КАЛИЕВАЯ СОЛЬ 2-[1-(1,1ДИОКСОТИЕТАНИЛ-3) БЕНЗИМИДАЗОЛИЛ-2- ТИО]-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩАЯ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ

КАЛИЕВАЯ СОЛЬ 2-[1-(1,1ДИОКСОТИЕТАНИЛ-3) БЕНЗИМИДАЗОЛИЛ-2- ТИО]-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩАЯ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ


RU (11) 2115652 (13) C1

(51) 6 C07D409/04 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1998.07.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 96121472/04 
(22) Дата подачи заявки: 1996.11.01 
(45) Опубликовано: 1998.07.20 
(56) Аналоги изобретения: 1. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. - М.: Медицина, 1985, 226 с. 2. Сибиряк С.В., Строкин Ю.В., Садыков Р.Ф., Данилов В.М. Иммунотропная активность производных азолов и их конденсированных гетероциклических систем. - Хим.фарм. ж., 1990, N 11, с.19-20. 3. Georgiev V. Synthetic immunomodukating agents. Med. Res. Rev., 1990, v.10., p. 371-409. Hadden J. Jmmunostimulants. Jmmund. Today. 1993, v. 14., p. 275 - 280. 4. Omura T., Sato R., J. Biol. Chem., 1964, v.239, p.2370-2378. 5. Карузина И.И., Арчаков А.И. Современные методы в биохимии 1977. - М, с.49 - 62. 6. Хим.фарм.ж., - 1993, N 3, c.25-26. 
(71) Имя заявителя: Башкирский государственный медицинский университет 
(72) Имя изобретателя: Катаев В.А.; Сибиряк С.В.; Халиуллин Ф.А.; Садыков Р.Ф.; Волкова С.С.; Строкин Ю.В.; Алехин Е.К. 
(73) Имя патентообладателя: Катаев Валерий Алексеевич 

(54) КАЛИЕВАЯ СОЛЬ 2-[1-(1,1ДИОКСОТИЕТАНИЛ-3) БЕНЗИМИДАЗОЛИЛ-2- ТИО]-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩАЯ ИММУНОТРОПНУЮ АКТИВНОСТЬ 

Изобретение относится к химии, а именно к синтезу биологически активных соединений. Целью изобретения является расширение арсенала средств воздействия на живой организм. Сущность изобретения: новое химическое соединение калиевая соль 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3) бензимидазолил-2-тио-уксусной кислоты (N-гос. регистрации 9393889) формулы (I), которая обладает иммуномодулирующей активностью. 10 табл.

з 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к новому химическому соединению, которое может быть использовано как средство, проявляющее иммунотропную активность.

Известен эталонный синтетический иммуномодулятор азольной структуры левамизол (гидрохлорид 2,3,5,6-тетрагидро-6-имидазо[2,1-b] тиазол), иммунотропная активность которого описана в многочисленных оригинальных и обзорных работах [1-3].

Новое химическое соединение калиевая соль 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио]уксусной кислоты (N госрегистрации 9393889) формулы



обладает большей иммуномодулирующей активностью, нежели левамизол при меньшей в 46,5 раз токсичности.

Заявляемое соединение синтезируют следующим образом.

Кипячением 1-(1,1-диоксотиетанил-3)-2-хлорбензимидазола с тиогликолевой кислотой в этаноле в щелочной среде получают 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио] уксусную кислоту, переходящую при взаимодействии с едким кали в этаноле в целевую соль.

Пример 1. Синтез заявляемого соединения (N госрегистрации 9393889).

