СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГОНАДОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГОНАДОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ


RU (11) 2136296 (13) C1

(51) 6 A61K35/30, A61K38/02 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 15.02.2008 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 97120213/14 
(22) Дата подачи заявки: 1997.12.04 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1997.12.04 
(45) Опубликовано: 1999.09.10 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: 1. RU 944191 C, 15.08.94. 2. RU 2 074 726 С1, 10.03.97. 
(71) Заявитель(и): Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" 
(72) Автор(ы): Мельников Н.В.; Нигамов Ф.Н.; Алсынбаев М.М. 
(73) Патентообладатель(и): Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат" 
Адрес для переписки: 450024, Республика Башкортостан, Уфа, ул.Новороссийская 105, НПО "Иммунопрепарат" отдел промышленной собственности 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГОНАДОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 

Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике, и касается получения препаратов из животного сырья, а именно биологически активных пептидов, обладающих антигонадотропной активностью. Сущность метода состоит в том, что используют шишковидные железы (эпифиз) КРС, которые измельчают, экстрагируют в растворе уксусной кислоты, замораживают при температуре минус 5 - 20oC и оттаивают, после чего предварительно осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Технический результат: способ позволяет увеличить выход целевого продукта с единицы сырья, а также обеспечить технологичность и экологичность производства. 1 ил, 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к производству лекарственных средств, применяемых в медицинской практике и касается получения препаратов из животного сырья.

За последние годы накоплен обширный материал, свидетельствующий о важной роли низкомолекулярных пептидов шишковидной железы (эпифиза) в процессах регуляции гомеостаза. Получены данные о способности эпифизарных пептидов стимулировать синтез и секрецию мелатонина шишковидной железы, ингибировать свободнорадикальные процессы в организме, увеличивать продолжительность жизни животных, замедлять старение репродуктивной и иммунной систем, тормозить развитие гормонозависимых опухолей и уменьшить их метастатический потенциал [1, 2].

За прототип изобретения принят метод получения пептидного комплекса из шишковидной железы крупного рогатого скота (КРС), включающий экстракцию измельченного сырья 3-5%-ной уксусной кислотой с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкости шестью объемами ацетона при температуре минус 3-5oC, промывку осадка тремя объемами ацетона и эфира, его ренатурацию в 1%-ной уксусной кислоте с последующим осветлением и приготовлением лекарственной формы [3]. Однако получаемый таким способом пептидный препарат содержит белковые контаминации, а выход целевого продукта с единицы сырья мал и составляет 7 г/кг. Кроме того, способ-прототип обладает существенными недостатками, связанными с использованием больших объемов ацетона, что делает производство взрывоопасным, нетехнологичным, требует громоздкого оборудования (отстойников, ректификационных колонн и пр.) и огромных производственных площадей.

Изобретением решена задача создания более технологичного и эффективного способа получения биологически активных пептидов из эпифиза КРС с более высоким выходом и чистотой при сохранении требуемой активности.

Получаемый согласно разработанному способу пептидный комплекс не содержит белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с трихлоруксусной кислотой, а также данные высокоэффективной жидкостной хроматографии (см. чертеж), отвечает критериям подлинности (максимум поглощения в ультрафиолетовом спектре составляет 2705 нм) и специфической активности (обладает выраженным антигонадотропным действием в опытах на крысах in vivo).

Для достижения поставленной задачи используют шишковидные железы (эпифиз) КРС, которые измельчают, экстрагируют в растворе уксусной кислоты, замораживают при температуре минус 5 -20oC и оттаивают, после чего предварительно осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД.

В отличие от способа-прототипа, согласно которому целевой продукт выделяют и концентрируют методом ацетонового осаждения, в заявляемом способе вводится этап замораживания экстрагируемого сырья при температуре минус 5-20oC с последующим оттаиванием, что приводит к значительному увеличению выхода биологически активных пептидов вследствие криогенного нарушения целостности клеточных мембран, сопровождающегося выбросом интрацеллюлярных продуктов. Кроме того, процесс замораживания-оттаивания приводит к криоструктурированию полидисперсных частиц соединительной ткани и выскомолекулярных белков, что существенно облегчает последующее отделение экстракта от мезги.

