СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ПРИСТУПОВ И ВОЗНИКАЮЩЕГО ОТ НИХ РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ

СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ПРИСТУПОВ И ВОЗНИКАЮЩЕГО ОТ НИХ РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ


RU (11) 2153353 (13) C2

(51) 7 A61K38/48 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 20.11.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 94022754/14 
(22) Дата подачи заявки: 1994.07.01 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1994.07.01 
(31) Номер конвенционной заявки: 08/088,033 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1993.07.02 
(33) Страна приоритета: US 
(45) Опубликовано: 2000.07.27 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: 1. GB 2194886 A, 23.03.1988. 2. EP 0480906 A2. 15.04.93. 3. Дундуа Д.П. Применение тромболитической терапии при инфаркте миокарда на догоспитальном этап. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - М.: 1992, с.2 - 3. 
(71) Заявитель(и): БАКСТЕР АГ (AT) 
(72) Автор(ы): Йохан АЙБЛ (AT); Людвиг ПИХЛЕР (AT); Ханс-Петер ШВАРЦ (AT) 
(73) Патентообладатель(и): БАКСТЕР АГ (AT) 
Адрес для переписки: 103735, Москва, ул. Ильинка 5/2, ООО "Союзпатент", Агурееву А.П. 

(54) СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ПРИСТУПОВ И ВОЗНИКАЮЩЕГО ОТ НИХ РЕПЕРФУЗИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ 

Предложено новое активное начало фармацевтической композиции и фармацевтическая композиция для предотвращения и лечения реперфузионного повреждения. В этом качестве предложен лиз-плазминоген. Обнаружено, что лиз-плазминоген, который может быть получен посредством протеолитического расщепления глу-плазминогена, оказывает защитное действие на ткань, которая была повреждена при ишемическом состоянии. Введение лиз-плазминогена может использоваться для лечения пациентов во время реперфузии и после того, как репорфузия произошла. Лиз-плазминоген также может быть назначен в сочетании с терапией разложения тромба, такой в которой применяются активатор ткани плазминогена и тому подобные. 2 с. и 31 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Настоящее изобретение относится к применению лиз-плазминогенов для предотвращения и лечения ишемических приступов и возникающего от них реперфузионного повреждения.

Удар остается третьей наиболее обычной причиной смерти в промышленных странах, следуя после ишемического заболевания сердца и рака. Удары ответственны за примерно 300 тысяч смертей в год в США и около 11 тысяч смертей в год в Австрии. Удары также являются основной причиной поступлений в госпитали и причиной длительной нетрудоспособности. В связи с этим, социально-экономический эффект удара и связанного с ним общественного бремени практически неизмеримы.

Всемирная Организация Здравоохранения определяет "удар" как быстро развивающийся клинический симптом местного или глобального нарушения церебральной функции с симптомами, продолжающимися по меньшей мере 24 часа. Часто удары являются причиной смерти, когда отсутствует другая очевидная причина, кроме эффекта сосудистого происхождения.

Обычно удары вызываются блокированием или закупориванием кровеносных сосудов, входящих в мозг или находящихся внутри мозга. При полной закупорке прекращение церебральной циркуляции вызывает остановку нейронной электрической активности в течение нескольких секунд. В течение нескольких минут после ухудшения энергетического состояния и ионного гомеостазиса происходит истощение высокоэнергетических фосфатов, повреждение мембранного ионного насоса, отток клеточного калия, приток хлорида натрия и воды и деполяризация мембраны. Если закупорка продолжается в течение более чем 5 - 10 минут, то происходит необратимое повреждение. Однако при незавершенной ишемии результат трудно оценить, причем он зависит в основном от остаточного кровоснабжения и доступности кислорода. После тромбозной закупорки церебрального сосуда ишемия редко бывает полной. Обычно сохраняется некоторое остаточное кровоснабжение в ишемической зоне, которое зависит от побочного потока крови и местного перфузионного давления.

Церебральный поток крови может компенсировать падение среднего артериального давления от 90 до 60 мм рт. ст. за счет саморегулирования. Это явление включает расширение следующих по кровотоку расширяющихся сосудов. Ниже нижнего уровня саморегулирования /примерно 60 мм рт.ст./ расширение сосудов является неадекватным и церебральный кровяной поток снижается. Однако мозг имеет резерв кровоснабжения, который может компенсировать снижение церебрального кровяного потока. Этот резерв существует потому, что при нормальных условиях извлекаются только примерно 35% кислорода, поступающего с кровью. Поэтому может иметь место усиление извлечения кислорода, при условии, что существует нормоксия и нормокапнея. Когда периферическое кровяное давление снижается примерно ниже 30 мм рт. ст. , два компенсирующих механизма /саморегулирование и резерв кровоснабжения/ являются неадекватными для предотвращения недостатка поступления кислорода.

Когда поток снижается ниже ишемического порога в 23 мл на 100 г в минуту, развиваются симптомы кислородной недостаточности тканей. Сильная ишемия может быть смертельной. Когда ишемия является умеренной, она может приводить к "полутени". В нейрологическим контексте "полутень" относится к зоне мозговой ткани с умеренной ишемией и парализованной нейрональной функцией, которая является обратимой при возобновлении соответствующего кровоснабжения. Полутень формирует зону побочно снабжаемой кровью ткани, окружающей центр сильной ишемии, в которой развивается инфаркт. Другими словами, полутень это область ткани, которая может быть сохранена и по сути находится в состоянии между жизнью и смертью.

