ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕГОЧНО-ПОВЕРХНОСТНО АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ

ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕГОЧНО-ПОВЕРХНОСТНО АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ


RU (11) 2145611 (13) C1

(51) 7 C07K14/785, A61K38/17 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 15.02.2008 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 96124768/04 
(22) Дата подачи заявки: 1995.05.27 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1995.05.27 
(31) Номер конвенционной заявки: P 4418936.2 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1994.05.31 
(33) Страна приоритета: DE 
(45) Опубликовано: 2000.02.20 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: SU 1356431 А, 1987. US 5407914 А, 18.04.95. EP 0368823 А, 1990. WO 89/04326 А, 1989. WO 91/180015 А, 1991. WO 93/21225 А, 1993. 
(71) Заявитель(и): Бык Гульден Ломберг Хемише Фабрик ГмбХ (DE) 
(72) Автор(ы): Клаус П.Шэфер (DE); Клаус Мельхерс (DE); Рюдигер Наве (DE); Вольф-Рюдигер Ульрих (DE); Эрнст Штурм (DE); Уве Крюгер (DE); Дитрих Хэфнер (DE) 
(73) Патентообладатель(и): Бык Гульден Ломберг Хемише Фабрик ГмбХ (DE) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 1996.12.31 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: EP 95/02028 (27.05.1995) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 95/32992 (07.12.1995) 
Адрес для переписки: 101000, Москва, Малый Златоустинский пер., д.10, кв.15, ЕВРОМАРКПАТ, Веселицкой И.А. 

(54) ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ЛЕГОЧНО-ПОВЕРХНОСТНО АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ 

Описываются полипептиды формулы (I)



где А - Н или Phe; B - Phe или Trp и С - Ile, Leu или Ser, которые обладают активностью легочного поверхностно-активного вещества, которые получают с высоким выходом и высокой степенью чистоты и которые по своей эффективности не уступают природным легочным поверхностно-активным веществам. Они пригодны для получения фармацевтических композиций для лечения синдрома удушья новорожденных и взрослых. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям.

Легкие всех позвоночных животных содержат смесь веществ, называемую как "легочное поверхностно-активное вещество". Она проявляет поверхностно-активные свойства и настолько понижает поверхностное натяжение в альвеолярной области легких, что предотвращается коллапс конечных участков дыхательных путей при выдохе. Эта смесь веществ регулирует поверхностное натяжение динамическим образом, так что ожидаемый согласно закону Лапласа коллапс мелких альвеол в пользу более крупных благодаря соответствующей адаптации поверхностного натяжения не происходит. В результате этого образуется хорошо сбалансированная, гистологически и физиологически стабильная структура легких.

Легочное поверхностно-активное вещество выделяется альвеолярными пневмоцитами типа II в виде пластинчатых телец. Они представляют собой компактные образования из фосфолипидных двойных слоев с высоким содержанием дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и фосфатидилглицерина (ФГ). Другими основными компонентами, содержащимися в легочных поверхностно-активных веществах, являются протеины, которые обозначаются как SP-A, SP-B и SP-C. SP-A представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, играющий основную роль в регуляции секреции.

Протеины SP-C и в меньшей степени SP-B выполняют функцию "термодинамических катализаторов" при формировании мономолекулярной поверхностной пленки (в более узком смысле - поверхностно-активного вещества). Благодаря наличию этих протеинов кинетика расширения чрезвычайно ускоряется. Только вследствие этого без задержек возможна адаптация состава поверхностно-активного вещества к соответствующим требованиям поверхностного натяжения. Эти свойства отражаются в крайне гидрофобном характере протеинов, в частности SP-C.

Путем экстракции легочной ткани или промывки легких животных можно получить препараты поверхностно-активного вещества, которые как в физико-химической измерительной аппаратуре, например, на животных моделях, так и при клиническом применении проявляют способность компенсировать недостаток поверхностно-активного вещества и тем самым пригодны, например, для терапии детского синдрома удушья (респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН)). Однако этим препаратам, полученным из животных, присущи серьезные недостатки.

