СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА ИЛИ ЕГО БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА ИЛИ ЕГО БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ


RU (11) 2081122 (13) C1

(51) 6 C07K14/62 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 15.02.2008 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 94023134/13 
(22) Дата подачи заявки: 1994.06.16 
(45) Опубликовано: 1997.06.10 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: Патент ЕР N 0037256, кл. C 07 C 103/52, 1981. 
(71) Заявитель(и): Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН 
(72) Автор(ы): Мальцев К.В.; Мирошников А.И.; Вульфсон А.Н.; Гаврюченкова Л.П.; Громова О.А. 
(73) Патентообладатель(и): Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА ИЛИ ЕГО БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ 

Использование: биотехнология, биохимия. Сущность изобретения: раствор, содержащий инсулин или его биотехнологический предшественник, хроматографируют на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5 - 5,8, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают и хроматографируют на анионобменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0 - 10,5. Предпочтительно в качестве катионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный фосфогруппами, и обессоливание осуществляют с помощью ультрафильтрации. Способ позволяет получать инсулин или его биотехнологические предшественники высокой степени чистоты - более 97,5%. 3 з.п. ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к биотехнологии и касается усовершенствованного способа получения инсулина и его биотехнологических предшественников.

В настоящее время производят инсулин как животного, так и генно-инженерного происхождения. В первом случае инсулин выделяют из поджелудочной железы животных с последующей возможной его трансформацией в инсулин человека, а во втором получают в результате сложного технологического процесса из клеток рекомбинантных микроорганизмов. К биотехнологическим предшественникам относят белки, которые включают в свой состав аминокислотные последовательности А- и В-цепей инсулина и содержат три дисульфидные связи, аналогичные таковым в молекуле инсулина, а именно между А-6 и А-11, А-7 и В-7 и А-20 и В-19 цистеиновыми остатками.

Известен способ выделения и очистки инсулина животного происхождения, который заключается в том, что раствор инсулина, полученный в результате превращения свиного инсулина под действием карбоксипептидазы Y в инсулин человека, подвергают гель-хроматографии на колонке с "Сефадексом G-50 мелким" и лиофилизуют. Затем осуществляют анионообменную хроматографию на сорбенте "Сефадекс ДЕАЕ А-25" пи pH 7, 5, элюируют инсулин в градиенте концентрации соли, обессоливают на колонке с "Сефадексом G-25", лиофилизуют и получают инсулин человека с чистотой 90 96% Способ не обеспечивает достаточно высокую чистоту целевого продукта. Кроме того, используемая в способе гель-хроматография имеет хорошее разрешение только при невысоких нагрузках на сорбент.

Известен способ выделения и очистки инсулина, согласно которому раствор инсулина, полученный в результате ферментативной обработки его генно-инженерного предшественника (проинсулина), подвергают хроматографии на колонке с ионообменником, а затем обращенно-фазовой (C-8 или C-18) ВЭЖХ с последующей гель-хроматографией. Способ позволяет получать инсулин высокой степени чистоты более 97,5% Однако осуществление его в промышленном масштабе сопряжено со значительными трудностями, обусловленными применением ВЭЖХ (не на заключительной стадии) и гель-хроматографии, которая не позволяет использовать большие нагрузки на единицу объема сорбента. Кроме того, использование гель-хроматографии после ВЭЖХ свидетельствует о невозможности отделения всех высокомолекулярных примесей с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Известен способ выделения и очистки инсулина, в соответствии с которым раствор биотехнологического предшественника инсулина моно-аргинин-инсулина, полученного в результате ферментативной обработки мини-проинсулина (который в свою очередь получен из раствора, содержащего около 70% соответствующего 5-сульфонатного производного), хроматографируют на колонке с катионообменником "S-cефарозой" ("Фармация", Швеция) при pH 3,5, элюируют моно-аргинин-инсулин в градиенте соли и после осаждения, кристаллизации и лиофилизации получают моно-аргинин-инсулин с чистотой более 90% который затем ферментативно превращают в инсулин с чистотой 85% Инсулин подвергают хроматографической очистке на анионообменнике "TSK-DEAE-65OM" ("Tocox", Япония) при pH 8,3,осаждают в виде цинкового комплекса и кристаллизуют. В результате получают инсулин с чистотой более 95%

Наиболее близким к описываемому по технической сущности является способ выделения и очистки инсулина, в соответствии с которым раствор инсулина, полученный в результате соединения А- и В-цепей инсулина, пропускают через колонку с сорбентом "Сефадекс G-50 (Superfine)" для удаления высокомолекулярных примесей и обессоливания, затем проводят анионообменную хроматографию на "DEAE-целлюлозе" при pH 8,5 с последующим обессоливанием на "Сефадексе G-25". Активность целевого продукта составляет 26,31,8 ед/мг, что свидетельствует о недосаточно высокой чистоте целевого продукта. В этом способе также используется гель-хроматография, которая, как уже указывалось выше, осуществляется с небольшой нагрузкой на единицу объема сорбента.