Когда тромб разрушается и возобновляется кровяной поток в полутень, может происходить явление, известное как реперфузионное повреждение. Части поврежденной ткани в полутени могут быть уничтожены или дополнительно повреждены в результате возобновленного поступления кислорода или других веществ в область, пораженную ишемией. С учетом этого явления, степень повреждения ткани в результате ишемии определяется как временем, требующимся для достижения открывания закупоренного сосуда, так и рядом реакций, которые следуют в результате реперфузии и возобновленного поступления кислорода в пораженную ткань.

Хотя ишемический приступ может происходить в любом месте сосудистой системы, разветвление каротидной артерии и начало внутренней каротидной артерии являются наиболее частыми местами тромбозной закупорки церебральных кровеносных сосудов, что приводит к церебральной ишемии. Симптомы пониженного кровотока вследствие стеноза или тромбоза подобны тем, которые вызваны заболеванием средней церебральной артерии. Поток через глазную артерию часто весьма занижен, что приводит к амаурозис фугакс или перемежающейся монокулярной слепоте. Сильный двухсторонний стеноз внутренней каротидной артерии может привести к пониженному кровоснабжению церебрального полушария. Это проявляется как острая головная боль, ипсилатеральная к острому ишемическому полушарию. Закупорка или уменьшение кровотока с развивающейся ишемией одной передней церебральной артерии, периферической к передней связывающей артерии, дает моторные и кортикальные симптомы в противосторонней ноге и менее часто в ближайшей руке. Другие проявления закупорки или недостаточного кровоснабжения передней церебральной артерии включают нарушение походки и иногда недержание мочи из-за повреждения парасагиттальной передней доли. Языковые расстройства, проявляющиеся как ослабление непроизвольной речи, могут сопровождать общую депрессию психомоторной активности.

Большинство ишемических ударов включает часть или всю территорию средней церебральной артерии с эмболией от сердца или внечерепных каротидных артерий, ответственной за большинство случаев. Эмболия может закупоривать основной ствол средней церебральной артерии, но более часто дает периферическую закупорку или высшей, или низшей ветви. Закупорка высшей ветви вызывает слабость и потерю чувствительности, которые более всего проявляются на лице и руках. Закупорка задней церебральной артерии, периферической к проникающим ветвям, вызывает полную контралатеральную потерю зрения. Затруднение чтения /дислексия/ и проведения расчетов /дискалькулия/ могут быть следствием ишемии главной задней церебральной артерии. Проксимальная закупорка церебральной артерии вызывает ишемию ветвей, проникающих в каламусную и краевую структуры. Клиническими результатами являются полусенсорные нарушения, которые могут хронически изменяться в трудно излечимую боль дефектного центра /таламусная боль/.

Значительный приступ в церебральной ишемии известен как переходный ишемический приступ /ПИП/. ПИП определяется как нейрологический дефицит, имеющий продолжительность меньше, чем 24 часа. ПИП является важным признаком развития ишемии, которая может привести к церебральному инфаркту. В настоящее время нет идеального способа лечения переходного ишемического приступа, причем отсутствует общепринятая концепция относительно того, должны ли использоваться медицинские или хирургические методы для того, чтобы снизить вероятность удара для больных ПИП.

Этиология переходного ишемического приступа включает гемодинамические приступы и тромболические механизмы. Поскольку большинство переходных ишемических приступов разрешается в пределах 1 часа, дефицит, имеющий большую длительность, часто классифицируется как предполагаемый удар и соответственно связывается с постоянным повреждением мозга. Поэтому используется компьютерное томографическое сканирование мозга для исследования церебрального инфаркта в областях, пораженных ПИП длительностью более чем несколько часов. В итоге, соответствующее клиническое различие между ПИП и ударом состоит в том, вызывает ли ишемия повреждение мозга, которое обычно классифицируется как инфаркт или ишемический некроз. Больные с ухудшающимися клиническими симптомами могут иметь удар в развитии или классифицируются как имеющие прогрессирующий удар. В этой клинической установке возможным важным фактором развития заболевания является распространение тромба.

Существует множество других заболеваний, вызванных или связанных с ишемией. Вертебробазиларная ишемия является результатом закупорки позвоночной артерии. Закупорка вертебральной артерии и перебои потока через ипсилатеральную, заднюю нижнюю мозжечковую артерию вызывает латеральный мозговой синдром, который имеет симптомологию, включающую головокружение, рвоту, тошнотворный нистагм, ипсилатеральную атаксию и ипсилатеральный синдром Гернера. Вертебробазиларная ишемия часто дает многоочаговые поражения, рассеянные по обеим сторонам мозгового ствола на значительной длине. За исключением церебрального инфаркта и латерального мозгового синдрома, клинические синдромы дискретных поражений весьма редко проявляются в чистом виде. Вертебробазиларная ишемия проявляется с различными сочетаниями синдромов, таких как головкружение, обычно вертиго, диплопия, лицевая слабость, расстройство координации движения и симптомы дальнего тракта.