Состав фосфолипидов сильно зависит от вида животного, его здоровья и состояния питания и может быть лишь в ограниченной степени сбалансирован примешиванием определенных компонентов. Содержание поверхностно-активных протеинов, а также соотношение SP-B/SP-C подвержено тем же неопределенностям. Кроме того, в терапевтически применяемой смеси также содержатся возможные продукты протеолитического разложения протеинов или модифицированные производные (например, в результате окисления метионина). При продолжительном применении или аппликации больших количеств поверхностно-активного вещества, что может быть необходимо, например, при синдроме удушья у взрослых (шоковые легкие, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ)) или в других случаях применения, например, при использовании поверхностно-активного вещества в качестве "буксира" для других веществ при легочной аппликации, вопрос, связанный с пополнением вещества, остается открытым.

Поэтому эти проблемы предлагается решать путем получения протеинов методами генной инженерии. Так как рекомбинантные протеины, в частности при применении бактериальных систем экспрессии, могут быть получены практически в неограниченных количествах, и существует возможность применения современных методов анализа и контроля качества, то, используя синтетические фосфолипиды, можно получить поверхностно-активное вещество точно определенного состава. Это вещество может оптимально удовлетворять терапевтическим требованиям.

Центральная часть человеческого протеина SP-C (см. формулу I, где A - H или Phe; B - Cys; C - Met), который особенно важен для кинетики расширения, состоит исключительно из алифатических, очень гидрофобных аминокислот, таких как валин, лейцин и изолейцин. Длина этой центральной части (аминокислоты 12-34) позволяет интегрировать пептид в мономолекулярную фосфолипидную пленку. В последовательности Pro-Cys-Cys-Pro (позиция 3-6) оба Cys-остатка тиоэтерифицированы пальмитиновой кислотой по SH-группам. Пальмитиновая кислота дополнительно повышает гидрофобный характер всего протеина и одновременно закрывает обе SH-группы цистеинов и защищает их от окисления и образования дисульфидного мостика. Центральная область (аминокислоты 13-34) образует трансмембранную пространственную спираль. Эта область примыкает к N-концу с помощью полярной последовательности, содержащей положительно заряженные аминокислоты (Lys, 10: Arg, 11).

В международной заявке WO 91/18015 описывается получение рекомбинантного SP-C и мутантов SP-C. В этой заявке, помимо прочего, предлагается заменить оба цистеина в положениях 4 и 5 двумя серинами. Преимущество этого при получении состоит в том, что после выделения очень гидрофобного протеина отпадает необходимость в технически трудоемком пальмитоилировании обоих цистеинов.

Описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что SP-C-мутанты, отличающиеся от человеческого белка SP-C заменой обоих цистеинов в положениях 4 и 5 фенилаланином или триптофаном и заменой метионина в положении 32 изолейцином, лейцином или серином, не обладают никакими функциональными потерями в сравнении с природным SP-C, а в отношении стабильности даже превосходят его. При этом значительно упрощается получение с использованием методов генной инженерии с достижением более высокого выхода. Новые полипептиды с легочной поверхностной активностью могут быть получены с высокой чистотой.

Предметом изобретения являются поэтому полипептиды с легочной поверхностной активностью, имеющие аминокислотную последовательность общей формулы I



где A - H или Phe;

B - Phe или Trp и

C - Ile, Leu или Ser.

Предпочтительным предметом изобретения являются полипептиды общей формулы I, где A обозначает H или Phe, B обозначает Phe и C обозначает Ile, при этом наиболее предпочтительно A обозначает H, B обозначает Phe и C обозначает Ile.

Еще одним предметом изобретения являются фармацевтические композиции, которые отличаются тем, что содержат один или несколько полипептидов по изобретению и при необходимости дополнительно содержат один или несколько легочных поверхностно-активных полипептидов из группы SP-A и SP-B, предпочтительно SP-B.