Другой отличительной особенностью заявляемого способа является использование для очистки целевого продукта ультрафильтрации на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Выбор мембран с указанной селективностью обусловлен молекулярной массой биологически активных пептидов, которая составляет 1-10 кД (1,4).

Пример 1. 5 кг замороженной шишковидной железы КРС измельчают электромясорубкой, добавляют в фарш 2,5 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты, перемешивают, гомогенизируют в роторно-пульсационном аппарате и экстрагируют в реакторе при температуре 1oC в течение 18 ч с постоянным перемешиванием.

По окончании экстракции субстрат разливают по 10-12 л в бачки из полиэтилена и подвергают процедуре замораживания при температуре минус 5oC последующим оттаиванием. Для ускорения процесса дефростации бачки можно поместить в ванну с горячей водой.

После полного оттаивания, содержимое бачков фильтруют через капроновую сетку, осветляют на сепараторе типа АСГ-3М (6-8 тыс. об/мин) и подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом пропускания 10 кД. Полученный ультрафильтрат лиофилизируют.

Выход целевого продукта составляет 12 г на 1 кг исходного сырья.

Пример 2. 20 кг замороженного эпифиза КРС измельчают на волчке и заливают 10 литрами 0,1 н. уксусной кислоты и гомогенизируют в роторно-пульсационном аппарате. Экстракцию проводят в реакторе при температуре 5oC в течение 24 ч с периодическим перемешиванием.

По окончании экстракции субстрат замораживают при температуре минус 20oC, а затем оттаивают и фильтруют последовательно через капроновую сетку и фильтрокартон.

Осветленный экстракт подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с селективностью 10 кД. Ультрафильтрат лиофилизируют.

Выход целевого продукта составляет 13,5 г на 1 кг исходного сырья.

Наличие белка (см. таблицу) определяли в тесте с трихлоруксусной кислотой.

Биологическую активность (см. таблицу) пептидов определяли по их антигонадотропному действию на белых беспородных крысах массой 25-35 г (возраст 25 дней) (5). Животных распределяли на 3 группы по 10 крыс в каждой. Первой (контрольной) группе ежедневно в течение 3 дней подкожно вводили по 0,2 мл воды для инъекций. Второй и третьей группам адекватно в левый бок вводили гонадотропин хорионический (по 0,5 ЕД в 0,2 мл воды для инъекций). Одновременно животным третьей группы в правый бок вводили по 2 мг пептидов эпифиза в 0,2 мл воды. На четвертый день крыс забивали и определяли среднеарифметическую массу матки для каждой группы. Биологическую активность вычисляли по соотношению (в %) среднеаримфетических масс маток второй и третьей групп животных.

Сравнительный анализ субстратов, полученных согласно заявляемому способу и способу-прототипу, показывает полную идентичность полипептидных фракций обоих образцов при полном отсутствии белковых контаминаций в полученном нами продукте.

Таким образом, заявляемый способ позволяет почти в 2 раза увеличить выход биологически активных пептидов с единицы сырья, повысить качество целевого продукта за счет очистки от белковых контаминаций, а также исключить из технологии ацетоновое осаждение и тем самым повысить безопасность и экологическую чистоту.

Использованные источники информации

1. Анисимов В. Н. , Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. // Усп. совр. биол. - 1993. - Т. 113. - Вып. 6. - С. 752-762.

2. Анисимов В.Н., Арутюнян А.В., Хавинсон В.Х. // Докл. АН - 1997. - Т. - 352. - N 6. - С. 831-833.

3. Патент РФ N 944191 A 61 K 35/30. Опубл. 15.08.94. - Бюл. N 15.

4. Яковлев Г. М. и соавт. Механизмы биорегуляции. // Спб. - "Наука". - 1992. - 40 с.

5. ВФС 42-1971-90. Эпиталамин. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ получения пептидов, обладающих антигонадотропным действием путем измельчения шишковидных желез (эпифиза) крупного рогатого скота, экстракции, выделения целевого продукта из экстракта, отличающийся тем, что после экстракции субстрат подвергают замораживанию при температуре минус 5 - 20oC с последующим оттаиванием и осветлением экстракта, а заключительную очистку проводят методом ультрафильтрации на мембранах с порогом пропускания 10 кД.