Закупорка низовой артерии приводит к массовым дефицитам. Один из этих дефицитов известен как "заторможенное состояние".

В этом состоянии паралич конечностей и большинства мышц, относящихся к продолговатому мозгу, оставляет больному единственную возможность для общения движением глаз или век на манер кода. Закупорка низового апекса или его вершины обычно вызывается эмболией, которая располагается на месте соединения между низовой артерией и двумя задними церебральными артериями. Это состояние вызывает начальное снижение возбуждения с последующей слепотой и потерей памяти из-за прерывания потока в задние церебральные артерии, а также аномальностями пристального взгляда и зрачковой реактивности вследствие покровного повреждения.

Венозная закупорка может вызвать массовое повреждение и смерть. Это заболевание менее распространено, чем артериальное церебрально-сосудистое заболевание. Как и при ишемическом ударе от артериального заболевания, в этом случае первичный механизм повреждения мозга состоит в снижении капиллярного потока крови вследствие увеличения сопротивления истечению из блокированных вен. Обратная передача высокого давления в русло капилляров обычно приводит к преждевременному набуханию мозга от опухоли и кровоточащему инфаркту в подкорковом белом веществе. Наиболее опасная форма венозного заболевания возникает, когда закупоривается верхний сагиттальный синус. Венозная закупорка возникает в связи с нарушениями коагуляции, часто в пурпуральном периоде или у больных с рассеянным раком или с инфекционными заболеваниями. Если не инициируется антикоагуляционная терапия, то закупорка верхнего сагиттального синуса вызывает степень смертности 25 - 40%.

Краткая диффузная церебральная ишемия может вызвать обморок без каких-либо постоянных осложнений. Продолжительная диффузная ишемия в других органах имеет разрушительные последствия. Наиболее общей причиной является сердечная асистолия или другие сердечно-легочные повреждения, включающие инфаркт. Рассечение аорты и глобальная кислородная недостаточность или отравление монооксидом углерода может вызвать аналогичные картины. Диффузная гипоксия/ишемия обычно уничтожает нейроны в гиппокампе, мозжечковых клетках Пуркинье, стриатуме или кортикальных слоях. Клинически, такая гипоксия/ишемия приводит к потере сознания и коме, с последующим хроническим вегетативным состоянием во многих случаях. Если к больному в течение нескольких суток не возвращается сознание, то прогноз на возвращение независимых функций мозга становится очень неблагоприятным.

Синдром повышенной вязкости является другим заболеванием, связанным с током крови и ишемией. Церебральный ток крови обратно пропорционален вязкости крови. Последняя прямо пропорциональна количеству циркулирующих красных и белых клеток, состояние агрегации - числу тромбоцитов и концентрации плазменного протеина. Ток крови обратно пропорционален деформированности эритроцитов и скорости крови /степень сдвига/. Больные с синдромом повышенной вязкости могут представлять либо местные неврологические нарушения, либо диффузные или многоочаговые признаки или симптомы, включающие головную боль, нарушения зрения, опознавательной способности, или апоплектический удар.

Существует ряд веществ, вовлеченных в образование тромба и его разложение. Плазминоген, также известный как глу-плазминоген, и плазмин являются двумя основными веществами, вовлеченными в лизис.

Плазминоген является протеином, состоящим из 791 аминокислоты, который циркулирует в плазме человека при концентрации примерно 200 мкг/мл. Плазминоген является проферментной формой фибринолитического фермента плазмина, который имеет широкую специфичность к субстрату и в конечном счете ответственен за разложение сгустков крови. Большей частью образование плазмина внутри фибринового сгустка из плазминогена, захваченного внутри сгустка, является промежуточной стадией при расщеплении белка крови /Фреденбургх и Нешхайм, J. Biol. Chem. 267, с. 26150 - 56 /1992/.

Плазминоген имеет пять окаймленных доменов в пределах аминотерминальной области тяжелой цепочки, которая проявляет связывающие лизин центры для распознавания лизиновых остатков в фибрине. Плазминоген-плазминовое превращение, как внутри тромба, так и на его поверхности, облегчается сродством к фибрину тканевого активатора плазминогена /АТП/, которое приводит к зависящей от фибрина активации плзминогена, индуцированной АТП /Фреденбург, цит. выше/.

Начавшись, фибринолиз приводит к жестким реакциям с положительной обратной связью, например, катализируемое плазмином расщепление фибрина генерирует карбокси-терминальные остатки лизина, которые в свою очередь обеспечивают дополнительные связывающие центры как для тканевого активатора плазминогена, так и для плазминогена. Это также способствует катализируемому плазмином превращению глу-плазминогена в лиз-плазминоген с помощью специфического расщепления, которое является предварительной активационной стадией /Шич и Хайджар, P.S.E.B.M. том 202, с. 258 - 64, 1993/. В литературе термин "лиз-плазминоген" относится к формам плазминогена, в которых N-терминальной аминокислотой является лизин, валин или метионин /Ниеувенуизен и др. Eur. J. Biochem. том 174, с. 163 - 69, 1988/. Активность этого превращения отражает реакцию положительной обратной связи, поскольку лиз-плазминоген является гораздо лучшим субстратом, чем глу-плазминоген, как для АТП, так и для урокиназы, которая может быть вызвана повышенным сродством лиз-плазминогена к фибрину. Отношение Kкат/Kм для катализируемой активатором ткани плазминогена активации лиз-плазминогена превышает примерно в 10 раз это же отношение для глу-плазминогена (Фреденбургх, цит. выше).