Полипептиды по изобретению могут быть получены либо по известным методам твердофазного пептидного синтеза, либо с помощью соответствующих рекомбинантных векторов в клетках-хозяевах. Методы конструирования векторов, методы трансформирования клеток, методы, вызывающие экспрессию протеина в трансформированных клетках, и методы выделения и очистки экспрессированных протеинов известны специалистам в данной области техники (см. , например, WO 86/03408, WO 87/06588 и WO 91/18015). При получении векторов для экспрессии SP-С в бактериальных системах используют обычные методы рекомбинантной ДНК.

Экспрессия гидрофобного SP-С-протеина в бактериях возможна в большом количестве и без ущерба для клетки-хозяева только в форме пригодных слитых протеинов, как, например, совместно с хлорамфениколацетилтрансферазой (CAT). Например, вектор pTrpAmpCAT152 кодирует N-терминальную область CAT и предназначен для клонирования "внутри рамки считывания" (5'-)EcoRI- и (3'-)PstI-фрагментов ДНК, кодирующих SP-C. CAT и SP-C связываются при этом на белковом уровне друг с другом через чувствительное к гидроксиламину место слияния (AsN Cly). Такие векторы, как pTrpAmpCAT152::SPC, позволяют осуществлять контролируемую экспрессию соответствующих слитых протеинов вплоть до производственного масштаба (ферментация). Экспрессия слитых белков вызывает образование телец включения в клетке-хозяине. При этом длина доли CAT в слитом протеине может быть изменена таким образом, что будут достигнуты высокие выходы телец включения при высокой доли SP-C.

Помимо бактерий экспрессия может происходить и в большом количестве систем-хозяевах, например в клетках млекопитающих, дрожжей и насекомых. Пригодные для различных клеток-хозяев конструкции ДНК синтезируют по известным методам и встраивают обычным образом с соответствующими управляющими последовательностями в геном клеток-хозяев.

На синтезаторе ДНК MilliGen/Biosearch Cyclone обычным фосфоамидитным методом могут быть синтезированы два олигонуклеотида ДНК.

Первый олигонуклеотид ДНК образует кодирующую (нетранскрибируемую) нить ДНК длиной 118 нуклеотидов. Эта нить кодирует (в направлении 5'--->3') специфический в отношении EcoRI 5'-конец для последующего субклонирования, место расщепления Asn/Gly гидроксиламином и человеческий SP-C, начиная с Gly-25 и кончая Leu-58 SP-C-последовательности-предшественика, т.е. Gly-1, соответственно Leu-34 в формуле I. При этом известная аминокислотная последовательность человеческого SP-C-протеина по правилам генетического кода переводится в ДНК. Однако последовательность модифицируется таким образом, что оба цистеина в положениях 28 и 29 SP-C-последовательности-предшественника заменяются фенилаланином или триптофаном, а метионин в положении 56 последовательности-предшественника заменяется изолейцином, лейцином или серином. Таким же образом дополнительно могут быть учтены частоты использования кодона клетки-хозяина. Измененная SP-C-последовательность, содержащая в положениях 4 и 5 фенилаланин и в положении 32 изолейцин (нумерация согласно формуле I), обозначается в соответствии с обычным однобуквенным кодом для этих обеих аминокислот как SPC34(FF/I). Далее смыловая нить ДНК содержит терминирующий TAA-кодон для прерывания рибосомной трансляции, а также специфический в отношении PstI 3'-конец. Второй олигонуклеотид ДНК представляет собой комплементарную, некодирующую (антисмысловую) нить, состоящую из 110 нуклеотидов.

Синтетически полученный SP-C-фрагмент ДНК клонируют в пригодный вектор экспрессии, как, например, pTrpAmpCAT152. Этот вектор составлен из pKK233 (фирма Pharmacia), содержащего ген устойчивости к ампициллину и являющегося производным pBR322. Trc-промотор может быть заменен на Trc-промотор, как в pTrpAmpCFT152. Могут быть использованы также и другие индуцируемые промоторы.

Для субклонирования SP-C-фрагмента комплементарные олигонуклеотиды ДНК сначала гибридизируют друг с другом. Получающаяся в результате двойная нить ДНК имеет выступающие однонитевые концы (EcoRI/PstI).

