СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АЭРОБНОРАСТУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АЭРОБНОРАСТУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ


RU (11) 2111246 (13) C1

(51) 6 C12N1/20 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1998.05.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 5055992/13 
(22) Дата подачи заявки: 1992.06.03 
(45) Опубликовано: 1998.05.20 
(56) Аналоги изобретения: 1. Шевцов В.В., Самойленко В.А., Краснова С.П., Бирюков С.А. Культивирование Bac. Thuringiensis в периодическом режиме с дробным внесением глюкозы. В кн.: Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов, ч.2. - Киев: Наукова думка, 1981. 2. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т. 2, гл. 9.1.1. - М.: Мир, 1989. 3. Попов Е.И., Амбросов В.А. Применение культивирования с подпиткой субстратом для оптимизации роста E.coli НВ 1100 - продуцента рестриктазы. В кн.: Теория и практика управляемого культивирования микроорганизмов, ч. 2. Киев: Наукова думка, 1981. 4. Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия. - М.: Медицина, 1967. 
(71) Имя заявителя: Дербышев Виктор Викторович; Глухов Николай Николаевич; Клыков Сергей Петрович; Набокова Анна Петровна; Щербаков Григорий Яковлевич 
(73) Имя патентообладателя: Дербышев Виктор Викторович 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ АЭРОБНОРАСТУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ 

Использование: в микробиологической и медицинской промышленности и касается способа получения биомассы аэробно растущих микроорганизмов. Сущность изобретения: способ включает периодическое культивирование и подпитку сбалансированной по основным компонентам питания средой, причем эта подпитка ведется при условиях кислородного лимитирования, достигаемого при массообмене в пределах 0,40 - 1,50 моль О2м-3мин-1, либо путем уменьшения его в последние 3 ч культивирования на 50%, а подпитка ведется концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева по показаниям pO2, pH, или eH при соотношении C: N: P:Mg, равном (7,02,0) : (1,20,5) : (0,50,2) : (0,150,09). 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и может быть использовано для организации высокоэффективных производств биомассы микроорганизмов.

Существующие периодические процессы с добавлением субстрата [1, 2] характеризуются тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации или в анаэробных условиях и дробное введение субстрата. Эти процессы реализуются либо для поддержания физиологических условий культивирования (например, дробное внесение глюкозы или аммиака при поддержании роста и pH), либо для обеспечения сверхсинтеза каких-либо продуктов, но не для значительного увеличения выхода биомассы, так как в этом случае потребуется сбалансированная по основным компонентам среда.

Существующий периодический процесс получения биомассы с подпиткой сбалансированной питательной средой [3], выбранной в качестве прототипа, характеризуется тем, что производятся одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации, регулируемых в таком режиме, чтобы избежать лимитирования кислородом, подпитка выращиваемой культуры сбалансированной питательной средой. Этим достигается увеличение выхода биомассы.

Сопоставление энергетико-конструктивных возможностей на перемешивание показывает, что выходы биомассы могут быть увеличены настолько же, как и в прототипе, но без увеличения массообмена. В этом случае рост культуры клеток лимитируется только кислородом, что в свою очередь позволяет, наряду с урожаем, повысить и устойчивость клеток к неблагоприятным факторам внешней среды, хотя может несколько увеличиться продолжительность культивирования.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы аэробно растущих клеток и повышение их устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям. Эта цель достигается тем, что проводится культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене по кислороду в пределах 0,4 - 1,5 ммоль O2/лмин, или уменьшением его в последние три часа на 50%, подпитка концентрированной средой при соотношении C:N:P:Mg в пределах (72): (1,20,5): (0,50,2): (0,150,09), обеспечивающая конечный расход субстратов в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двукратной от обычной концентрации, если неизвестна ингибирующая.

Таким образом предлагаемый способ при увеличении в несколько раз выхода биомассы микроорганизмов позволяет повысить устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям, не прибегая к увеличению затрат мощности на перемешивание.

Сущность изобретения заключается в том, что с целью повышения урожая биомассы и устойчивости клеток к неблагоприятным внешним воздействиям на стадиях технологической переработки и выживаемости при хранении проводится культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене по кислороду в пределах 0,4 - 1,5 ммоль O2/лмин или уменьшением его в последние три часа на 50%, подпитка концентрированной средой при соотношении C:N:P:Mg в пределах (7 2):(1,2 0,5):(0,5 0,2)::(0,15 0,09), обеспечивающая конечный расход субстратов в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двукратной от обычной концентрации, если неизвестна ингибирующая.

Пример 1. Культивирование Pseudomonas fluorescens.

Pseudomonas fluorescens выращивают на синтетической питательной среде с глюкозой и минеральными веществами при следующем их содержании, кг/м3:

Глюкоза - 25,00

Источник азота (по азоту) - 1,00

Фосфат (по фосфору) - 0,50 кг/м3

Сульфат магния семиводный (по магнию) - 0,06

Урожай биомассы при этом не превышал 50 109 кл/мл живых клеток, время выращивания 24 2 ч, при посевной дозе не ниже 0,1 109 кл/мл, выживаемость клеток в культуральной жидкости, хранящейся при температуре 22oC, через трое суток хранения составляла 7% от исходного числа живых клеток.

При дробном внесении концентрированной среды при соотношении основных компонентов питания 5,0:0,7:0,3:0,06 и массообмене 0,4 ммоль O2/лмин за 32 2 ч. получали культуру с урожаем 70 109 кл/мл, но выживаемость при тех же условиях хранения составила 15%.

При дробном внесении концентрированной питательной среды по показаниям pO2 и pH, сбалансированной по основным компонентам в соотношении 5,0:0,7: 0,3: 0,06 и при использовании массообмена по O2, равного 1,5 ммоль O2/л мин, получали культуру с содержанием 120 109 кл/мл культурной жидкости за 42 2 ч. культивирования, с выживаемостью через трое суток хранения при 22oC 16%. Конечный расход глюкозы 60 кг/м3.

При использовании подпитки, но при соотношении C:N:P:Mg равном 9,0:1,7: 0,7: 0,24 и при уменьшении масообмена 0,75 ммоль O2/лмин на 50% в последние три часа выращивания было получено 15% выживших клеток от исходного 100 109 кл/мл.

Пример 2.

Культивирование Yersinia pestis шт. EV.

Yersinia pestis шт. EV. выращивают на среде, приготовленной на основе солянокислотного гидролиза казеина с аминным азотом 140 мг%, при t = 27oC и дробном внесении глюкозы по pH и pO2 и следующем содержании минеральных компонентов, - кг/м3:

Глюкоза (сумм. расход по углероду) - 5,00

Фосфат (по фосфору) - 0,70

Сульфат магния семиводный (по магнию) - 0,12

Тиосульфат натрия двухводный - 0,60

При этом выход клеток по числу живых не превышал 35109 кл/мл, а время культивирования 28 2 ч. с посевной дозой 0,6 109 кл/мл. После технологических стадий концентрирования и приготовления вакцины потеря по числу живых клеток составила 60% от исходного числа.

При дробном внесении концентрированной питательной среды той же основы, но с содержанием аминного азота 800 мг%, сбалансированной по C: N: P: Mg в соотношении 5,0:0,7:0,3:0,06 и при использовании массообмена 0,75 ммоль O2/л мин. получали культуру с содержанием живых клеток 80109 кл/мл при потерях после технологической обработки, составлявших 30% от исходного числа живых клеток.

При дробном внесении концентрированной питательной среды, но с соотношениями компонентам 9,0: 1,7: 0,7: 0,24 и массообмене 0,75 получали культуры Yersinia pestis шт. EV. с содержанием 75109 кл/мл, а потери при переработке составляли 25% от общего числа живых клеток. Время выращивания составило 44 4 ч.

Анализ получаемых культур циторефрактометрическим методом [4] и с помощью электронной микроскопии показал наличие 93 5% интактных клеток. Суммарная концентрация аминного азота составила 300 мг%, а глюкозы - до 40 кг/м3.

Преимущество данного способа заключается в том, что с его помощью возможно получение культур с повышенной устойчивостью к неблагоприятным внешним воздействиям при концентрациях биомассы в несколько раз больше чем те, которые получаются с использованием традиционных периодических способов.

Пример 3.

Определение ингибирующих концентраций глюкозы и азота для Pseudomonas fluorescens, шт. АТС 13525.

Определены ингибирующие концентрации компонентов среды для глубинного выращивания псевдомонад. Исследования выполнены во встряхиваемых колбах. В среде, состав которой приведен в примере 1 заявки, изменяли концентрацию глюкозы и азота. Для определения ингибирующей концентрации компонентов среды определяли удельную скорость роста () и экономический коэффициент (Y). Ингибирующей называют такую концентрацию компонента, при увеличении которой снижается удельная скорость роста и экономический коэффициент.

Данные табл. 1 и 2 показывают, что рост псевдомонад ингибируется при концентрации глюкозы и азота в среде более 20 кг/м3 и 0,6 кг/м3 соответственно. Фактически концентрации этих компонентов в исходной среде находятся в ингибирующей области. Как видно из примера, при использовании подпитки расход глюкозы увеличен в три раза (до 60 кг/м3) при пропорциональном увеличении выхода клеток и повышении устойчивости.

При дробном внесении концентрированной питательной среды по показаниям pO2 и pH, сбалансированной по основным компонентам C: N: P: Mg в соотношении 7,0: 1,2: 0,5: 0,15 и при использовании массообмена по O2, равного 1,5 ммоль O2/лмин, за 44 ч. получали культуру с содержанием 120109 кл/мл при суммарном расходе глюкозы 60 кг/м3.

Таким образом, использование подпитки позволило увеличить выход клеток пропорционально увеличению расхода глюкозы. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов, включающий периодическое культивирование и подпитку питательной средой, отличающийся тем, что проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене 0,40 - 1,50 моль О2 м-3мин-1 или уменьшением его в последние 3 ч культивирования на 50%, и подпитку концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 2,0) : (1,2 0,5) : (0,5 0,2) : (0,15 0,09), обеспечивающую конечный расход компонентов среды в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двухкратной от обычной концентрации.