Ранее было показано, что фибринолиз ускоряется добавлением лиз-плазминогена в организм и вне организма. Кроме того, при сравнении использования экзогенного лиз-плазминогена с использованием экзогенного глу-плазминогена в аналогичных экспериментах, 0,08 микромоль лиз-плазминогена обеспечивают ту же степень усиления фибринолиза, что и 0,67 микромоль глу-плазминогена. Следовательно, хотя обе формы плазминогена сокращают время фибринолиза, лиз-плазминоген примерно в 8 раз более активен в этом отношении, чем глу-плазминоген (Фреденбургх, цит. выше).

В предыдущих исследованиях лиз-плазминогена этот протеин не предлагался при лечении реперфузионного повреждения. Традиционно реперфузионное повреждение лечат флунаризином, который эффективен только при профилактическом назначении. Поэтому целью настоящего изобретения является нахождение способа лечения реперфузионного повреждения ткани. Целью настоящего изобретения также является нахождение способа лечения ишемии, инфаркта или отека мозга.

Другой целью настоящего изобретения также является нахождение способа улучшения микроциркуляции.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа лечения реперфузионного повреждения, которое следует за ишемическими приступами.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа лечения реперфузионного повреждения, которое следует за ишемическими приступами, путем назначения фармацевтической композиции, содержащей плазмин или плазминобразующий протеин, включая проферменты и предварительно активированные проферменты плазмина.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа лечения ишемии и сопутствующего реперфузионного повреждения, которое возникает от ишемических приступов, путем назначения фармацевтической композиции, включающей активатор плазминогена и плазмин или плазминобразующий протеин, как описано выше. В соответствии с одним из замыслов настоящего изобретения разработан способ лечения реперфузионного повреждения, который включает назначение пациенту фармацевтического препарата, содержащего плазмин или плазминобразующий протеин и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительном варианте изобретения применяют лиз-плазминоген или родственные соединения. Применяемая в этом способе композиция может дополнительно включать активаторы плазминогена, такие как активатор плазминогена тканевого типа, активаторы типа урокиназы, про-урокиназы, активаторы типа стрептокиназы и плазмин.

Дополнительной целью настоящего изобретения является лечение ишемии и реперфузионного повреждения, которые возникли от хирургических операций, таких как трансплантации.

В соответствии с другим замыслом настоящего изобретения разработан способ лечения ишемии и реперфузионного повреждения, которые возникли при хирургических операциях, включающих трансплантации. Это лечение состоит в назначении протеинов, имеющих эффект лиз-плазминогена или предшественников лиз-плазминогена, пациентам, которые подвергаются или будут подвергаться хирургическим операциям. В случае трансплантации введение таких протеинов в ткань или орган реципиентов защищает ткань или орган, подлежащий трансплантации, а также ткани или органы, окружающие хирургическую область реципиента. Аналогично, введение таких протеинов в ткань или орган донора защищает ткани или органы, подлежащие трансплантации, а также ткани или органы, окружающие хирургическую область донора.

Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего далее описания и фигур.

В Таблице 1 приведена система счета для оценки неврологических дефектов.

Таблица 2 представляет собой обобщение экспериментальных данных с использованием модели крысы для оценки терапевтических преимуществ лиз-плазминогена по сравнению с контролем.

Фигура 1 является графическим изображением данных контролируемого эксперимента по оценке влияния лиз-плазминогена на содержание влаги в мозгу (отек) крыс с индуцированной ишемией. "A" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 500 ед/кг лиз-плазминогена внутривенно с реперфузией крови; "B" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно с реперфузией крови; и "C" относится к крысам, подвергшимся симуляции операции и получившим 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно (AB p < 0,001; BC p < 0,01; AC p < 0,05). .

Фигура 2 является графическим изображением данных эксперимента по оценке влияния буферного раствора на содержание влаги в мозгу (отек) крыс с индуцированной ишемией, которая служит в качестве дополнительного контроля эксперимента. Фигура 3 "A" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг буферного раствора внутривенно с реперфузией крови (n = 7); "B" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно с реперфузией крови (n = 7); и "C" относится к крысам, подвергшимся симуляции операции и получившим 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно (n = 8). 

Фигура 3 является графическим изображением данных контролируемого эксперимента по оценке влияния лиз-плазминогена на неврологические дефициты крыс с индуцированной ишемией. Общий счет основан на индивидуальных оценках состояния сознания, походки, мышечного тонуса и поведения (среднее значение из 3 суток на животное). Максимальный счет равен 54 (n = 10 на группу). "A" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 500 ед/кг лиз-плазминогена внутривенно с реперфузией крови; "B" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно с реперфузией крови; и "C" относится к крысам, подвергшимся симуляции операции и получившим 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно (AB p < 0,01; BC p < 0,001; AC p < 0,05).