Встраивание в векторную ДНК осуществляется обычным путем после расщепления векторной ДНК с помощью EcoRI/PstI, очистки требуемых фрагментов векторной ДНК посредством элктрофореза в агарозном геле и гибридизации SP-C-ДНК и векторных фрагментов по сцепленным концам. Затем оба фрагмента по известным методам связывают друг с другом путем лигирования.

Для амплификации ДНК и выделения плазмид производят трансформацию по обычным протоколам, например, в кальцийхлорид-компетентные клетки MM294 E.coli и для селекции несущих плазмиду клеток покрывают на LB-агаровых пластинках ампициллином. Из полученных устойчивых к ампициллину (Amp-резистентных) колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью соответствующих комбинаций рестрикционного фермента. Выбирают клоны с ожидаемой рестрикционной картой ДНК. Путем полного секвенирования плазмидной последовательности подтверждается правильно осуществленная инсерция последовательности SPC34(FF/I).

Полученные таким образом плазмидные векторы позволяют осуществлять экспрессию слитого протеина CAT::SPC под контролем Trp-промотора (или других промоторов). Рекомбинантный слитой протеин выпадает в клетках-хозяевах после индукции в форме телец включения.

Слитой протеин CAT152: : SPC34(FF/I) имеет следующую, представленную обычным однобуквенным кодом аминокислотную последовательность:



34 аминокислоты SP-C(FF/I) в положениях 153-186 слитого протеина выделены подчеркиванием и указанием положений 1-34.

Последующее расщепление гидроксиламином для разделения CAT и SP-C происходит между Asn-152 и Gly-153 (соответствует 1-й аминокислоте в SP-C-пептиде). Выделение и очистка SP-C-пептида осуществляется по обычным в химии белка методам.

Полипептиды по изобретению можно применять отдельно или в комбинации в фармацевтических композициях, которые удовлетворяют требованиям лечения дыхательных путей. Эти композиции пригодны не только для лечения синдрома удушья у недоношенных новорожденных и у взрослых, но также и для лечения пневмонии и бронхита. Кроме того, полипептиды по изобретению пригодны в качестве "буксира" для лекарственных веществ, вводимых путем ингаляции.

Наряду с полипептидами композиции содержат фосфолипиды, предпочтительно такие фосфолипиды, которые содержатся в природных составах, обладающих легочной поверхностной активностью, как, например, предпочтительно дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ФОФГ) и/или фосфатидилглицерин (ФГ). Для достижения оптималной вязкости композиции содержат ионы кальция или магния, а также хлорид натрия. Для определения вида и количества отдельных компонентов композиций специалист может ориентироваться, во-первых, на известный состав природного легочного поверхностно-активного вещества, а во-вторых, на многочисленные предложения, известные из уровня техники, например из европейских патентых заявок EP-A 0119056 и EP-A 0406732.

Предпочтительные композиции по изобретению содержат 80 - 95 мас.% фосфолипидов, 0,5 - 3,0 мас.% полипептидов, 4 - 7 мас.% жирной кислоты, предпочтительно пальмитиновой кислоты, и 1 - 3 мас.% хлорида кальция.

Пример получения

1. Штамм-продуцент

Применяемый штамм-продуцент E. coli 199 имеет происхождение из штамма MM294 E.coli K12, который депонирован под N 5208 в "Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ" (DSM, Брауншвейг).

Вектор экспрессии pTrpAmpCAT152: : SPC34(FF/I), содержащий ген слитого протеина CAT152::SPC34(FF/I), был получен из ДНК-последовательности pBR322, т. е. ColEI-производного [E. Weber (ред.), (1988), Biologische Sicherheit, Bundesministerium fur Forschung und Technologie, Bonn]. В плазмиде pKK233-2, поставляемой фирмой Pharmacia, с помощью EcoRI/HindIII был вырезан Trc-промотор и заменен синтетическим Trp-промотором (pTrp233). Последний состоит из промоторной области (участок связывания РНК-полимеразы), операторной области (участок связывания Trp-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (S/D-последовательности), а также сайтов рестрикции для клонирования. За Trp-промотором был вставлен ген (CAT152), кодирующий 152 аминокислоты 5'-части бактериальной хлорамфеникол-ацетил-трансферазы. С частью CAT152 ДНК-последовательности был слит синтетический фрагмент гена, кодирующий 34 аминокислоты подобного человеческому протеина SP-C(FF/I). Функциональный транскриптон CAT: : SPC(FF/I) заканчивается бактериальной rrnB-последовательностью T1T2, терминирующей транскрипцию. Полученная конструкция обозначается как pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I).