Синтез 1-(1,1-диоксотиетанил-3)-2-хлорбензимидазола осуществлен по методике, описанной в [6]. К раствору 1,84 г (20 ммоль) тиогликолевой кислоты в 150 мл этанола добавляют 1,68 г (30 ммоль) едкого кали в 10 мл воды и 2,57 г (10 ммоль) 1-(1,1-диоксотиетанил-3)-2-хлорбензимилдаэола. Смесь кипятят в течение 5 ч, охлаждают до 5 - 10oC. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в воде, нерастворимые примеси отфильтровывают, к фильтрату добавляют раствор разведенной уксусной кислоты до слабокислой реакции среды. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Получают 2,71 г (87%) 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимида-золил-2-тио]уксусную кислоту, кристаллизуют из этанола.

ИК спектр, см-1 (вазелиновое масло): 3400 (OH), 1700(C=O), 1150 и 1310 (SO2), 750-770(CH аром.)

Элементный анализ.

Найдено,%: C 46,3 H 4,1 N 8,8 S 20,35 - C12H12N2O4S2.

Вычислено,%: C 46,1 H 3,9 N 9,0 S 20,2.

К раствору 3,12 г (10 ммоль) 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2- тио] уксусной кислоты в 200 мл этанола добавляют 0,67 г (12 ммоль) едкого кали. Смесь кипятят в течение 45 мин. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают этанолом, сушат. Получают 3,23 г (92%) калиевой соли 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3)бензимидазолил-2-тио]-уксусной кислоты.

Спектр ЯМР 1H (D2O), м. д. : 3,77 (с, SCH2); 4,55-4,74 (м, S(CH2)2); 5,42-5,56 (м, NCH); 6,86-7,02 (м, 2 CH аром.); 7,22-7,44 (м, 2 CH аром).

Спектр ЯМР 13C (D2O), м.д.: 38,24 (NCH); 40,69 (SCH2); 72,04 (S(CH2)2); 112,56 (C аром); 120,41 (C аром); 125,24 (C аром); 125,38 (C аром); 135,03 (C аром); 144,88 (C аром); 154,96 (C аром); 176б86 (CO).

Элементный анализ.

Найдено,%: C 41,3 H 3,4 N 7,8 S 18,5 - C12H11KN2O4S2.

Вычислено,%: C 41,1 H 3,2 N 8,0 S 18,3.

Заявляемое соединение представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде, горячем этаноле, нерастворимый в ацетоне, эфире.

Пример 2. Влияние заявляемого соединения N 9393889 и левамизола на противоинфекционную резистентность изучали на модели летальной синегнойной инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением суточной культуры синегнойной палочки. Возбудитель вводили в дозах 1,25-2,0 от DL50, что составило 40 - 90 млн. микробных тел на мышь.

Заявляемое соединение вводили в мышцу, используя профилактическую интермиттирующую схему введения (последнее введение за сутки до инокуляции возбудителя) в дозе, равной 1/10 от DL50. Левамизол вводили в аналогичном режиме и в эквитоксических дозах. Результаты иллюстрирует табл. 1.

Выживаемость оценивалась по критерию X2, средняя продолжительность жизни - по критерию Стьюдента. Разница считалась существенной при P< 0,05.

Таким образом, заявляемое соединение N 9393889 стимулировало неспецифическую антиинфекционную резистентность. При введении умеренной дозы возбудителя (1,25 от DL50) соединение незначительно превосходил по эффекту левамизол. В "жестких" условиях течения инфекционно-токсического процесса (введение 2,0 DL50 возбудителя) соединение N 9393889 обеспечивало статистически значимую защиту, левамизол был неэффективен.

Пример 3. Оценка влияния заявляемого соединения N 9393889 в сравнении с левамизолом на рост привитых опухолей у мышей проводилась на модели привитой саркомы S-180 (неинбредные мыши-самцы) и меланомы B-16 (мыши-самцы линии C57BL/6). Опухолевые штаммы получены из банка ВОНЦ РАМН. Имплантация опухолевого материала и оценка динамики опухолевого роста проводилась по стандартному методу. Изучаемое соединение N 9393889 и левамизол вводили в дозах 1/20 от DL50 внутрибрюшинно с +1 дня после имплантации опухолевого материала по интермиттирующей схеме - 1 раз в 3 дня. Результаты иллюстрирует табл. 2.