Фигура 4 является графическим изображением данных эксперимента по оценке влияния буферного раствора на неврологические дефициты крыс с индуцированной ишемией, которая служит в качестве дополнительного контроля эксперимента Фигура 5. Общий счет основан на индивидуальных оценках состояния сознания, походки, мышечного тонуса и поведения (среднее значение из 3 суток на животное). Максимальный счет равен 54 (n = 6 на группу). "A" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг буферного раствора с реперфузией крови; "B" относится к крысам с ишемией, вызванной хирургически, которые получили 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно с реперфузией крови; и "C" относится к крысам, подвергшимся симуляции операции и получившим 1,0 мл/кг изотонического солевого раствора внутривенно.



Подробное описание предпочтительных вариантов изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает лечение ишемических приступов, включающих церебральную ишемию и реперфузионное повреждение, связанное с ишемическими приступами. Кроме того, настоящее изобретение позволяет лечить ишемические приступы таким образом, чтобы избежать или свести к минимуму вредные эффекты, связанные с традиционным лечением, такие как реперфузионное повреждение. Термин "лечение" в его различных грамматических формах относится к предупреждению, облегчению, минимизации или излечению болезней или других вредных состояний.

Было обнаружено, что плазмин и плазмин-образующие протеины, в группу которых входит лиз-плазминоген, предварительно активированный профермент плазмина, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, чтобы ослабить (или избежать) реперфузионное повреждение, следующее за ишемическим приступом. Этот положительный эффект может быть получен даже когда реперфузия уже началась.

Собственно лиз-плазминоген может использоваться при лечении. Все формы лиз-плазминогена считаются пригодными для использования в этом изобретении, поскольку они сохраняют способность к описанным выше положительным эффектам. Также пригодными для использования согласно настоящему изобретению являются фрагменты лиз-плазминогена и различные варианты лиз-плазминогена, такие как аналоги, производные, мутеины и имитации природной молекулы, которые сохраняют способность проявлять описанные выше преимущества.

Фрагменты лиз-плазминогена относятся к частям аминокислотной последовательности полипептида лиз-плазминогена. Эти фрагменты могут генерироваться непосредственно из самого лиз-плазминогена путем химического расщепления, протеолитического ферментного переваривания или с помощью комбинации этих методов. Дополнительно такие фрагменты могут быть созданы с помощью рекомбинантных методик, использующих геномный или к-ДНК-клонирующий методы. Кроме того, также существуют методы синтеза полипептидов непосредственно из аминокислотных остатков. Варианты лиз-плазминогена могут быть получены этими или другими методами. Могут быть применены сайт-специфичесике и регион-направленные методики мутагенеза. Смотри книги "Текущие протоколы в молекулярной биологии", том 1, глава 8 /редактор Аусюбел и др., фирма Дж. Уидей энд Санх, 1989 и Приложение 1990 - 93 гг./, "Инжиниринг протеина"/ ред. Оксендер и Фокс, фирма Эй Лисс Инк. 1987/. В дополнение для мутагенеза могут применяться методики линкер-сканирования и промежуточного ПИ-Си-Ар смотри книгу "Технология Пи-Си-Ар" /ред. Эрлих, фирма Стоктон Пресс 1989/, "Текущие протоколы в молекулярной биологии", т. 1 и 2 /цит. выше/, не-пептидные соединения, которые имитируют связывание и функции пептида /"миметики"/, могут быть получены с помощью подхода, разработанного в статье Сарагова и др., Science т. 253, с. 792 - 95, 1991. Определение последовательности протеина, структура и подходы моделирования для использования с любой из указанных выше методик описаны в цитированных выше книгах "Инжиниринг протеина" и "Текущие протоколы в молекулярной биологии", т. 1 и 2.

Когда желаемый фрагмент или вариант лиз-плазминогена получен, описанные здесь методики могут быть использованы для определения того, является ли этот фрагмент или вариант эффективным для указанных выше видов терапии, таких как лечение реперфузионного повреждения, и если да, то идентифицируют при соответствующем интервале дозирования. Описанная в следующем примере модель удара крысы является простым и низкозатратным способом осуществления этого испытания в организме.

Настоящее изобретение также охватывает применение предшественников лиз-плазминогена, а также веществ, которые воздействуют на предшественник лиз-плазминогена, чтобы генерировать лиз-плазминоген. Веществом, осуществляющим такое протеолитическое расщепление, является плазмин, применение которого входит в объем защиты этого изобретения, как отмечено выше. Эта модель удара крысы, описанная ниже, также является полезной для оценки эффективности предшественников лиз-плазминогена.

Лиз-плазминоген может быть получен путем протеолитического расщепления глу-плазминогена с целью удаления аминокислотных последовательностей из глу-плазминогена. Способы получения лиз-плазминогена весьма подробно описаны в заявке на Европатент 0353218. Смотри также работу Neuwenhuizen, указанную выше.

Представленный ниже пример демонстрирует неизвестное ранее действие лиз-плазминогена, которое свидетельствует о его эффективности, эффективности вариантов и предшественников лиз-плазминогена, также как и плазмина и плазмин-образующих протеинов при лечении реперфузионного повреждения. До настоящего времени функция лиз-плазминогена была известна только в связи с фибринолизом. Оказалось неожиданным, что плазмин или любой плазмин-образующий блок, такой как лиз-плазминоген, способен преодолевать гематоэнцефалический барьер, что, как предполагали, является необходимым для проявления эффекта на участке, где имеют место мозговые ишемические явления.

Существуют также и другие аспекты применения лиз-плазминогена. Лиз-плазминоген помогает при лечении больных после остановки сердца. Введение лиз-плазминогена может предотвратить ишемическое повреждение нервных клеток. Лиз-плазминоген может быть использован также при лечении ишемии всего организма (шока), ишемии кишечника и нижних конечностей и для предупреждения ишемии органов, предназначенных для трансплантации.

Способы лечения включают в себя таковые, применяемые для рассасывания тромба и обычно назначаемые внутривенным способом. Дозировка лиз-плазминогена, который будет применяться по этому изобретению, должна основываться на весе пациента, причем вводятся дозы примерно от 10 до 1000 казеинолитических единиц" /"ЕК" на 1 кг. Предпочтительно, дозировка должна быть примерно от 100 до 600 ЕК/кг, и более предпочтительно она должна составлять примерно 500 ЕК/кг. Лиз-плазминоген может вводиться во время реперфузии крови, которая будет происходить, когда лиз-плазминоген назначается наряду с традиционным лечением путем разложения тромба, таким как активация тканевого плазминогена. Дополнительно, еще может быть получен выгодный эффект от лиз-плазминогена, когда он вводится после того, как реперфузия уже началась. Предпочтительно, лиз-плазминоген должен назначаться до реперфузии или в пределах 30 минут после ее начала. Лиз-плазминогеновые варианты и предшественники должны назначаться в дозах, которые дают тот же эффект, что и рассмотренные выше интервалы дозировок.

Лечение в соответствии с настоящим изобретением может быть выгодно осуществлено путем назначения описанных выше соединений в виде композиций для инъекций. Типичная композиция для такой цели включает фармацевтически приемлемый носитель. В этом контексте примером композиции является: буферный носитель лиз-плазминогена /9 г/л хлорида натрия, 1 г/л тринатрийцитрата. 2H2O, 3 г/л 1 - лизина, 6 г/л двухводного натрийдигидрофосфата и 40000 ед. К1/л /апротонина/. Фармацевтически приемлемые носители в этом контексте включают другие водные растворы, нетоксичные вспомогательные средства, включающие соли, предохранители, буферные растворы и тому подобное, как описано в Ремингтоновском справочнике фармацевтических наук, 15-е издание, Истон, фирма Мак Паблишинг Ко., с. 1405 - 1412 и 1416 - 87 /1975/ и в Национальном формуляре XIV, 14-е издание, Вашингтон, Американская фармацевтическая Ассоциация /1975/, содержание которых включено в эту заявку со ссылкой. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и органические эфиры, пригодные для инъекций, такие как этилолеат. Водные носители включают воды, спиртово-водные растворы, растворы хлористого натрия, парэнтеральные носители, такие как физиологический раствор, декстроза Ринджерса и др. Внутривенные носители включают жидкость и питательные заполнители. Предохранители включают противомикробные антиокислительные и хелатирующие агенты, и инертные газы. Значение pH и точная концентрация различных компонентов связующей композиции устанавливаются в соответствии с обычным опытом работы в этой области. Смотри справочник Гудмана и Гилманса, Фармацевтические основы для терапевта, 7-е издание.

Далее приводятся примеры выполнения согласно изобретению, не ограничивающие изобретений.

Пример 1. Влияние лиз-плазминогена на осложнение церебральной ишемии у крыс.

В этой серии экспериментов было оценено влияние лиз-плазминогена на осложнение экспериментально индуцированной ишемии у крыс. Для установления неврологических последствий ишемии были использованы два различных подхода. Ишемия была индуцирована у крыс так, как описано ниже.

Сначала самцов крыс Спрагу-Доулей /весом 300 - 400 г/ подвергали анестезии 350 мг/кг хлораль-гидрата, внутривенно, и затем в яремную вену вставляли катетер. Через этот яремный катетер выводили пять миллилитров крови /100 иммунизирующих единиц гепарина в шпице/, для того, чтобы снизить среднее артериальное давление крови до 50 мм рт. ст. Препарированные каротидные артерии обнажают и зажимают одновременно с отводом крови. Зажимы удаляют спустя период 30 минут, и выведенная кровь вновь вливается /реперфузия/. На рану накладывается фибриновый уплотнитель /зарегистрированный торговый знак "Тиссиил"/. Животных выдерживают в состоянии анестезии суммарно в течение 24 часов /23,5 часа после реперфузии/. После возвращения сознания каждого из животных подвергали следующим процедурам:

Оценка отека мозга

Животных выдерживали при постоянной температуре тела суммарно в течение 24 часов, умерщвляли их эфиром и удаляли мозг. Оценку отека мозга осуществляли, используя видоизменения методов, опубликованных для других животных /Ох и Бетц, Stroke, том 22, с. 915 - 21, 1991/.