Вектор pTrpAmpCAT::SPC(FF/I) имеет следующие функциональные элементы:

- ген CAT152::SPC34(FF/I), управляемый Trp-промотором и T1T2- терминатором транскрипции;

- ori-область и соседние области, которые управляют числом копий плазмиды;

- ген Amp.

После помещения плазмиды в клетку-хозяина последняя имеет высокое число копий гена CAT::SPC(FF/I), контролируемого Trp-промотором. Trp-репрессор вырабатывает сама клетка-хозяин.

Ферментативное получение rCAT::SPC регулируется концентрацией триптофана в среде, соответственно добавлением - IAA ( - индолилакриловой кислоты).

2. Периодическая ферментация

С помощью пробирки Working Cell Bank (культура глицерина) культуральную среду (состав см. ниже) высевают в шейкер (предварительная или начальная культура 1 л) и при 37oC инкубируют при встряхивании и при сильной ампициллинзависимой селекции. За ростом следят по оптической плотности при 578 нм. По достижении начальной культурой E.coli 199 оптической плотности более 3 культуру высевают в 10-литровый ферментер и продолжают выращивание бактерий при уменьшенной ампициллинзависимой селекции. После достижения значения оптической плотности между 5 и 6 10-литровую культуру переносят в 100-литровый ферментер и продолжают инкубировать в тех же условиях. После достаточного роста путем добавления, например, 40 мг/л - IAA индуцируют управляемый Trp-промотором транскриптон CAT: : SPC(FF/I). После индукции для сбора клеток ферментацию продолжают дополнительно в течение 4-5 ч.

Во время ферментации напрямую контролируют и регулируют парциальное давление кислорода (pO2), значение pH и температуру бульона в ферментере. Значение pH поддерживают постоянным с помощью раствора едкого натра, парциальное давление кислорода (pO2) регулируют путем введения кислорода и с помощью числа оборотов мешалки. Оптическую плотность при 578 нм и концентрацию источника C в среде определяют через определенные интервалы. Пенообразование контролируют с помощью пенного датчика, с помощью которого при необходимости определенными дозами добавляют антивспениватель для подавления пенообразования.

В различные моменты времени отбирают аликвоты культурального бульона. После лизиса бактерий протеины E.coli для контроля экспрессии разделяют на полиакриламидном геле и подкрашивают. Процентную долю (доминантных) протеинов во всем протеине E.coli определяют с помощью денситометра. Вскоре после индукции рекомбинантного гена появляется новая доминантная протеиновая полоса (rCAT::SPC).

Культуральная среда имеет следующий состав.

Соевый пептон 27,0 г/л, дрожжевой аутолизат KAV 14 г/л, NaCl 5,0 г/л, K2HPO43H2O 6,0 г/л, KH2PO4 3,0 г/л, MgSO47H2O 0,5 г/л, глицерин (99,5%-ный) 30,0 г/л, антивспениватель J673 (фирма Structol Comp.) 0,2 мл/л, L-триптофан 80,0 мг/л и ампициллин 20 мг/л для 1-й предварительной культуры и 5 мг/л для 2-й предварительной культуры и 100-литрового ферментера.

Перед нагреванием в автоклаве и стерилизацией комплексной питательной среды pH с помощью 2Н NaOH устанавливают на 6,8. Для предварительной культуры в 10-литровом ферментере скорость мешалки составляет 750 об/мин, а расход кислорода составляет 10 л/мин при 37oC, для главной культуры в 100-литровом ферментере скорость мешалки составляет 400 об/мин, а расход кислорода составляет 70 л/мин при 37oC. Антивспениватель при необходимости добавляют одноразовым шприцем через перегородку.