Предлагаемый способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников заключается в том, что раствор, содержащий инсулин или его биотехнологический предшественник, хроматографируют на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5 -5,8, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают и хроматографируют на анионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0 10,5.

Предлагаемый способ отличается от известного тем, что вместо гель-хроматографии осуществляют катионообменную хроматографию с использованием сорбента на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5-5,8, элюирование белков, сввязавшихся с катионообменником, осуществляют в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт обессоливают, а анионообменную хроматографию осуществляют, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0-10,5. Эти отличия позволяют получать инсулин или его биотехнологические предшественники высокой степени чистоты более 97,5%

Предпочтительным вариантом осуществления способа является использование в качестве катионообменника сорбента на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированного фосфогруппами, а также осуществление обессоливания с помощью ультрафильтрации.

Обессоливание алюата можно осуществлять и с помощью ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами. Это приводит к дополнительной очистке элюата.

Предлагаемый способ может быть использован для выделения и очистки как инсулина, полученного в результате ферментативной обработки его биотехнологического предшественника, так и инсулина, полученного из его А- и В-цепей, инсулина, выделенного из поджелудочной железы животных, инсулина человека, полученного в результате ферментативной трансформации животного инсулина, а также биотехнологических предшественников инсулина.

В описываемом способе как катионнообменная, так и анионообменная хроматография и используемая для обессоливания гидрофобная хроматография осуществляются с использованием сорбентов на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами. К таковым относятся, в частности, сорбенты на основе синтетического полимерного носителя "Биохром". Носители типа "Биохром" получают суспезионной сополимеризацией метакриловых мономеров с кросс-агентами метакрилатной природы в присутствии инициатора полимеризации с последующим приданием носителю гидрофильных свойств. Ионообменники и сорбенты для гидрофобной хроматографии получают путем модификации носителей типа "Биохром" соответствующими функциональными группами. Так, катионообменники получают при модификации носителей типа "Биохром" фосфо-, сульфо-, карбокси-и другими подходящими функциональными группами. Анионообменники получают модификацией носителя типа "Биохром" четвертичными аминогруппами, а сорбенты для гидрофобной хроматографии алкильными группами. Модификацию полимерных носителей на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами проводят по гидроксильным группам нейтральной матрицы с помощью функциональных химических модификаторов стандартными методами. Все сорбенты на основе носителей типа "Биохром" являются жесткими, что сообщает им дополнительные преимущества при использовании способа в промышленном масштабе.

Первой стадией является хроматография на катионообменике. Разделение наиболее эффективно при pH, близком к изоэлектрической точке. Катионообменники на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами обладают хорошими емкостными характеристиками, в том числе при хроматографии инсулина и его биотехнологических предшественников в интервале pH 4,5 5,8. Наилучшие результаты достигнуты при использовании катионообменников на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных фосфогруппами, например, сорбента "Фосфо-Биохром К", получаемого при модификации нейтральной матрицы носителя "Биохром" фосфорилирующим реагентом. Кроме того, такие катионообменники позволяют получить на этой стадии С-пептид более высокой степени чистоты (90 95% чем в известных способах.

В способе на первой стадии также используется катионообменная хроматография. Однако ее осуществляют при pH 3,5, т.е. при значении pH, далеком от изо-точки. В результате на этой стадии получают продукт с чистотой 90% После стадии катионообменной хроматографии получают инсулин или его предшественники с чистотой около 95%

Поскольку элюцию белков, связавшихся с катионообменником, осуществляют в градиенте концентрации соли, то после элюирования проводят обессоливание фракций, содержащих целевой продукт. Для этого используют ультрафильтрационный процесс на мембранах, не пропускающих инсулин или его предшественники, или ступенчатую гидрофобную хроматографию. Ультрафильтрацию можно осуществлять на мембранах "PTGC ("Миллипор", США) или "Биопор Т-10" ("Пластек, РФ). Гидрофобную хроматографию проводят, используя сорбенты на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных алкильными группами, например "Алкил-Биохром".