Содержание влаги, которое является превосходным параметром для оценивания отека мозга, индуцированного ишемией/реперфузией, определяли следующим образом. Обе полусферы мозга взвешивали, высушивали в течение 17 часов при 200oC и повторно взвешивали. Содержание влаги рассчитывали в процентах от общего веса влаги в соответствии со следующей формулой:

(Вес влаги - Сухой вес) / Вес влаги 100

Оценка неврологических дефицитов

Неврологические дефициты животных оценивались на первые, вторые и третьи сутки после операции. /Ваукуайер и др., Нейрофармакология, т. 28, с. 837 - 46, 1989/. Состояние сознания, походка, мышечный тонус, поведение на ведущей наверх лестнице под углом 45o, и поведение на вертикально смонтированном вращающемся диске было оценено на основе системы счета, показанной в Таблице 1. Рассчитывалась сумма очков за трое суток /максимальная сумма очков равна 54/.

Лиз-плазминоген /фирма Иммуно Эй-Джи/ вводился внутривенно с помощью катетера либо в яремную, либо в хвостовую вену. Эти вливания были осуществлены в возрастающих концентрациях, в различные моменты времени. Ишемические животные, обработанные только изотоническим физиологическим раствором, служили в качестве положительного контроля, в то время как животные, подвергнутые имитации операции и обработанные изотоническим физиологическим раствором, служили в качестве отрицательного контроля. Описанный выше лиз-плазминогеновый буферный раствор был испытан с использованием каждой из этих методик в отдельных экспериментах. Обобщение дозировок, схемы назначения, экспериментальных методик и результатов представлено в Таблице 2.

Результаты для 500 ЕК/кг лиз-плазминогена (и буферного раствора, используемого в качестве контроля) показаны на Фигурах 3 и 4 для отека и на Фигурах 5 и 6 для неврологических дефицитов. Величины значимости основаны на t-испытаниях для отека и испытании Крускал-Уэллиса в предположении распределения хи-квадрат для неврологических дефицитов.

Дозировка 500 ЕК/кг лиз-плазминогена демонстрирует значительный положительный эффект на последствия экспериментально индуцированной ишемии у крыс. Схема назначения не играет существенной роли. Примечательно, что лиз-плазминоген еще оказывает защитное действие, даже если он вводится спустя 30 минут после начала реперфузии. Это сильно отличается от результатов, полученных для стандартного терапевтического средства флунаризина, который является антагонистом кальция, применяемым в клинической практике. Флунаризин /0,63 мг/кг, заданных внутривенно/ был эффективным при введении с реперфузионной кровью, но не оказывает действия при введении спустя 30 минут после реперфузии /данные не приведены/.

Лиз-плазминоген /500 ЕК/кг/ способен обращать эффекты от церебральной ишемии, что оценивалось на основании отека мозга и неврологических дефицитов в экспериментальной ишемии на модели крысы. Применяемый в препарате лиз-плазминогена буферный раствор не оказывал эффекта. В противоположность стандартному терапевтическому средству /флунаризину/, лиз-плазминоген был эффективен даже при введении через 30 минут после реперфузии.

Пример 2. Эффект лиз-плазминогена на хирургические методики.

Обычно хирургические методики включают прекращение потока крови к некоторым органам или тканям, что обычно осуществляется с помощью зажимов. Это прекращение потока крови к оперируемому органу или ткани приводит к ишемическому состоянию, которое развивается внутри органа или ткани, что в последующем может привести к реперфузионному повреждению после возобновления потока крови. Это ишемическое состояние и последующее реперфузионное повреждение являются особенно проблематичным при хирургических операциях, которые включают трансплантацию органов или тканей реципиенту.

Трансплантация включает длительный период изоляции органа или ткани, подлежащих трансплантации, особенно когда используются органы или ткани аллогенного или ксеногенного донора. Эта изоляция вызывает прекращение потока крови внутри органа или ткани, которая следует за удалением органа или ткани из тела донора. Изолирование и удаление вызывают ишемию внутри органа или ткани, подлежащих трансплантации. Возобновление потока крови в трансплантируемый орган или ткань в ходе завершения операции может вызвать реперфузионное повреждение, которое происходит внутри органа или ткани, а также в окружающих органах и тканях реципиента. При ситуациях, подобных трансплантации почки, когда донор часто живой и таковым остается, область тела донора, окружающая удаленную почку, также должна быть защищена от ишемии и реперфузионного повреждения.

В соответствии с настоящим изобретением, ишемические состояния и последующее реперфузионное повреждение, вызванные хирургическими методиками, могут быть предотвращены или вылечены белками, имеющими эффект лиз-плазминогена или предшественников лиз-плазминогена. Такие протеины могут даже проявлять выгодное воздействие на трансплантированные донором органы или ткани, а также на окружающие органы и ткани донора и реципиента. Введение протеинов, имеющих эффект лиз-плазминогена или предшественников лиз-плазминогена, позволяет органам и тканям выдержать продолжительные периоды ишемии, а также физиологический стресс, вызванный реперфузией.