Приблизительно через 4 ч после индукции клетки отделяют от культурального бульона фильтрацией и/или центрифугированием. Влажную клеточную массу собирают в емкости из нержавеющей стали и в течение ночи перемешивают с 10 л переваривающего буфера (pH 8,0) в холодильнике (16 часов, 4oC). Перемешанную клеточную суспензию обрабатывают (при комнатной температуре) в гомогенизаторе высокого давления (700 бар) и снова собирают в стерильную емкость из нержавеющей стали. Затем сразу же путем фильтрации и/или центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 27000g) при 4oC собирают тельца включения, ресуспендируют в буфере (около 1 л) и порциями, например, приблизительно по 350 мл, переносят в 1-литровую круглодонную колбу и лиофилизуют в течение 96 ч. Из 100-литровой ферментационной загрузки получают приблизительно 200 г сухих телец включения с содержанием слитых протеинов более 20 мас.%. Лиофилизованные тельца включения могут храниться при -20oC месяцами.

3. Расщепление слитого протеина и очистка липофильного пептида SP-C(FF/I)

100 г Сухих телец включения растворяют при легком нагревании в 1,6 л 8-молярного раствора гидрохлорида гуанидина (917,1 г). Нерастворившийся остаток отфильтровывают через складчатый фильтр. Для расщепления слитого протеина по месту связывания Asn-Gly к раствору добавляют 167 г гидроксиаммонийхлорида и pH раствора доводят 2Н NaOH до 9,6. Расщепляющий раствор затем оставляют стоять на 3-4 дня при комнатной температуре при перемешивании. По завершении реакции добавлением 6,4 л трис-буфера (pH 8,0) осаждают SP-C(FF/I) и его отделяют с помощью центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 20000g). Надосадочную жидкость декантируют, осажденные центрифугированием SP-C повторно суспендируют в 400-500 мл трис-буфера и снова центрифугируют при тех же условиях в течение 30 мин.

Осажденный центрифугированием SP-C растворяют в 3,5 л смеси хлороформа, метанола и соляной кислоты (1,75 л CHCl3 + 1,75 л CH3OH + приблизительно 30 мл 2Н HCl). Этот сырой раствор SP-C далее очищают с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) на C8 в качестве материала обращенной фазы. Хлороформ/метанольный экстракт перед загрузкой на колонку для препаративной ЖХВД разбавляют 90%-ным метанолом в соотношении приблизительно 1: 2. Из этого раствора в колонку (диаметр 5 см) можно загружать, например, приблизительно 400 мг SP-C(FF/I) (например, разбавленного 2 л сырого экстракта). SP-C(FF/I) элюируют в кислых условиях (pH 2-3) с использованием градиента вода/изопропанол (см. таблицу). Приблизительно через 30 мин хроматографирования в той области, в которой элюирован SP-C (УФ-обнаружение при 220 нм), собирают 4-6 фракций по 200 мл. Фракции проверяют с помощью аналитической ЖХВД и соответственно направляют в банк данных. Если пробы необходимо хранить, то их замораживают в жидком азоте и хранят в морозильной камере при -80oC. Чистота получаемого SP-C(FF/F) составляет 98,5-99,5%.

Условия разделения представлены в таблице.

4. Встраивание SP-C(FF/I) в фосфолипидную матрицу

Липофильный пептид SP-C(FF/I) смешивают в изопропанольном растворе с компонентами фосфолипидной матрицы и осаждают путем впрыскивания в разбавленный раствор поваренной соли (0,065% вес/вес NaCl) при комнатной температуре в гомогенной смеси с компонентами фосфолипидной матрицы. Из суспензии легочного поверхностно-активного вещества на стаканчиковой центрифуге отделяют легочное поверхностно-активное вещество (ЛПАВ), ресуспендируют в растворе электролита (NaCl, CaCl2) и с помощью 0,1Н NaOH pH доводят до 6,5. Эту водную суспензию разливают по 20-миллилитровым ампулам и лиофилизуют. Приведенные в нижеследующем примере получения весовые и объемные данные относятся к получению 10-граммового препарата легочного поверхностно-активного вещества.

7,00 г Дипальмитоилфосфатидилхолина (ДРФХ), 3,08 г аммониевой соли пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (ПОФГ х NH4) и 0,25 г пальмитиновой кислоты растворяют при 40oC в 200 мл 90%-ного изопропанола и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор фосфолипида объединяют с 1 л раствора, полученного после ЖХВД-очистки и содержащего 200 мг очищенного SP-C(FF/I). Значение pH полученного "распыляемого раствора" доводят при перемешивании раствором бикарбоната (приблизительно 5 мл 5%-ного раствора NaHCO3) до 4,5.

"Распыляемый раствор" при интенсивном перемешивании вводят при комнатной температуре со скоростью впрыскивания 25 мл/мин через однокомпонентное сопло в 9,6 л разбавленного раствора NaCl (0,065% вес/вес). Образуется опалесцирующий раствор, из которого после двухчасовой выдержки при 4-8oC при впрыскивании раствора электролита (3,0 г CaCl22H2O и 61,3 г NaCl в 300 мл H2O) в осадок выпадает препарат легочного поверхностно-активного вещества. Суспензию легочного поверхностно-активного вещества (общий объем 10,8-11,0 л) выдерживают в течение ночи при 4oC, а затем в течение 30 мин центрифугируют на стаканчиковой центрифуге Sorvall (RC2-B) при 16000g. Для удаления остатков изопропанола образовавшуюся при центрифугировании лепешку ресуспендируют в половинном объеме 0,65%-ного раствора поваренной соли и повторно центрифугируют. Эту стадию повторяют 3-4 раза. Лепешку, полученную на заключительной стадии центрифугирования, растворяют в 400 мл 0,65%-ного раствора NaCI, значение pH с помощью 0,1Н NaOH доводят до 6,5 и распределяют порциями по 6,2 г в 20-миллилитровые ампулы. Содержимое ампул лиофилизуют следующим образом: замораживают на 6 ч при -45oC и нормальном давлении, сушат вымораживанием в течение 54 ч при 0,16 мбар и -20oC, а затем для дальнейшей интенсивной сушки еще в течение 5 ч при -20oC и 0,02 мбар.

Таким путем получают 65-66 ампул, содержащих по 0,150 г легочного поверхностно-активного вещества (рассчитано без NaCl).

Сухие пробы легочного поверхностно-активного вещества хранят в холодильной камере при 4oC, а перед применением их необходимо ресуспендировать водой или физиологическим раствором NaCl (суспензионная концентрация 25 мг/мл).

В каждой ампуле содержится: 95,6 мг дипальмитоилфосфатидилхолина, 42,1 мг пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (аммониевая соль), 2,7 мг SP-C(FF/I), 6,8 мг пальмитиновой кислоты, 2,9 мг хлорида кальция (безводного). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Полипептиды, обладающие активностью легочного поверхностно-активного вещества, общей формулы I



где A - H или Phe;

B - Phe или Trp;

C - IIe, Leu или Ser.

2. Полипептиды по п.1, отличающиеся тем, что A - H или Phe, B - Phe и C - Ile.

3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что A - Phe, B - Phe и C - Ile.

4. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что A - H, B - Phe и C - Ile.

5. Фармацевтическая композиция для лечения респираторного дистресс-синдрома (РДС) у млекопитающих, содержащая легочный поверхностно-активный полипептид по одному из пп.1 - 4, фосфолипиды, жирные кислоты и электролиты при следующем соотношении (мас.%):

Фосфолипиды - 80 - 95

Полипептиды - 0,5 - 3,0

Жирные кислоты - 4 - 7

Электролиты - 1 - 3

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве легочного поверхностно-активного вещества она содержит по меньшей мере один легочный поверхностно-активный полипептид из группы SP-A и SP-B.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что в качестве легочного поверхностно-активного вещества она содержит SP-B.

8. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипидов она содержит дипальмитоилфосфатидилхолин, пальмитоилолеилфосфатидилглицерин и/или фосфатидилглицерин.

9. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что в качестве электролитов она содержит соли кальция и/или натрия.