После обессоливания элюат подвергают анионообменной хроматографии. Оказалось, что высокая степень очистки инсулина и его предшественников, в том числе отделение дезамидоинсулина и проинсулина от инсулина достигается при проведении анионообменной хроматографии в буферах со значением pH более 9,0. Используемые в известных способах на стадии анионообменной хроматографии сорбенты "TSK-DEAE-65OM", "Сефадекс DEAE A-25" [2] или "DEAE-целлюлоза", имеющие третичные аминогруппы, эффективно работают при pH ниже 8,5. Поэтому они недостаточно эффективны для получения высокоочищенного инсулина. Используемые в предлагаемом способе сорбенты на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных четвертичными аминогруппами, позволяют осуществлять хроматографию при pH 9,0 10,5. Содержание целевого продукта во фракциях, полученных после анионообменной хроматографии, составляет (по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ) более 97,5% содержание дезамидоинсулина (в инсулине) не превышает 0,5% При этом содержание высокомолекулярных примесей (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) не превышает 0,5%

Способ осуществляется следующим образом. Инсулин, полученный в результате ферментативной обработки своего генно-инженерного предшественника или из экстракта поджелудочной железы животных, или любым способом, или его биотехнологические предшественники растворяют в буфере с pH 4,2 5,0, содержащем мочевину, и наносят на колонну с катионнообменником на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, например, с "Фосфо-Биохромом К", уравновешенную 30 мМ ацетатным буфером (pH 5,0) с 6 М мочевиной. После того, как белок связался с катионитом, колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в линейном градиенте концентрации соли от 0 до 0,5 М в том же буфере. Если в растворе находится C-пептид, выщепленный ферментами из проинсулина, то он смывается с колонны первым. Далее элюируются основные примеси, а затем инсулин или его биотехнологический предшественник, чистота которых составляет 90-95%

Затем инсулин или его биотехнологический предшественник подвергают дальнейшей очистке. Для этого фракции, содержащие целевой продукт, полученные на предыдущей стадии, концентрируют и обессоливают или при помощи ультрафильтрации, например, на мембранах "PTGC" или "Биопор Т-10", или при помощи ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя в качестве сорбента сополимер метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами, например, "Алкил-Биохром".

После этого инсулин или его биотехнологический предшественник в 10 мМ аммонийном буфере (pH 9,0-10,5) наносят на колонну с анионнообменником на основе сополимера метакрилатных мономеров с кросс-агентами, имеющего четвертичные аминогруппы, например, с сорбентом "Q-Бихром А", уравновешенную тем же буфером. После того, как белок связался с сорбентом, колонну отмывают, продукт элюируют в градиенте концентрации соли от 0 до 0,2 М в 10 мм аммонийном буфере (pH 9,5-10,0) и собирают фракции, содержащие высокоочищенный продукт с содержанием основного вещества 97-98% В случае инсулина его затем лиофилизируют или осаждают в виде цинкового комплекса.

В отношении предшественников инсулина, где может не требоваться столь тщательная очистка, можно использовать анионообменники с третичными аминогруппами, которые имеют более высокие емкостные характеристики, например, сорбент " ДЕАЕ-Биохром А2". Условия проведения хроматографии те же, за исключением pH буфера, который имеет значение ниже 8,0.

В случае, если не достигнута необходимая степень чистоты целевого продукта из-за низкого качества исходного материала (наличие большого количества родственных инсулину примесей), инсулин после анионообменной хроматографии наносят на колонну с сорбентом типа "Алкил-Биохром", предварительно уравновешенную раствором, содержащим 10%-ный этанол и 2,5 М хлористый натрий. После связывания белка с сорбентом и отмывки колонки инсулин элюируют в градиент концентраций этанола от 10 до 60% при обратном градиенте концентрации соли от 2,5 до 0 М.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приводятся конкретные примеры его осуществления.

Пример 1. 2,5 л раствора инсулина (50 г белка, содержание инсулина 50%) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), полученного в результате ферментативной обработки генно-инженерного предшественника инсулина, после доведения pH до 4,5 и добавления мочевины для растворения инсулина, наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х30 см), содержащую 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К", уравновешенную буфером, содержащим 30 мМ ацетат натрия (pH 5,5) и 6 М мочевину (буфера А). После нанесения образца колонну промывают в течение 30 мин 2,5 л буфера А, белок элюируют в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,5 М в буфере А в течение 4 ч, объем элюата равняется 20 л. Фракции, содержащие около 17 г инсулина, собирают в объеме 3 л. Чистота получаемого инсулина составляет 90% содержание высокомолекулярных примесей и проинсулина (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) не превышает 1,0%