Заявляемое соединение N 9393889 по способности подавлять рост привитой саркомы S-180 и меланомы B-16 превосходило по активности левамизол. На модели привитой саркомы S-180 соединение N 9393889 превосходило левамизол в 2,1 раза. На модели привитой меланомы B-16 соединение N 9393889 превосходило левамизол в 1,3 раза.

Пример 4. Оценку влияния заявляемого соединения N 9393889 и левамизола на течение экспериментального аутоиммунного процесса производили на модели экспериментальной аутоиммунной гемолитической анемии (ЭГА), вызванной у мышей-самок линии С3Н еженедельной (в течение 3-х недель) внутрибрюшинной сенсибилизацией ксеногенными эритроцитами в дозе 2108 эритроцитов на мышь. В качестве донора эритроцитов использовались крысы линии Wistar. Оценку тяжести процесса осуществляли на 4-й неделе от начала курса иммунизации путем определения уровня гемоглобина стандартным методом. Заявляемое соединение N 9393889 и левамизол вводили в мышцу в дозе 1/10 от DL50 с +1-го дня после иммунизации по интермиттирующей схеме - 1 раз в три дня. Всего животные получали 7 инъекций соединения или левамизола. Результаты иллюстрирует табл.3.

Таким образом заявляемое соединение N 9393889 восстанавливало уровень гемоглобина у сенсибилизированных ксеногенными эритроцитами мышей, что свидетельствует о подавлении формирования ЭГА. Левамизол в условиях данной модели не проявлял активности.

Пример 5. Влияние заявляемого соединения N 9393889 и левамизола на формирование трансплантационного иммунитета изучали на модели аллотрансплантации кожного лоскута в гистонесовместимой системе мыши линии C57BL/6 (донор) - мыши линии CBA (реципиент). Пересадку кожного лоскута осуществляли общепринятым методом. Заявляемое соединение N 9393889 и левамизол вводили в эквитоксических дозах (1/10 от DL50) в мышцу ежедневно с +1 дня после аллотрансплантации. Учитывали средний день отторжения трансплантата, исключая животных, у которых отторжение произошло в первые 3 дня (неиммунологические механизмы). Результаты иллюстрирует табл. 4.

Таким образом заявляемое соединение статистически значимо увеличивало продолжительность жизни кожного аллотрансплантата, превосходя по эффективности левамизол в 1,4 раза.

Пример 6. Оценку влияния заявляемого соединения N 9393889 и левамизола на гуморальный иммунный ответ к тимусзависимому антигену - эритроцитам барана - производили определяя количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей на +5 сутки после внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана. Число АОК определяли слайд-методом (Cunnengham A. et al., 1966). Для оценки активности регуляторных клеток иммунизацию производили иммуногенной дозой эритроцитов (2108/мышь) и толерогенными дозами: гипериммунной (2109/мышь) и субоптимальной (2107/мышь). Исследуемые соединения и левамизол вводили внутрибрюшинно в эквитоксических дозах, равных 1/20 от DL50 на +1 и +4 сутки после иммунизации. Результаты иллюстрирует табл. 5.

Таким образом, при иммунизации иммуногенной дозой антигена заявляемое соединение N 9393889 угнетало гуморальный ответ; левамизол был неэффективен. На фоне индукции высокозонной толерантности гипериммунной дозой антигена заявляемое соединение, и в меньшей степени левамизол, увеличивали интенсивность гуморального ответа. На фоне субоптимальной дозы антигена заявляемое соединение N 9393889 наиболее эффективно восстанавливало иммунореактивность. Левамизол был неактивен.

Пример 7. Влияние изучаемого соединения и левамизола на формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) изучали на модели формирования ГЗТ, вызванной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ). Животных сенсибилизировали путем двукратной аппликации (0 и +1 день) 25 мкл 0,5%-ного раствора ДНФБ (Serva) в ацетон-оливковом масле (4:1) на эпилированную поверхность живота площадью 3 см2. Спустя 4 дня после последней сенсибилизации на дорсальную поверхность ушей наносилась разрешающая доза ДНФБ (0,2%-ный раствор, 25 мкл). Через 24 ч толщину ушей измеряли инженерным микрометром МК-0-25 и результат выражали как прирост толщины ушей в сравнении с исходной, %. Состояние высокозонной толерантности создавали гипериммунной дозой ДНФБ, составляющей 150 мкл 0,5%-ного раствора. Эксперименты проведены на мышах-самцах линии BALB/C. Изучаемое соединение и левамизол вводили в эквитоксических дозах (1/20 от DL50) внутрибрюшинно в день первой сенсибилизации и спустя два дня. Результаты иллюстрирует табл. 6.

Таким образом заявляемое соединение N 9393889 по способности угнетать формирование ГЗТ на фоне иммуногенной дозы антигена превосходило левамизол в 1,5 раз. По способности восстанавливать реактивность при сенсибилизации гипериммунной дозой ДНФБ заявляемое соединение превосходило левамизол в 1,2 раза.

Пример 8. Влияние заявляемого соединения N 9393889 и левамизола на поглотительную активность макрофагов оценивалось в тесте клиренса внутривенно введенного коллоидного угля. Эксперименты проведены на неинбредных мышах-самцах массой 18 - 20 г. Изучаемые соединения и левамизол вводили ежедневно, внутрибрюшинно в эквитоксических дозах (1/20 от DL50) в течение 4-х дней и спустя сутки после последнего введения проводили оценку поглотительной активности ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) путем внутривенного введения коллоидного угля (160 мг/кг) и определения скорости элиминации угля из крови спектрофотометрически. Результаты приведены в табл. 7.

Изученное соединение и левамизол повышали поглотительную активность РЭС, что свидетельствует об активирующем влиянии на макрофаги и согласуется с влиянием на антиинфекционную резистентность. Наиболее эффективно было заявляемое соединение N 9393889, которое превосходило левамизол в 1,13 раз.

Пример 9. Влияние соединения 9393889 и левамизола на продукцию цитокинов изучено в культуре мононуклеаров периферической крови здоровых доноров. Мононуклеары выделяли из крови методом градиентного центрифугирования, трижды отмывали средой 199 и культивировали 24 ч в среде 199 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. В опытные культуры добавляли 100 мкл разведенных физиологическим раствором исследуемых соединений в эквимолярной концентрации - 10-4М (конечная концентрация) в контрольные культуры - эквивалентное количество физиологического раствора. Через 24 ч в супернатантах культур в твердофазном иммуноферментном анализе определяли уровень интерлейкина -1b и интерферона- , используя готовые ИФА тест-системы ProCon-IL1b и ProConIFN-plus (НИИ ОЧП, С.-Пб.). Результаты представлены в табл. 8.

Левамизол вызывал тенденцию к усилению выработки интерлейкина-1b (разница статистически незначима) и усиливал продукцию интерферона- . Соединение N9393889, использованное в эквимолярной концентрации, статистически значимо увеличивало продукцию интерлейкина-1b, превосходя левамизол в 1,2 раза и усиливало выработку интерферона, превосходя по активности левамизол в 1,8 раз.

Пример 10. Влияние соединения N 9393889 на активность микросомальных ферментов печени изучено на белых неинбредных мышах самцах массой 18-20 г. Соединение N 9393889 вводили ежедневно внутрь в течение 7-ми суток в дозе 1/100 от DL50 (при введении внутрь), что составило 64 мг/кг. Левамизол вводили в эквитоксической дозе - 2,5 мг/кг в аналогичном режиме введения.

Спустя сутки после последнего введения животных забивали, выделяли микросомальную фракцию печени стандартным методом путем дифференциального центрифугирования и определяли уровень цитохромов P-450, b5 [4], амидопирин-N-деметилазную и анилин-p-гидроксилазную активность [5]. Уровень белка в микросомальной фракции определяли по методу Лоури. Результаты представлены в табл. 9.

Соединение N 9393889 в использованном режиме введения увеличивало уровень цитохрома P-450 в печени на 39%, уровень цитохрома b5 оставался практически неизменным, активность аминопирин-N-деметилазы увеличивалась на 31%, p-гидроксилазы анилина - на 40%, стимулируя, таким образом, метаболическую и антитоксическую функцию печени. Левамизол в аналогичном режиме введения и эквитоксической дозе был неэффективен.

Пример 11. Острая токсичность заявляемого соединения изучена на неинбредных мышах-самцах массой 14-16 г по методу Литчфилда и Уилкоксона при внутрибрюшинном введении. Результаты иллюстрирует табл. 10.

Таким образом острая токсичность заявляемого соединения в 46,5 раз ниже токсичности левамизола.

Таким образом, заявляемое соединение N 9393889 проявляло отчетливую иммунотропную активность, превосходя по эффективности "эталонный" азольный иммуномодулятор левамизол. Заявляемое соединение характеризовалось как наименее токсичное. При изучении иммунотропной активности установлено, что на модели летальной инфекции (пример 2) в условиях введения 1,25 ЛД50 инфекционного агента активность заявляемого соединения незначительно превосходит активность левамизола. Однако в условиях введения 2,0 ЛД50 возбудителя заявляемое соединение проявляет активность, а левамизол в данных условиях - неэффективен. Иммунотропная активность заявляемого соединения N 9393889 на модели привитой саркомы S-180 (пример 3) превосходит активность левамизола в 2,1 раза (табл. 2). На модели меланомы B-16 соединение N 9393889 превосходит активность левамизола в 1,3 раза.

На модели аутоиммунной гемолитической анемии активность заявляемого соединения N 9393889 превосходит левамизол в 1,2 раза (табл. 4). Заявляемое соединение обеспечивает статистически значимое подавление трансплантационного иммунитета (табл. 3), превосходя по активности левамизол в 1,4 раза.

Заявляемое соединение N 9393889 на модели гуморального иммунного ответа (пример 6) на фоне иммунизации оптимальной дозой антигена угнетает антителообразование и превосходит левамизол в 2,6 раз.

На фоне иммунизации "гипериммунной" дозой антигена активность заявляемого соединения аналогична таковой у левамизола. На фоне иммунизации субоптимальной дозой антигена заявляемое соединение N 9393889 повышало иммунореактивность. Левамизол в этих условиях - неэффективен.

На модели контактной гиперчувствительности замедленного типа (пример 7) на фоне сенсибилизации иммуногенной дозой в угнетало формирование реакции в 1,5 сильнее левамизола.

На фоне сенсибилизации "гипериммунной дозой" заявляемое соединение по способности восстанавливать иммунореактивность превосходило левамизол в 1,3 раза.

При оценке влияния соединений на активность макрофагов выявлено, что заявляемое соединение обладает выраженной иммунотропной активностью и увеличивает поглотительную активность макрофагов в 1,13 сильнее левамизола (пример 8). В системе in vitro (пример 9) соединение N 9393889 по способности усиливать выработку интерлейкина-1 превосходило левамизол в 1,2 раза, а по интерфероногенной активности превосходило левамизол в 1,8 раз. Интерфероногенный эффект является ценной составляющей иммунотропной активности.

Соединение N 9393889 обладает способностью усиливать метаболическую функцию печени - увеличивает уровень микросомального белка N-деметилазную и p-гидроксилазную активности (пример 10). Левамизол в эквитоксической дозе был неэффективен. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Калиевая соль 2-[1-(1,1-диоксотиетанил-3) бензимидазолил-2-тио]-уксусной формулы



проявляющая иммунотропную активность.