внутривенно в дозах по 5 мг белка на 1 инъекцию (1-й цикл), повторение курса инъекции через 4 дня, при которой в 1-й день вводили 10 мг антигена внутрибрюшинно (в/б), а на 2-й и 3-й день - по 5 мг белка внутривенно (в/в) (2-й цикл); третий и четвертый циклы иммунизации проводили так же, как и 1-й и 2-й циклы с интервалом в 4 дня.

Изменение схемы иммунизации (1-, 2-, 3-, 5-, 6- цикличная иммунизация животных, уменьшение (1, 2, 3, 4 мг белка) или увеличение (6, 7, 8, 9, 11, 12 мг белка) дозы вводимого антигена не обеспечивали получение антисывороток с достаточной серологической активностью, ибо титр противолучевых антител при указанных изменениях в РПК не превышал 1:30- 1:100.

Пример 3. Адсорбция (очистка) противолучевой гипериммунной сыворотки.

Для очистки противолучевых сывороток от неспецифических антител использовали печеночные порошки от интактных, иммунизированных бактериальными вакцинами и обожженных млекопитающих. При этом испытывали 1-, 2-, 3-стадийные схемы адсорбции сывороток, используя различные дозы адсорбентов (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 мг/мл), сроки адсорбирования (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 мин) и температуры инкубирования (35, 36, 37, 38, 39, 40oC).

Результаты опытов показали, что полное удаление неспецифических антител из противолучевых сывороток достигается только при применении 3-этапного адсорбирования с применением 3 адсорбентов при соотношении адсороентов к сыворотке 10-11 мг/мл (1-й адсорбент), 6,5-7,0 мг/мл (2-й адсорбент) и 10-11 мг/мл (3-й адсорбент) в течение 15-20 мин при температуре (37 1)oC при постоянном перемешивании. Изменение указанных условий и режимов адсорбирования (увеличение или уменьшение адсорбента, срока адсорбирования, температуры инкубирования) не приводят к желаемому результату, ибо увеличение дозы адсорбента и срока адсорбирования резко снижают титр сыворотки, а уменьшение дозы адсорбента не обеспечивает полного удаления гетерологичных антител.

Пример 4. Определение оптимальных условий режимов сенсибилизации эритроцитов барана.

Для определения оптимальных параметров сенсибилизации эритроцитов использовали различные соотношения компонентов (сенситина и эритроцитов), температуры инкубирования и экспозиции адсорбирования. При этом использовали различные разведения сенситина (адсорбированной сыворотки в физиологическом растворе 1:2; 1:4; 1:8; 1:10), различные соотношения сенситина и взвеси эритроцитов (1:2, 1:4, 1:8, 1:10), температуры адсорбирования (20, 25, 30, 35, 37, 38, 39, 40oC) и экспозиции адсорбирования (1; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 часа). Установили, что наиболее оптимальными условиями и режимами сенсибилизации эритроцитов является разведение адсорбированной сыворотки 1:10, соотношение разведении сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов 1:1, температура термостатирования 37oC и экспозиция сенсибилизации - 2,5-3 часа. Изменение же указанных параметров как в сторону увеличения, так и уменьшения не обеспечивая достаточного уровня сенсибилизации, ибо увеличение их ведет к эффекту самоагглютинации эритроцитов, а уменьшение - к отсутствию гемагглютинации при контакте с положительным лучевым антигеном.

Пример 5. Эффективность способа диагностики лучевых поражений млекопитающих с использованием полученного эритроцитарного диагностикума испытывали на морских свинках. С этой целый 10 морских свинок подвергали летальному облучению на гамма-установке "Пума" в дозе 6,0 Гp, 10 подвергали термическому ожогу (гетерологичный контроль), 10 использовали в качестве биологического контроля. У контрольных и подвергнутых лучевому и термическому воздействию морских свинок в динамике (ежедневно в течение 7 суток после облучения) брали пробы крови для серологического исследования в РНГА. Для сравнения параллельно проводили опыты по известному способу путем определения аутоантител в РНГА. Как показали результаты опытов, у облученных морских свинок уже через 48 часов после радиационного воздействия в сыворотке крови появляются радиоиндуцированные антигены в титрах 1:8 и через 72 часа они достигают значений 1: 16 - 1:32 и удерживаются на этом уровне в течение 7-10 суток. В сыворотке крови необлученных животных (биологический контроль), подвергнутых термическому действию, искомые антигены во все сроки исследования не обнаружены.

В параллельных пробах в РНГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом (известный способ) пострадиационные антитела начинали обнаруживаться только через 12-14 суток после радиационного воздействия в незначительных титрах. Аналогичные же антитела обнаруживались и у морских свинок, подвергнутых термическому воздействию, что свидетельствует о неспецифичности известного способа и его нечувствительности, ибо регистрация их в РНГА начиналась в более поздние сроки, что не обеспечивает своевременную терапию и профилактику радиационных поражений животных.

Пример 6. Эффективность предлагаемого способа диагностики радиационных поражений млекопитающих и возможность дифференциации летального облучения от сублетального (несмертельного) проверяли на крупных млекопитающих, в качестве которых использовали взрослых овец со средней живой массой 35-38 кг, используя по 3 головы животных на каждый вариант опыта. При этом овец 1-й группы облучали гамма-лучами в летальной дозе (5,0-6,0 Гр), 2-й группы - в сублетальной (несмертельной) дозе (2,5-3,0 Гр), 3-й группы - иммунизировали бактериальной (сибиреязвенной вакциной) (но возможно любой другой), 4-й группы - подвергали термическому воздействию (ожогу), а животных 5-й группы не подвергали никакому воздействию (биологический контроль). У всех овец в динамике брали пробы крови (ежедневно в течение 15 дней после облучения) для серологического анализа в РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом (предполагаемый) и антигенным эритроцитарным диагностикумом (известный). Установили, что как у облученных в летальной (5,0-6,0 Гр), так и в сублетальной (2,5-3,0 Гр) дозах после облучения в сыворотке крови регистрируются радиоиндуцированные антигены в диагностических титрах (1:0 и выше) в РНГА с предлагаемым антительным эритроцитарным диагностикумом (АТЭД), которые удерживаются на высоком уровне (до 1:32) в течение 7-10 суток после облучения. При этом установили, что титры АГ в РНГА у облученных в летальных дозах колебались 1:24-1:32, в то время как титры АГ у облученных в несмертельных дозах не превышали 1:8-1:16. Животные, в сыворотках которых регистрировали АГ в титрах 1: 24-1: 32, погибали от острой лучевой болезни на 18-24 сутки после облучения, а овцы, в сыворотке которых титр АГ не превышал 1:8-1:16 - выживали.

В параллельных опытах с сыворотками необлученных, иммунизированных микробными вакцинами и обожженных животных искомый АГ не обнаруживался. В отличие от предлагаемого, по известному методу ставить диагноз в эти сроки представляется невозможным, ибо на 13-14 сутки после облучения, иммунизации и ожога в сыворотке крови обнаруживались аутоантитела в различных титрах, что свидетельствует о неэффективности, неспецифичности известного теста и запоздалости информации, что недопустимо при диагностике радиационных поражений организма.

Сравнительная характеристика способов диагностики радиационных поражений организма представлена в таблице.

Как видно из данных таблицы, предлагаемый способ позволяет проводить экспресс-диагностику радиационных поражений организма в ранние сроки (через 48-72 часа) после радиационного воздействия и тем самым предпринять экстренные лечебно-профилактические меры.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики и способ получения препарата для его осуществления позволяет экстренно ставить диагноз на лучевую болезнь, определить ее степень, а также прогнозировать ее исход и может быть применен как в ветеринарной, так и в медицинской практике при радиационных поражениях организма млекопитающих. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ диагностики радиационных поражений организма, включающий серологический анализ сыворотки облученных млекопитающих в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и обнаружение в ней иммунных комплексов, отличающийся тем, что серологический анализ сыворотки крови в РНГА проводят с использованием противолучевого антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД), в котором в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные противолучевой сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана и по феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов судят о наличии радиоиндуцированного (лучевого) антигена (РИАГ) в исследуемых сыворотках, по степени гемагглютинации эритроцитов и по титру РИАГ в РНГА ставят диагноз на радиационные поражения, за диагностический титр радиоиндуцированных антигенов в РНГА принимают положительную реакцию в разведениях исследуемых сывороток 1 : 8 и выше со степенью гемагглютинации эритроцитов в 3 - 4 креста, а в качестве дифференциального критерия летального облучения млекопитающих принимают 3 - 4-кратное превышение диагностического титра РИАГ в сыворотке крови в РНГА (1 : 24 - 1 : 32).

2. Способ получения противолучевого антительного эритроцитарного препарата (АТЭД) для диагностики радиационных поражений организма, включающий извлечение из облученных тканей млекопитающих лучевого антигенного материала, гипериммунизацию им кроликов, приготовление адсорбента и очистку им гипериммунных сывороток, сенсибилизацию последними формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, отличающийся тем, что в качестве сенситина для сенсибилизации эритроцитов используют противолучевую гипериммунную сыворотку кроликов, получаемую путем 4-цикличного с интервалом в 4 дня между циклами внутривенного и внутрибрюшинного в дозе по 9 - 10 мг введения извлеченного из печени облученных в дозе 4,0 - 4,5 Гр и убитых через 3 - 4 дня после облучения морских свинок, адсорбированную поэтапно порошками из печени необлученных (1), иммунизированных бактериальными вакцинами (2) и обоженных (3) животных из расчета 10 - 11 мг/мл (1-й адсорбент), 6,0 - 7,0 мг/мл (2-й адсорбент) и 10 - 11 мг/мл (3-й адсорбент) по 15 - 20 мин при 36 - 38oC и постоянном перемешивании с последующим 2-кратным центрифугированием сыворотки при 5929 g в течение 20 - 30 мин, сенсибилизацию эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов разведенной физиологическим раствором (1 : 10) адсорбированной противолучевой сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов с последующим термостатированием смеси в течение 2,5 - 3 ч при 36 - 38oC и центрифугированием эритроцитов при 1000 - 1500 g в течение 10 - 15 мин, осадок после декантирования супернатанта заливают фосфатно-буферным раствором (ФБР) с pH 7,2 с содержанием 0,5% "нормальной" лошадиной сыворотки, повторяют эту операцию (сенсибилизацию) трижды и полученный продукт (противолучевой антительный эритроцитарный диагностикум - АТЭД) консервируют 0,3%-ным фенолом и хранят в холодильнике при 2 - 6oC.