Повреждение органов и ткани могут быть снижены или предотвращены в целом посредством назначения протеинов, имеющих эффект лиз-плазминогена или предшественников лиз-плазминогена до начала хирургической процедуры. В случае трансплантаций, протеины согласно настоящему изобретению могут быть введены донору до удаления органа или ткани. Донор может быть обработан системно или локально внутрь артерии, питающей орган или ткань, до удаления этого органа или ткани. Аналогично, реципиенты органа или ткани могут быть обработаны до трансплантации, для того, чтобы защитить органы или ткани, окружающие область трансплантации, а также орган или ткань, помещаемые внутрь реципиента. Протеины, имеющие эффект лиз-плазминогена или предшественников лиз-плазминогена, также могут вводиться во время или после реперфузии.

Предпочтительно, лиз-плазминоген назначается для лечения реперфузионного повреждения. Эффективная доза лиз-плазминогена, которая вводится системно, должна изменяться от 10 до 1000 ЕК/кг. Предпочтительно дозировка должна быть примерно от 100 до 600 ЕК/кг и более предпочтительно дозировка должна быть около 500 ЕК/кг. Когда применяется местное назначение, то дозировка должна рассчитываться по приблизительной системной, описанной выше, в подлежащей обработке области.

Следует понимать, что описание, фигуры и конкретные примеры, хотя указывают предпочтительные варианты изобретения, они даны с целью иллюстрации и не ограничивают настоящего изобретения. Различные варианты и модификации в пределах предмета и объема изобретения станут очевидны специалистам в этой области из имеющегося здесь описания и раскрытия. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Применение лиз-плазминогена в качестве активного начала фармацевтической композиции для лечения реперфузионного повреждения у больного с риском возникновения указанного повреждения.

2. Применение по п.1, для лечения ишемии и сопутствующего ей реперфузионного повреждения, реперфузионного повреждения после ишемического приступа, повреждения тканей после реперфузии и отека мозга.

3. Применение по п.1 для улучшения микроциркуляции и лечения реперфузионного повреждения у больного с риском нарушения микроциркуляции.

4. Применение по п.1 больному, чувствительному к реперфузионному повреждению.

5. Применение по п.4 больному с приступом или с перенесенным ранее приступом.

6. Применение по п.4 больному с инфарктом или с перенесенным ранее инфарктом.

7. Применение по п.4 больному, которому производят оперативное вмешательство или который перенес его ранее.

8. Применение по п.1 больному, у которого развивалось указанное повреждение.

9. Применение по п.1 больному, страдающему ишемией или инфарктом.

10. Применение по п.9 больному, страдающему церебральной ишемией.

11. Применение по п. 9 больному, страдающему преходящими ишемическими приступами.

12. Применение по п.9 больному, которого подвергают оперативному вмешательству.

13. Применение по п.1 хирургическому больному.

14. Применение по п.13 хирургическому больному до, во время и после оперативного вмешательства.

15. Применение по п.13 больному, которому производят трансплантацию ткани или органа.

16. Применение по п.1 для лечения реперфузионного повреждения у донора ткани или органа, предназначенного для трансплантации.

17. Применение по п.1, для лечения донора ткани или органа.

18. Применение по п.17 для системного введения указанному донору.

19. Применение по п.17 для местного нанесения указанного белка указанному донору.

20. Применение по п. 1 в фармацевтической композиции, содержащей 10 - 1000 казеинолитических единиц (CU) указанного лиз-плазминогена на кг веса больного.

21. Применение по п.20 в фармацевтической композиции, содержащей 100 - 600 казеинолитических единиц (CU) указанного лиз-плазминогена на кг веса больного.

22. Применение по п. 21 в фармацевтической композиции, содержащей 500 казеинолитических единиц (CU) указанного лиз-плазминогена на кг веса больного.

23. Применение по пп.20, 21 или 22 указанной композиции до, во время или примерно в течение 30 мин после начала реперфузии.

24. Фармацевтическая композиция для лечения реперфузионного повреждения, где указанная композиция содержит около 10 - 1000 казеинолитических единиц лиз-плазминогена/кг веса и фармацевтически приемлемый носитель.

25. Фармацевтическая композиция по п.24 для лечения больного с риском возникновения церебральной ишемии.

26. Фармацевтическая композиция по п. 24 для лечения реперфузионного повреждения, возникающего вследствие ишемического приступа или инфаркта.

27. Фармацевтическая композиция по п.26, вводимая больному, имеющему риск возникновения преходящих ишемических приступов.

28. Фармацевтическая композиция по п.27, вводимая до, во время или примерно в течение 30 мин после ишемического приступа или инфаркта.

29. Фармацевтическая композиция по пп.24 - 28, содержащая белок, выделенный из плазмы или полученный с помощью рекомбинантной методики.

30. Фармацевтическая композиция по пп.24 - 29, содержащая белок, обработанный с целью инактивации вирусов.

31. Фармацевтическая композиция по пп.24 - 30, дополнительно содержащая активатор плазминогена.

32. Фармацевтическая композиция по п.31, в которой указанный активатор плазминогена выбран из группы, состоящей из активатора плазминогена тканевого типа, активатора урокиназного типа, активатора проурокиназного и стрептокиназного типа.

33. Фармацевтическая композиция по пп.24 - 32, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.