Полученный раствор инсулина концентрируют при помощи ультрафильтрации на мембранах "RTGC", диафильтруют 3 л 10 мМ аммоний ацетатного буфера (pH 9,5), содержащего 2,5 М мочевину (буфер Б), и подвергают анионообменной хроматографии. Для этого на колонну (11,3х30 см), с 3 л сорбента "Q-Биохром А", уравновешенную буфером Б со скоростью 5 л/ч наносят 7,5 г инсулина в 2 л буфера Б. Колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Инсулин элюируют в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Собирают фракции, содержащие 6 г инсулина 97,5% чистоты в объеме 2 л. Мочевину и соли удаляют посредством ультрафильтрации, как описано выше, после чего инсулин осаждают в виде цинкового комплекса добавлением хлористого цинка.

Пример 2. Очистка генно-инженерного проинсулина.

3 л раствора проинсулина (79 г белка, содержание проинсулина 71%) в 10 мM аммоний ацетатном буфере (pH 4,8), содержащего 3 М мочевину, наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3 30 см), содержащую 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К", уравновешенную буфером, содержащим 30 мМ ацетат натрия (pH 5,0) и 6 М мочевину (буфер А). После нанесения образца колонну промывают в течение 30 мин 2,5 л буфера А, белок элюируют в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,5 М в буфере А в течение 4 ч, объем элюата равняется 20 л. Фракции, содержащие около 45 г проинсулина, собирают в объеме 3 л. Чистота получаемого проинсулина составляет 90% содержание высокомолекулярных примесей (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) составляет 3%

Полученный раствор проинсулина диафильтруют 10 мМ аммоний ацетатным буфером (pH 7,5), содержащим 2,5 М мочевину (буфер Б), 25 г проинсулина в 2 л этого буфера наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х30 см), содержащую 3 л сорбента "ДЕАЛ-Биохром А2", уравновешенную буфером Б. После нанесения образца колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Проинсулин элюируют с колонны в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Фракции, содержащие 20 г проинсулина, собирают в объеме 2 л. Чистота проинсулина составляет 95%

При использовании вместо "ДЕАЕ-Биохрома А2" сорбента "Q-Биохрома А" условия проведения хроматографии те же, но pH буфера равняется 9,5, а нагрузка составляет 12 г на 3 л сорбента. Чистота проинсулина составляет 98%

Пример 3. 2,5 л раствора инсулина (30 г белка, содержание инсулина 78%) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), полученного из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, подвергают хроматографической очистке на колонке с 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К" аналогично описанному в примере 1. Получают фракции объемом 3 л, содержащие 16,5 г инсулина 90% чистоты.

Полученные фракции для обессоливания наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л сорбента "Алкил-Биохром". Колонну промывают 4,5 л воды и белок элюируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в 50%-ном этаноле, объем элюата 1,5 л.

7,5 г инсулина в 3,0 л буфера Б подвергают хроматографии на колонне (11,3х30 см) с 3 л сорбента "Q-Биохром А" аналогично описанному в примере 1. Получают фракции объемом 2 л, содержащие 6 г инсулина 97% чистоты.

После хроматографической очистки на сорбенте "Q-Биохром А" содержание основного вещества составляет 95% Полученный элюат наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л сорбента "Алкил-Биохрома", колонну промывают 4,5 л воды и белок элюируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в 50% -ном этаноле; объем элюата 1,5 л. Этанол удаляют упариванием на роторном испарителе и инсулин лиофилизируют.

3 г инсулина в 1 л элюата наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л "Алкил-Биохрома", уравновешенную раствором, содержащим 10%-ный этанол и 2,5 М хлористый натрий. Белок элюируют этанолом в градиенте концентрации от 10 до 60% и обратном градиенте концентрации ацетата аммония от 2,5 до 0 М. Получают фракции объемом 2 л, содержащие 2,4 г инсулина 98% чистоты. Этанол удаляют упариванием в вакууме при 30oС и инсулин лиофилизируют. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников, включающий получение раствора инсулина или его предшественника, анионообменную хроматографию, обессоливание, отличающийся тем, что до стадии анионообменной хроматографии раствор, содержащий инсулин или его предшественник, хроматографируют при рН 4,5 5,8 на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли и фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают, а анионообменную хроматографию проводят при рН 9,0 10,5, при этом в качестве анионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющего четвертичные аминогруппы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве катионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный фосфогруппами.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят с помощью ультрафильтрации на мембранах.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят с помощью ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами.