ЭКСТРАКТЫ АКУЛЬЕГО ХРЯЩА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОКОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, АНТИАНГИОГЕННЫМ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ

ЭКСТРАКТЫ АКУЛЬЕГО ХРЯЩА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОКОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, АНТИАНГИОГЕННЫМ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ


RU (11) 2181292 (13) C2

(51) 7 A61K35/60 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.04.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 98110005/14 
(22) Дата подачи заявки: 1996.08.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1996.08.07 
(31) Номер конвенционной заявки: 08/550,003 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1995.10.30 
(33) Страна приоритета: US 
(43) Дата публикации заявки: 2000.06.20 
(45) Опубликовано: 2002.04.20 
(56) Аналоги изобретения: US 4473551 А, 25.09.1984. US 5075112 А, 24.12.1991. WO 92/10197 А, 25.06.1992. ЕР 0124984 A1, 14.11.1984. RU 2019180 C1, 15.09.1994. 
(71) Имя заявителя: ЛЕ ЛАБОРАТОРИЗ АЕТЕРНА ИНК. (CA) 
(72) Имя изобретателя: ДЮПОН Эрик (CA); БРАЗО Поль (CA); ЖЮНО Кристина (CA); МАЕС Даниель Х. (US); МАРЕНУС Кеннет (US) 
(73) Имя патентообладателя: ЛЕ ЛАБОРАТОРИЗ АЕТЕРНА ИНК. (CA) 
(74) Патентный поверенный: Лебедева Наталья Георгиевна 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 1998.06.01 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: CA 96/00549 (07.08.1996) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 97/16197 (09.05.1997) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Большая Спасская 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", Н.Г.Лебедевой 

(54) ЭКСТРАКТЫ АКУЛЬЕГО ХРЯЩА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОКОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, АНТИАНГИОГЕННЫМ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КОМПОЗИЦИИ 

Изобретение относится к хрящевым экстрактам и способу их получения. Способ включает стадии получения гомогената хряща в водном растворе, причем этот гомогенат разделяют на твердую фракцию (твердый экстракт) и жидкую фракцию, которую фракционируют для получения жидкого экстракта, содержащего молекулы с молекулярной массой, меньшей и равной 500 кД. Хрящевой экстракт можно применять для лечения многих заболеваний или состояний, которые включают компоненты, выбираемые из группы, состоящей из пролиферации опухоли, ангиогенеза, воспаления и коллагенолиза. В объем данного изобретения также входят некоторые косметические применения, основанные на способности жидкого экстракта улучшать функцию кожного барьера. Такие экстракты из акульего хряща имеют весьма перспективное терапевтическое значение. Технический результат: способ получения хрящевых экстрактов прост и эффективен. Непредвиденно ценные продукты, получаемые по этому способу, являются поэтому показателем нового и нетривиального способа. 27 с. и 17 з.п. ф-лы, 27 ил., 9 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Хрящ является бессосудистой тканью и исследуется как потенциальный кандидат, содержащий антиангиогенные факторы. Он также является тканью, которая относительно устойчива к развитию опухоли. Опухоль, связанная с хрящом - хондросаркома, также является наименее васкуляризованной опухолью из твердых опухолей. Ангиогенез является одним из важных факторов при развитии опухоли. Дискретные твердые опухолевые разрастания появляются, если опухолевые клетки могут вызывать расширение близлежащей сосудистой сети для обеспечения своей потребности в питании. Поэтому исследовалась роль факторов, вовлеченных в стимуляцию ангиогенеза, в развитии опухоли и антиангиогенных факторов, а также исследовались лекарственные средства, обладающие активностью ингибирования ангиогенеза, как средства для регулирования роста или осуществления регрессии опухолей.

Обнаружено, что скапулярный хрящ у кроликов содержит вещество, которое ингибирует васкуляризацию твердых опухолей (Langer et al., 1976). В силу обнадеживающих возможностей хряща как противоопухолевого средства ведутся поиски более обширных источников его поступления.

Акулы являются животными, представляющими потенциальный источник ингибитора ангиогенеза такого рода, поскольку их эндоскелет состоит исключительно из хряща (6% от массы их тела против 0,6% у телят). Акулы имеют также такое интересное свойство, как низкая предрасположенность к развитию опухолей. Предложено множество гипотез для объяснения такой низкой вероятности развития опухолей у акул. Marchalonis и др. (1990) указывают на антитела к IgM, способные сразу атаковать любой вторгающийся фактор. McKinney и др. (1990) отмечают, что акулы имеют макрофаги, способные дифференцировать нормальные клетки от опухолевых клеток и разрушать последние. Rosen и Woodhead (1980) постулируют, что малая распространенность опухолей среди пластиножаберных рыб (подкласс, к которому относятся акулы и скатовые) может иметь место из-за высокой ионной силы их тканей, что эквивалентно высокой температуре тела. Авторы считают, что при таких условиях иммунная система проявляет почти 100% иммунитет. Moore и др. (1993) обнаружили, что акулы продуцируют аминостерол, обладающий противомикробными и антипротозойными свойствами. Наконец, Lee и Langer (1983) и Folkman и Klagsbrun (1987) показали, что акулы продуцируют вещество, которое ингибирует образование новых сосудов. Lee и Langer (цит. выше) выделили это вещество посредством экстракции его из акульего хряща в условиях денатурации (экстракция гуанидином). Однако, этот способ экстракции очень длителен (41 сутки), может давать экстракты с денатурированными факторами, и выход активных компонентов весьма далек от отличного. Хотя активное вещество, выделенное из телят, имеет молекулярную массу примерно 16 килодальтон (кД), та же группа исследователей не приводит точного значения молекулярной массы для вещества, извлеченного из акул. Это вещество определяется только как вещество с молекулярной массой свыше 3500 Д. Oikawa и др. (1990) использовали тот же самый способ экстракции, который описан Lee и Langer, но гораздо меньшей продолжительности (2 суток вместо 41). Антиангиогенное вещество, выделенное из акульего хряща Oikawa и др., сводится к молекуле с молекулярной массой в интервале от 1000 до 10000 Д. Schinitsky (патент США 4473551) описывает водный экстракт неочищенного измельченного акульего хряща, фракция которого с молекулярной массой более 100000 Д обладает противовоспалительным действием одна или в комбинации с глюкозамином. В этом патенте не приводятся предположения о компоненте этого экстракта с антиангиогенной или противоопухолевой активностью. Kuetner и др. (патент США 4746729) выделили из бычьего хряща ингибитор полиморфно-ядерной нейтрофилэластазы (PMN). Этот ингибитор получен из водного экстракта хряща, в котором сохранены молекулы с молекулярной массой менее 50000 Д. Фракционирование на сефакриле S-200 дает многочисленные фракции, из которых собрали фракции в 10-40 кД, после того, как они показали противоэластазное действие. Активный компонент имеет изоэлектрическую точку 9,5 и может иметь молекулярную массу примерно 15000 Д. Kuetner и др. (патент США 4042457) также показали, что бычий хрящ содержит компонент с молекулярной массой менее 50000 Д, который обладает активностью ингибирования клеточной пролиферации без какого-либо действия на рост эндотелиальных клеток. Balassa и др. (патент США 4822607) получили хрящевой экстракт в водном растворе, который обладает противоопухолевой активностью. Однако, заявители не наблюдали антиангиогенной активности в экстракте, полученном при воспроизведении способа Balassa. Spilburg и др. (патент США 4243582) выделили из бычьего хряща (экстракция гуанидином) два гликопротеина с молекулярной массой 65 кД и рI 3,8, которые обнаруживают противотрипсионное действие и активность ингибирования роста эндотелиальных клеток.

Телячий и акулий хрящи содержат много биологически активных компонентов с такой активностью, как провоспалительная активность, противовоспалительная активность, антиангиогенная активность, лизоцимная активность, промотирующее действие на рост клеток, ингибирующее действие против коллагеназы типа I и IV, эластазы и других протеаз, подобных трипсину, химотрипсину и плазмину. Однако, пока никто не получал хрящевой экстракт, который обладает комплексом клинически полезных действий.

Антиангиогенный компонент (компоненты) акульего хряща обычно испытывают в тестах с кроличьим корнеальным карманом или с куриной хорионаллантоисной мембраной (САМ). До настоящего времени цельный измельченный в порошок хрящ испытывают на его антиангиогенное действие непосредственно на опухолях in vivo, на трансплантате меланомы человека, имплантированном голым мышам (патент США 5075112), а также испытывают в САМ-тестах. Даже, когда хрящевым экстрактам приписывается противоопухолевое действие, этот эффект наиболее часто приписывается антиангиогенному компоненту, который лишает опухоль кровоснабжения. До настоящего времени не является очевидным, что акулий хрящ оказывает непосредственное действие на пролиферацию опухолевых клеток.

Уже известны несколько способов получения экстрактов акульего хряща и фракций. Некоторыми из них получают измельченный в порошок неочищенный хрящ без какой-либо экстракции (патент США 5075112). В других используют денатурирующие агенты, подобные гуанидину (патент США 4243582). При некоторых способах осуществляется предварительная обработка хряща посредством ферментативного переваривания, чтобы избавиться от мышечных, нервных или сосудистых структур, окружающих хрящ, и за стадией предварительной обработки следует удаление жира в органических растворителях, а затем активные компоненты экстрагируют в водной фазе (Balassa и др., патенты США 3478146, 4350682, 4656137 и 4822607). Влияние такой предварительной обработки на сохранение целостности биологически активных компонентов хряща неизвестно. Если обработка слишком интенсивна, при ферментативном переваривании активные белковые компоненты могут гидролизоваться. Например, при способе Balassa (патент США 4822607) образуется жидкий экстракт, лишенный антиангиогенной активности; эта потеря может являться результатом такого ферментативного переваривания. Способ Balassa не включает стадию фракционирования, которая позволяет обогатить экстракт активными компонентами. При других способах просто получают водные экстракты хряща в воде (патент США 4473551) или в солевых растворах (патент США 4746729) посредством удаления нерастворимого вещества. В последних способах сохраняются, в особенности, специфические фракции определенной молекулярной массы для дальнейшего исследования и очистки (см. выше).

Цитированные выше способы имеют некоторые недостатки. При их осуществлении могут денатурироваться некоторые важные компоненты. Когда этого не происходит, недостатком может быть излишняя длительность, чтобы способ мог иметь практическое назначение. Кроме того, длительные способы совсем необязательно дают достаточное количество активных соединений, и среди извлеченных компонентов некоторые полезные компоненты отсутствуют совсем или их выход недостаточен, чтобы показать активность, которую можно обнаружить, или некоторыми из них пренебрегают, сосредоточивая внимание на получении определенной активности.

Ангиогенез является не единственным процессом, участвующим в развитии рака. Многие заболевания или состояния, поражающие различные физиологические системы (указаны в скобках), являются ангиогенеззависимыми, и их примерами являются артрит и атеросклеротические бляшки (кости и связки), диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, дегенерация желтого пятна, герпес глаз, трахома и реваскуляризация роговичного трансплантата (глаза), псориаз, склеродермия, розовые угри, гемангиома и гипертрофическое сморщивание (кожа), слипание сосудов и ангиофиброма (кровеносная система). Поэтому любой новый и потенциальный антиангиогенный "фактор" может найти применение при лечении таких заболеваний, а также при лечении рака и других ангиогенеззависимых заболеваний. Кроме того, так как многие из упомянутых выше заболеваний и состояний содержат также воспалительный компонент, любой новый и потенциальный противовоспалительный "фактор" может найти применение при лечении этих заболеваний и состояний, а также любых других воспалительных заболеваний или состояний. Кроме того, так как протеазы, подобные коллагеназам, из-за своей коллагенразрушающей активности участвуют в различных заболеваниях и состояниях, подобных раку и преждевременному старению, новый и потенциальный противоколлагенолитический "фактор" может найти применение при лечении заболеваний или состояний, содержащих коллагенолитический компонент. Поскольку агиогенез, воспаление и протеолиз могут встречаться по отдельности или в сочетании при очень многих заболеваниях или состояниях, продукт, способный противодействовать по меньшей мере активностям такого рода без воздействия на нормальные функции организма, имел бы большое терапевтическое значение.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения хрящевых экстрактов, преимуществом которых является содержание многих терапевтически важных показателей. Подтверждено, что из числа таких показателей антиангиогенная, противовоспалительная, противоколлагенолитическая активность, активность подавления пролиферации опухоли in vivo и прямого подавления пролиферации опухоли in vitro в достаточной степени существуют в экстракте акульего хряща. Ожидается идентификация или подтверждение других показателей. Все виды активности получены в жидком экстракте хряща акулы, а некоторые из них получены или подтверждены в твердых экстрактах акульего хряща.

Настоящее изобретение относится к новому способу получения жидкого экстракта хряща со значительной частью биологически активных водорастворимых компонентов, присутствующих в исходном хряще, включающему стадии:

а) гомогенизации хряща в водном растворе в условиях, совместимых с сохранением целостности указанных биологически активных компонентов, до тех пор, пока хрящ не измельчится до частиц, размер которых меньше или равен примерно 500 мкм, с образованием в результате смеси частиц и общего жидкого экстракта, содержащего указанные биологически активные компоненты;

б) центрифугирования указанного гомогената для отделения частиц от неочищенного жидкого экстракта; и

в) дополнительной сепарации неочищенного жидкого экстракта для получения конечного жидкого экстракта, содержащего молекулы хряща с молекулярной массой меньше или равной примерно 500 кД.

Преимуществом этого способа является легкость его осуществления и эффективность. Получают экстракт хряща с высоким выходом, и этот экстракт, полученный, в частности, из акульего хряща, имеет по меньшей мере все упомянутые выше биологические активности. Его осуществляют, предпочтительно, при низких температурах (примерно от 0 до 20oС), в условиях отсутствия денатурации (предпочтительно, в чистой воде), при приблизительно нейтральном рН (примерно 5-8), чтобы максимально увеличить вероятность извлечения соединений с неизвестными физико-химическими свойствами. По этому способу компоненты хряща можно экстрагировать в небольшом объеме растворителя (таком небольшом, как 1 л на 1 кг хряща), и после кратковременной гомогенизации (такой непродолжительной, как 10-20 мин). Для извлечения твердого экстракта используют ту же процедуру, за исключением того, что извлекают и лиофилизуют осадок, пренебрегая супернатантом.

Настоящее изобретение относится к хрящевым экстрактам, в частности, к экстрактам хрящей вида пластиножаберных, конкретнее - акул. Показана активность твердого экстракта. Он может содержать коллаген и нерастворимые в воде компоненты. Он также может содержать остаточную активность, несущие компоненты которой экстрагированы в общем жидком экстракте. Общий жидкий экстракт очень богат активными компонентами. Его можно использовать как таковой, или его можно сконцентрировать. Предпочтительна стадия концентрации, которая благоприятствует сохранению биологической активности. Предусмотрительно избегают обращения к способам, которые могут повредить активные компоненты, подобным выпариванию при нагревании. Для концентрации жидкого экстракта настоящего изобретения используют ультрафильтрацию через мембрану, отсекающую молекулярную массу примерно 1 кД. Для повышение биологической активности жидкого экстракта (антиангиогенной, противоколлагенолитической) даже лучше использовать нанофильтрацию на мембране, отсекающей примерно 100 Д. В результате испытывают концентрированный экстракт, содержащий молекулы с молекулярной массой примерно от 0,1 до примерно 500 кД.

Жидкий экстракт (0,1-500,0 кД) для характеризации его активных компонентов затем фракционируют. Многочисленные активные фракции получают различными способами. Некоторые из них, испытанные на их противоопухолевую активность на опухолевых клеточных линиях, чрезвычайно отличаются своей молекулярной массой и изоэлектрической точкой. У других установлена активность, в частности, противоколлагенолитическая или антиангиогенная. Предстоит полная характеризация и идентификация этих фракций. Следовательно, в общем жидком экстракте и его фракциях извлекаются важные активные компоненты, которые можно выгодно использовать. "Вместо" введения большого количества измельченного хряща теперь можно вводить более приемлемый и обогащенный экстракт.

Настоящее изобретение также относится к любой терапевтической или косметической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество одного из указанных выше хрящевых экстрактов. Наибольший интерес вызывают составы для применения в дерматологии и косметологии. Этот интерес проистекает от активности, наблюдаемой для хрящевых экстрактов. В этом отношении, наблюдаемые антиангиогенную, противоколлагенолитическую и противовоспалительную активность и противодействие клеточной дифференцировки, опосредованной каскадами сигнализации, подобно протеинкиназе С в кератиноцитах, рассматривают как открытую дорогу к применению экстрактов из акульего хряща в композициях и способах для ослабления воспаления или раздражения, регуляции образования морщин или атрофии кожи, замедления преждевременного старения, ослабления акне (угрей), улучшения функции кожного барьера, ослабления темных кругов вокруг глаз, снижения сосудистых звездочек и варикозного расширения вен, регрессии бородавок и успокаивающего действия на кожу. Такие способы входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, так как жидкий экстракт из акульего хряща успешно прошел испытания в случаях рака, артрита, псориаза и акне, композиции и способы для лечения заболеваний или состояний с одним или несколькими компонентами, выбранными из группы, состоящей из пролиферации опухоли, ангиогенеза, воспаления и коллагенолиза, входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение будет легче понять с помощью конкретных вариантов его осуществления, показанных на прилагаемых чертежах, целью которых является иллюстрация изобретения, но не ограничение его объема.

На фиг.1 показан специфический аминокислотный состав жидкого экстракта.

На фиг. 2 приводится зависимость ингибирующей активности акульего хряща (твердый экстракт) от дозы на клеточных линиях ZR75-1 и MCF-7.

На фиг. 3 приводятся кривые зависимости "доза-эффект" количества клеток MCF-7 в присутствии возрастающих концентраций эстрадиола без или с твердым хрящевым экстрактом (две концентрации).

На фиг. 4, а) и б), приводятся, для сравнения, срезы опухолей молочной железы крыс, которым вводили через зонд воду (А) или комбинацию твердого и жидкого хрящевого экстракта (Б).

Фиг. 5 представляет гистограмму, показывающую, что у крыс, обработанных хрящом, пространство васкуляризации в их опухоли уменьшается на 50%.

Фиг. 6 показывает, что жидкий хрящевой экстракт не действует на пролиферацию фибробластов.

На фиг. 7 приводится кривая зависимости "доза-эффект" для ингибирующего действия жидкого хрящевого экстракта на пролиферацию HUVEC.

Фиг.8 показывает, что жидкий хрящевой экстракт ингибирует индуцированную ТРА дифференцировку кератиноцитов.

На фиг. 9 приводится кривая зависимости "доза-эффект" для ингибирующего действия жидкого хрящевого экстракта на коллагеназную активность.

На фиг.10 приводится кривая зависимости "доза-эффект" для ингибирующего действия жидкого хрящевого экстракта при пробе на эмбриональную васкуляризацию (ex ovo).

Фиг. 11 показывает действие различных доз жидкого хрящевого экстракта на ингибирование роста опухоли у мышей.

Фиг. 12 показывает, что интераперитонеальное введение жидкого хрящевого экстракта может существенно увеличить эффективность средства для ингибирования роста опухоли.

Фиг. 13 представляет электрофоретический профиль в условиях отсутствия денатурации жидких фракций, разделенных на ротофоре; слева проставлены маркеры молекулярной массы образца жидкого экстракта до фракционирования для сравнения с выделенными фракциями.

На фиг. 14 дается картина передвижения при ВЭЖХ фракции полного жидкого экстракта с молекулярной массой менее 10000 Д, которая сконцентрирована и разделена на пять субфракций.

На фиг.15 приводятся результаты EVT, полученные с двумя фракциями жидкого экстракта из хряща акулы данного изобретения (DUP), причем одна фракция имеет молекулярную массу менее 10000 Д, а другая имеет молекулярную массу более 10000 Д.

На фиг. 16 дается картина передвижения при жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) трех различных фракций экстрактов из хряща акулы. На фиг. 16А DUP обозначает хрящевой жидкий экстракт по данному изобретению. На фиг. 16Б и 16В обозначения BAL и OIK означают экстракты известного уровня техники по Balassa и др. и Oikawa и др., соответственно.

На фиг. 17 приводится картина передвижения при ВЭЖХ тех же экстрактов, что на фиг.16.

На фиг. 18 приводятся для сравнения CZE жидкого экстракта настоящего изобретения и экстрактов известного уровня техники. 18А= DUP; 18Б=BAL; 18B= OIK.

На фиг. 19 приводится сравнение EVT жидкого экстракта настоящего изобретения и экстрактов известного уровня техники.

На фиг.20 сравнивается содержание аминокислот в экстрактах по настоящему изобретению и известного уровня техники.

Фиг. 21 иллюстрирует существенное улучшение состояния двух пациентов, страдающих от псориаза, одного с гиперкератозом (фиг.21а и 21б), а другого без гиперкератоза (фиг. 21в и 21 г), при лечении композицией для местного применения, содержащей эффективное количество концентрированного жидкого хрящевого экстракта (нижние фотографии), при сравнении с начальным состоянием (верхние фотографии).

Фиг. 22 показывает улучшение внешнего вида сосудистых звездочек на лицах людей, которых лечили жидким хрящевым экстрактом.

Фиг. 23 показывает улучшение внешнего вида темных кругов вокруг глаз людей, которых лечили жидким хрящевым экстрактом.

Фиг. 24 показывает улучшение внешнего вида при варикозном расширении вен на ногах у людей, которых лечили жидким хрящевым экстрактом.

Фиг.25 показывает существенное улучшение состояния пациента, страдающего от акне (угрей), при лечении композицией для местного применения, содержащей эффективное количество жидкого хрящевого экстракта (нижняя фотография), по сравнению с его первоначальным состоянием (верхняя фотография).

Фиг. 26 показывает противовоспалительное действие жидкого хрящевого экстракта на кожу человека.

Фиг.27 показывает улучшение барьерной функции кожи людей, которых лечили жидким хрящевым экстрактом.

В конкретном варианте осуществления изобретения хрящ получают от здоровых акул черной колючей собачей акулы и обыкновенной колючей собачей акулы. Всю мышечную и соединительную ткань удаляют посредством соскоба обработанными этанолом скальпелями и ножниц. Затем хрящ упаковывают в вакууме в пластиковые мешки и замораживают при -20oС для дальнейшего использования. В способе настоящего варианта осуществления изобретения можно использовать любой источник хряща. Заявители выбрали акулий хрящ по причинам, изложенным в разделе "Предпосылки создания изобретения". Предполагается, что если исходить из хряща пластиножаберных рыб (к которым относятся акулы и скаты как виды животных этого подкласса), можно получить почти эквивалентные продукты. Наиболее вероятно, что если использовать в качестве источника хряща хрящи млекопитающих, продукты будут различаться как по природе, так и по содержанию активных компонентов.

Можно использовать любой вариант получения хряща перед его экстракцией, до тех пор, пока этот вариант существенно не влияет на активность представляющего интерес продукта (общий жидкий экстракт или, например, его определенную фракцию). Некоторые активные компоненты могут быть устойчивы к протеолитическому перевариванию, как полагают Balassa и др. (патент США 4822607), которое освобождает хрящ от окружающих тканей, в то время как другие не могут сопротивляться такой обработке. Одним из активных компонентов, который оказывается неустойчивым при такой предварительной обработке, является компонент антиангиогенной активности (фиг.19). Поэтому, если желательно получить жидкий экстракт, содержащий все возможные растворимые в воде активные компоненты, которые обусловливают отдельные виды активности, тогда стадии переваривания в процедуре экстрагирования следует избегать или тщательно контролировать ее, чтобы предотвратить обширный гидролиз или протеолиз.

Получение хрящевых экстрактов

Используют свежий чистый хрящ, размороженный при 4oС, или замороженный. Затем хрящ несколько раз (точнее, более трех раз) пропускают через отверстия продезинфицированной этанолом мясорубки вместе с адекватным объемом воды (соответствующее количество (масса/объем) составляет примерно минимальный объем, но может быть увеличено без какого-либо влияния на выход при извлечении важных компонентов). Предпочтителен небольшой объем, так как с практической точки зрения с ним удобнее манипулировать, чем с ненужными большими объемами. На практике, воду очищают с помощью обратного осмоса и многократной фильтрации через фильтр 0,1 мкм. Вместо воды можно использовать многие водные растворы (например, содержащие соли). Когда имеется намерение извлечь большинство водорастворимых активных компонентов, предпочтительна работа при рН вблизи нейтрального (5,0-8,0) и при условиях, не вызывающих денатурацию, чтобы избежать лизиса или денатурации некоторых из активных компонентов хряща. Поведение неизвестных белков в водных растворах непредсказуемо; для некоторых более "удобным" будет кислый рН, для некоторых основной рН. Кроме того, некоторые белки могут оказаться экстрагируемыми в условиях умеренной денатурации, если такая денатурация не воздействует необратимо на ренатурацию этих белков в водных растворах. Для ясности, любое условие экстракции, которое совместимо с сохранением биологически активного водорастворимого компонента хряща, входит в объем настоящего изобретения. Поэтому, с учетом всех этих факторов, показано, что осуществление процесса экстрагирования активных хрящевых компонентов в чистой воде является разумным выбором для извлечения с очень хорошим выходом, причем компоненты должны иметь, к тому же, определенную структуру и поведение.

Смесь хряща с водой затем гомогенизируют посредством перемешивания при максимальной скорости в кухонном миксере при примерно 4oС в течение 20 мин; во время гомогенизации температура гомогената возрастает почти до 20oС. Конечно, скорость перемешивания, так же, как и объем водного раствора, могут влиять как на время, так и на выход при экстракции. Поэтому разумным интервалом времени гомогенизации (определенным для частиц менее 500 мкм) может быть время от небольшого - 10 мин до достаточно длительного (24 ч), предпочтительно - примерно от 10 до 60 мин. Температуру следует поддерживать ниже 10oС, чтобы избежать какого-либо разрушения активных компонентов эндогенными ферментами, когда не используют ферментный ингибитор. В идеале следует поддерживать температуру около 0oС. Так как обычно такой эксперимент осуществляют в холодильной камере, где можно поддерживать температуру от 4 до 10oС, этот интервал температур считается приемлемым в настоящем способе. Для ясности и краткости в дальнейшем для обозначения этого приемлемого интервала температур используется термин "примерно 4oС".

Затем можно осуществить разжижение этого гомогената путем обработки последнего в дезинтеграторе Polytron в течение 10 мин примерно при 4oС, если в миксере размер частиц уменьшился недостаточно. С другой стороны, смесь можно просто гомогенизировать в измельчителе-дезинтеграторе с более высокими эксплуатационными характеристиками, в котором, в нашем случае, экономия времени на стадии разжижения составляет 10 мин. По завершении стадии гомогенизации остаются частицы размером менее 500 мкм. Конечно, в равной степени применимы те же приемлемые интервалы времени и температуры, упомянутые для предварительного измельчения хряща. Нет необходимости в том, чтобы размер частиц после гомогенизации был слишком маленьким. Поэтому можно избежать трудностей размалывания хряща перед экстракцией. В самом деле, измельчение хряща до состояния порошка перед водной экстракцией может, наоборот, разрушить важные активные компоненты, особенно, когда такое измельчение осуществляют в состоянии, полученном при сушке вымораживанием и/или при горячей сушке.

Гомогенат центрифугируют при 13600хg в течение 15 мин примерно при 4oС, и эта стадия является одним из способов быстрого и эффективного отделения супернатанта от осадка. Методы изменения и регулирования этих параметров хорошо известны специалистам в этой области техники, причем зависят только от объема гомогената и используемого оборудования.

Получающийся в результате осадок лиофилизируют в течение 24-48 ч. Эта первая фракция в дальнейшем будет называться лиофилизатом или ТВЕРДЫМ ЭКСТРАКТОМ.

При необходимости, супернатант можно профильтровать через фильтр Whatman 24 мкм и очистить от частиц, на которые может повлиять обработка в колонке для ультрафильтрации. Отфильтрованный материал затем подвергают ультрафильтрации примерно при 4oС на колонке для проточной фильтрации вдоль потока с пористостью примерно 500 кД, что позволяет получить первый общий раствор, содержащий водорастворимые молекулы с молекулярной массой от 0 до, примерно, 500 кД. Этот неочищенный прошедший через колонку экстракт фильтруют через фильтр 0,22 мкм, и разливают аликвоты в стерильные флаконы для дальнейшего использования. Эта фракция далее будет называться неочищенным раствором или ЖИДКИМ ЭКСТРАКТОМ.

С другой стороны, для получения осадка и супернатанта была разработана методика более эффективного центрифугирования. Стадию центрифугирования при 13600хg в течение 15 мин, после которой следует грубая фильтрация через фильтры Whatman, заменяют центрифугированием на центрифуге СЕРА, снабженной нейлоновым мешком с порами 1 мкм, при 3000-4000хg. Таким способом препарат в 25 кг/25 л можно центрифугировать в течение 30 мин и получить 29 л супернатанта. Полученный водный объем больше, чем исходный объем воды, причем предполагается, что при этом собирается часть воды самого хряща. Лиофилизат и общий жидкий экстракт могут иметь приведенный далее приблизительный состав, в котором грубо приняты в расчет изменения, наблюдаемые от загрузки к загрузке и при использовании различных материалов.

ТВЕРДЫЙ ЭКСТРАКТ:

Липиды, %1 - 7,35

Белки, %2 - 46,2

Влагосодержание, % - 20,4

Натрий, мг/г3 - 4,16

Калий, мг/г - 2,64

Кальций, мг/г - 114

Магний, мг/г - 1,49

Цинк и железо - Следы

ЖИДКИЙ ЭКСТРАКТ:

Липиды, %1 - 0,10 - 0,20

Белки, мг/мл2 - 8 - 25

Масса в сухом состоянии, мг/мл - 8 - 25

Влагосодержание, % - 97 - 99

Натрий, мг/100 г3 - 30 - 220

Калий, мг/100 г - 30 - 40

Кальций, мг/100 г - 2,0

Магний, мг/100 г - 1,1

Цинк и железо - Следы

1,2 Измерено в соответствии с указаниями, опубликованными в АОАС Official (1984), разделы 16.219-220 и 2.055, соответственно.

3 Измерено в соответствии с методикой SAA.

Содержание белка оценивают по способу Кьельдаля, при котором на самом деле определяется органический азот (N). Органический азот конвертируют в эквивалентный белок, используя уравнение

Содержание белка (мг/мл)=(%N 6,25) / 100.

Поскольку углеводы не обнаруживаются, можно предположить, что они присутствуют в том или ином экстракте, но в форме протеогликанов и/или мукополисахаридов. Возможно, что эти соединения входят в измеренный уровень влагосодержания. Лиофилизат содержит неожиданный уровень влаги, который измеряют по ОН-группам. Так как содержание воды 20% приближается к процентному содержанию углеводов, обычно содержащихся в хряще, в то время как влагосодержание лиофилизата должно приближаться к 0%, эта гипотеза остается для подтверждения.

Жидкий хрящевой экстракт анализируют на содержание в нем аминокислот. Среднее количество всех аминокислот составляет приблизительно 1,1 мг на мл, причем по расчету свободных аминокислот 0,67 мг (61%), а на аминокислоты белкового происхождения приходится 0,44 мг (39%). Распределение аминокислот приводится на фиг.1. Также определяется значительное количество таурина (не показано).

Основные аминокислоты, присутствующие в жидком экстракте, представляют аминокислоты белков и пептидов хряща. Например, лизин, глицин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота составляют большую часть количества аминокислот в жидком экстракте и являются основными компонентами N-телопептидной внутримолекулярной поперечной связи в коллагене (Hanson et al. (1992) J. Bone & Min. Res. 7:1251-1258).

Предельное содержание микроорганизмов в жидком экстракте контролируют с использованием стандартов фармакопеи США ХХIII <61>.

Анализы активности

Твердый экстракт

Анализы in vitro

Эти анализы проводят на гормонозависимых раковых клеточных линиях MCF-7 и ZR75-1 (номера (R) 22-НТВ и 1500-CRL, соответственно).

Клетки ZR75-1

а. Основная среда RPMI. 52 г RPMI 1640 без фенолового красного (Sigma R8755), 17,875 г Hepes (свободная кислота; Sigma НО763), 0,55 г пирувата натрия (Sigma P5280) и 10 г NаНСОз смешивают в 5 л чистой воды и доводят рН до 7,40 с помощью NaOH.

Если этот раствор не используют сразу, его защищают от света, чтобы сохранить несветостойкие вещества. Этот раствор фильтруют, разливают в 500-мл стерильные флаконы и хранят при 4oС максимум в течение трех месяцев.

б. Среда, поддерживающая клеточную культуру. К основной среде RPMI добавляют 10% (о/о) FBS (сыворотка плода коровы), 100 Е пенициллина G/50 мкг стрептомицина сульфата (Sigma PО906) на мл среды, 2 мМ L-глутамина (Sigma G1517) и 1 нМ E2 (-эстрадиол, Sigma E8875).

в. Экспериментальная среда. К основной среде RPMI добавляют 5% FBSA ( сыворотка плода коровы, адсорбированная на нагруженной декстраном угольной пыли), 2 мМ L-глутамина, 100 Е пенициллина G /50 мкг стрептомицина сульфата на мл среды и 50 нг/мл инсулина (Sigma). К этой среде добавляют описанный выше лиофилизат в возрастающих концентрациях, а также Е2 в различной концентрации (10-12-10-5 М).

Клетки MCF-7.

а. Основная среда DME-F12. Воспроизводят в чистой воде среду DME-F12 (без бикарбоната и без фенолового красного; Sigma), следуя указаниям изготовителя. На 1л добавляют 1,2 г бикарбоната натрия и доводят рН до 7,40 с помощью NaOH/HCl. Этот раствор фильтруют, разливают в 500-мл стерильные флаконы и хранят при 4oС не более трех месяцев.

б. Среда, поддерживающая клеточную культуру. К основной среде DME-F12 добавляют 10% (о/о) FBS (сыворотка плода коровы), 100 Е пенициллина G / 50 мкг стрептомицина сульфата на мл среды, 2 мМ L-глутамина (Sigma) и 1 нМ Е2.

в. Экспериментальная среда. К основной среде DME-F12 добавляют 5% FBSA (сыворотка плода коровы, адсорбированная на нагруженной декстраном угольной пыли), 2 мМ L-глутамина, 100 Е пенициллина G / 50 мкг стрептомицина сульфата на мл среды и 50 нг/мл инсулина (Sigma). К этой среде добавляют, как описано для клеток ZR75-1, лиофилизат и Е2 в тех же концентрациях.

г. Получение FBSA. Сыворотку плода коровы смешивают с 1% (м/о) угольной пылью (уголь, обесцвечивающий щелочь). Добавляют к раствору сыворотки с угольной пылью раствор декстрана Т70 до достижения концентрации 0,1% (м/о). Смесь энергично перемешивают в течение ночи при 4oС. После центрифугирования при 4oС в течение 30 мин при 10000g сыворотку декантируют, снова смешивают в тех же соотношениях с угольной пылью и декстраном, энергично перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и снова центрифугируют. Затем сыворотку инактивируют посредством нагревания при 56oС в течение 20 мин, стерилизуют фильтрацией и разливают в стерильные конические пробирки Falcon.

Анализы экспериментальных культур и результаты

Клетки ZR75-1 и MCF-7 выращивают до достижения плотности популяции 20000 клеток/лунку на 24-луночных планшетах или 150000 клеток/лунку на 6-луночных планшетах, и обрабатывают в присутствии или в отсутствие различных концентраций лиофилизата, полученного как описано выше. Для этой цели твердый хрящевой экстракт ресуспендируют в культуральной среде и стерилизуют фильтрацией, так что извлекают водорастворимые компоненты, и испытывают. Все эксперименты повторяют трижды. Культуральные среды отбрасывают и заменяют новой средой каждые два дня. Клетки выращивают в инкубаторе в постоянно влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, при 37oС, в течение 17, 7, 3 или 3 суток, что соответствует первому, второму, третьему или четвертому эксперименту, соответственно. Ингибирование роста клеток замеряют посредством прямого подсчета клеток или посредством определения общего содержания ДНК в лунке (см. табл.1).

Приведенные выше проценты ингибирования роста клеток показывают, что твердый хрящевой экстракт может ингибировать рост клеток этих двух клеточных линий в зависимости от дозы.

Фиг.2 показывает, что дозы твердого экстракта в 50 и 100 мг/мл отчетливо вызывают гипоплазию на этих двух клеточных линиях после обработки в течение трех суток.

Фиг.3 показывает, что в присутствии 10-12-10-9 М эстрадиола обработанные клетки отвечают подобно контрольным клеткам - отсутствием стимулирования такими дозами гормона. Однако, при дозе свыше 1 нМ контрольные клетки сильно стимулируются, и концентрация ДНК в присутствии 10-7 М эстрадиола достигает 3,75 мкг (против 0,69 мкг при контроле без эстрадиола). В клетках, обработанных 30 и 50 мг/мл лиофилизата, количество ДНК при максимальной стимуляции составляет 1,9 и 1,8 мкг, соответственно. Фиг.3 показывает, что аффинная константа (Km) обработанных клеток для эстрадиола в 3 и в 16 раз выше (31,3 нМ и 174,0 нМ), чем величина Km контрольных клеток (11,7 нМ), в присутствии 30 и 50 мг/мл, соответственно. Это означает, что для достижения того же роста клеток в присутствии твердого хрящевого экстракта необходимы более высокие концентрации эстрадиола. Следовательно, этот экстракт ослабляет максимальный ответ (его ингибирование 90%) и увеличивает аффинную константу обработанных клеток к эстрадиолу.

Анализы in vivo

Крысиная модель рака молочной железы, индуцированного DMBA

а. Описание тест-системы. Четыреста 40-дневных самок крыс Sprague-Dawley закупаются у Charles River Co. (Сент-Констант, Квебек), адаптируются к окружающей среде в течение 12 дней. В это время им принудительно дают 20 мг DMBA (9,10-диметил-1,2-бензантрацен; закупается у Sigma Chemical Со.) в 1 мл кукурузного масла. Через три месяца после такой обработки отбирают 240 крыс с развивающимся раком молочной железы, и разделяют их на две группы. Первая группа состоит из пяти подгрупп крыс. Крысам обрабатываемых групп дают ежедневную дозу экстракта лиофилизата в 3 мл воды при возрастающей концентрации в течение восьми недель, в то время как контрольная группа получает воду в том же объеме. Вторая группа состоит из четырех подгрупп крыс. Крысам обрабатываемых групп также дают ежедневную дозу лиофилизата в 3 мл воды в сочетании с или без жидкого экстракта в течение десяти недель, в то время как контрольная группа получает воду в том же объеме. Только одну подгруппу второй группы обрабатывают лиофилизатом при концентрации 3000 мг/кг/день, и также дают 3 мл жидкого экстракта и интраперитонеальную (и.п.) инъекцию меньшей дозы жидкого экстракта (примерно 8 мг белка в 1 мл воды).

Крысы в начале двух экспериментов весят 151-175 г и получают пищу и воду ad libitum. У первой группы крыс средний диаметр опухолей составляет 0,9 см, в то время как у второй группы средний диаметр опухолей составляет 0,6 см.

б. Противоопухолевая активность. Результаты сводятся в табл.2.

Эти результаты показывают, что лиофилизат содержит активный компонент, который поглощается в желудочно-кишечном тракте и замедляет развитие опухоли. Это ингибирование может оказать прямое действие на опухолевые клетки или опосредованное антиангиогенезом действие, препятствующее росту опухоли.

Жидкий экстракт также содержит активный ингибирующий компонент, так как его введение вызывает дополнительное уменьшение размера опухоли примерно на 6%.

Эти результаты также наводят на мысль, что лиофилизат может содержать активные компоненты, которые не являются водорастворимыми, и/или что он может содержать остаточные водорастворимые активные компоненты. Поэтому, в свете последней возможности, можно считать, что осадок можно повторно экстрагировать в водном растворе, чтобы максимально извлечь водорастворимые компоненты, если еще можно улучшить выход.

в. Гистопатология. Для оценки нетоксичности твердого хрящевого экстракта животных, использованных в описанных выше экспериментах in vivo, умервщляют посредством декапитации, и берут на анализ следующие ткани: печень, легкое, почки, сердце, мозг, мышцу и молочные железы. Удаляют из этих тканей жир, после чего их фиксируют в течение двух суток в фиксаторе Буэна. После обезвоживания в этаноле фиксированные ткани заливают парафином. Получают их срезы, и готовят препараты для исследования на предметных стеклах, окрашивают гематоксилином и рассматривают под микроскопом.

Гистологический анализ показывает, что при использовании самых больших доз одного твердого экстракта или использовании твердого экстракта в сочетании с жидким экстрактом вредное воздействие не обнаруживается (данные не приводятся).

Это наводит на мысль, что лиофилизат и жидкий экстракт обладают селективной активностью регрессии размера опухоли.

В опухолях молочной железы (см. фиг.4, а и б) в группе крыс, получавших твердый и жидкий хрящевые экстракты, наблюдается существенное снижение (55%) площади кровеносных сосудов (фиг.5).

Уменьшение размера опухоли может происходить из-за уменьшения ее васкуляризации, непосредственного действия на опухолевые клетки или из-за сочетания обоих явлений. Антиангиогенное действие этих экстрактов хорошо обрисовано выше. Непосредственное гипоплазийное действие наблюдают на гормонозависимых клетках in vitro, что остается подтвердить in vivo.

Поскольку приведенные выше результаты показали, что жидкий экстракт обладает действием на клетки ZR75-1, превышающим действие твердого хрящевого экстракта, в дальнейшем исследуются его компоненты.

ЖИДКИЙ ЭКСТРАКТ

Анализ in vitro

Линии опухолевых клеток

Выращивают несколько опухолевых клеточных линий в присутствии жидкого хрящевого экстракта, чтобы проверить, присутствуют ли в нем компоненты с гипоплазийной активностью, что наблюдалось в случае твердого экстракта.

Коротко, клетки высевают в 96-луночные планшеты и выращивают в культуральной среде (специфической для каждого типа клеток; например, клетки MCF-7 выращивают так, как описано в разделе, приведенном выше) в присутствии различных концентраций жидкого экстракта или в его отсутствие. Пролиферацию клеток замеряют с использованием анализа с МТТ после 3-5 суток культивирования. Линии опухолевых клеток перечислены ниже.

CHANG - опухолевые гепатоциты;

Hep-G2 - опухолевые гепатоциты;

А2780 - клетки аденокарциномы яичников;

MCF-7 - клетки аденокарциномы молочной железы (экстроген-зависимые);

MCF-7-ADR - устойчивые к адриамицину клетки аденокарциномы молочной железы.

Жидкий хрящевой экстракт показывает антипролиферативную активность на всех опухолевых клеточных линиях. Самое сильное ингибирование - 50 и 80% - получают при концентрации 8,5 мг/мл (масса сухого вещества жидкого экстракта на мл культуральной среды) на клетках MCF-7 и А2780, соответственно.

Нелиофилизованный и лиофилизованный жидкие хрящевые экстракты равны по своим возможностям ингибировать пролиферацию опухолевых клеток. Это наводит на мысль, что ингибирующий фактор (факторы) не разрушаются при такой процедуре концентрирования.

Первичные культивированные клетки

а. Фибробласты из неоваскулярной глаукомы. Чтобы оценить специфичность действия на опухолевые клетки, раствор, полученный после ультрафильтрации, испытывают по отношению к клеткам мезинхимного происхождения - человеческим TENON-фибробластам (HTF), которые являются нормальными фибробластами. Используют только HTF от двух пациентов (один из них с неоваскулярной глаукомой - NVG, а другой с первичной открытоугольной глаукомой - POAG).

Субкультивирование и сохранение HTF. Каждую конфлюентную культуру переносят путем промывания и отделения 0,5 мл 0,05% трипсина/0,5 мМ ЭДТК (Gibco 610-5300 AG) в течение 5-10 мин при 37oС. Затем для нейтрализации трипсина/ЭДТК добавляют 1,5 мл Среды DME/F-12, содержащей 15% сыворотки плода коровы (FBS).

Ассоциацию клеток получают посредством измельчения и переноса на Т-матрасы в 25 см2, на которые добавляют еще среду, содержащую 10% FBS. После достижения слияния HTF переносят на 75-см2, а возможно - на 180-см2, Т-матрасы. Когда получат достаточное количество клеток, некоторые клетки используют для описанных ниже экспериментов, а другие в это время замораживают, чтобы сохранить идентичные пассажи для будущих экспериментов.

Протоколы экспериментов. Когда слияние достигается, клетки от одного пациента, растущие на двух или трех идентичных 180-см2 Т-матрасах, отделяют посредством описанной выше процедуры. После кратковременного центрифугирования при низкой скорости их подсчитывают с помощью счетчика ZM1 Coulter, снабженного объединителем каналов 256.

Во всех последующих экспериментах in vitro приблизительно пятьдесят тысяч клеток инокулируют в 1 мл среды DME/F-12, содержащей 1% FBS, в каждой 16-мм и 12-луночном планшете. Через 17 ч после посева добавляют 1 мл свежей идентичной среды, в которую добавлен 1% FBS ("абсолютный" контроль). В зависимости от замысла эксперимента (см. выше и ниже) в среду с 1% FBS добавляют или не добавляют GF (факторы роста) или жидкий хрящевой экстракт, и стерилизуют фильтрацией. В этот день (день 0) проводят подсчет клеток в некоторых образцах для определения эффективности культивирования (которая должна быть равной или превышать 95%).

Через 48 ч от начала экспериментов клетки промывают, отделяют и снова считают. Число клеток выражают как процент от клеток, полученных в группах "абсолютного" контроля.

Каждая "абсолютная" контрольная группа, содержащая 1% или 5% FBS, соответственно, и каждая экспериментальная группа с добавлением 1% FBS и отдельного GF или жидкого хрящевого экстракта, состоит из повторенных трижды образцов.

Каждый эксперимент осуществляют одновременно на клетках одного или двух пациентов и повторяют по меньшей мере дважды.

В этих экспериментах GF - свиной тромбоцитарный фактор роста (pPDGF) и человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (hr bFGF) (любезно предоставленный д-ру P.Brazeau фирмой Farmitalia Carlo Erba, Милан, Италия) добавляют в концентрации 10-100 нг/мл в 1% FBS, соответственно. Через 48 ч после начала эксперимента клетки разделяют с помощью трипсина/ЭДТК и считают на счетчике Coulter. При трехкратном повторе все величины (колонки 1, 2 и 3), находящиеся ниже, равны одной двадцатой отсчета на лунку.

Результаты. Результаты суммируются на фиг.6. HTF получают из глаукомы 53-летнего человека. Хотя факторы роста, подобные PDGF и bFGF, показывают стимулирующее действие на HTF (*Р<0,02, **Р<0,01; определены по тесту Стьюдента-Фишера), не получают ни положительного, ни отрицательного действия, когда эти клетки выращивают в присутствии жидкого хрящевого экстракта (1 кг/2 л). Это наводит на мысль, что гипоплазийная активность жидкого хрящевого экстракта в отношении опухолевых клеток не универсальна и не затрагивает рост фибробластов. Тот же хрящевой экстракт не оказывает действия на другой тип фибробластов - HSF (фибробласты кожи человека; данные не приводятся). Хотя испытания не проводились, предполагается, что твердый экстракт также не дает эффекта на здоровых клетках.

б. Эндотелиальные клетки из умбиликальной вены человека (HUVEC). Экстрагируют HUVEC регулируемым коллагеназой перевариванием, как описано в Jaffe et al. (1973). Перед четвертым пассажем (в каждом пассаже трипсин-ЭДТК) используют чистые эндотелиальные клетки. Клетки анализируют качественно на их способность включать диацеил-LDL и помечаться фактором vIII.

Эндотелиальные клетки высевают при плотности 2500 клеток на см2 в стерильные желатинизированные чашки Петри. Клетки культивируют в полной среде (ср199+гепарин (90 мкг/мл)+L-глутамин (2 мМ)+бикарбонат+FBS (10%)+ECGS (120 мкг/мл)) в течение 24 ч, чтобы обеспечить слипание клеток. Затем клетки промывают 3 раза ЗФР, и добавляют культуральную среду по условиям эксперимента. Последнюю промывку ЗФР принимают за время 0.

Каждый эксперимент повторяют трижды, и для сравнения осуществляют статистический анализ. Культуральную среду заменяют через 24 ч и в каждый последующий день. После 168-часового культивирования в каждую культуральную среду добавляют BrdU (конечная концентрация 10 мМ) и инкубируют 2 ч при 37oС. Затем клетки освобождают кратковременным перевариванием трипсином-ЭДТК и переносят в 96-луночные планшеты для обнаружения BrdU методом ELISA. ELISA осуществляют с набором и по методу Boehringer Mannheim. Осуществляют контроль без клеток для определения основного фонового уровня. Другой контроль осуществляют посредством измерения содержания ДНК в культуральной среде по окончании инкубационного периода, чтобы разобраться, воздействует ли жидкий хрящевой экстракт на слипание клеток.

Также оценивают пролиферацию клеток по количеству ДНК, присутствующей в чашках Петри. Каждый эксперимент повторяют трижды, и для сравнения осуществляют статистический анализ. Культуральную среду меняют ежедневно. После 168-часового культивирования клетки лизируют раствором цитрата Na-SDS и инкубируют с Хехст 33358. Получают информацию об образцах с помощью спектрофлуорометра при 365 нм.

Наконец, количество клеток, присутствующих в чашках Петри, оценивают также посредством измерения активности кислой фосфатазы. Каждый эксперимент повторяют трижды, и осуществляют для сравнения статистический анализ. Активность этого фермента убедительно коррелирует с числом эндотелиальных клеток в чашках Петри (включение BrdU и мечение Хехст; данные не приводятся). Активность кислой фосфатазы определяют с помощью набора от Sigma Chemical Company (в соответствии с методиками изготовителя и некоторыми изменениями).

Результаты показывают, что ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток зависит от дозы жидкого хрящевого экстракта (фиг.7). Полученная ED50 составляет приблизительно 90 мкл жидкого экстракта (эквивалентна приблизительно 1,5 мг сухой массы, присутствующей в жидком экстракте).

в. Кератиноциты. Жидкий хрящевой экстракт испытывают в отношении кератиноцитов, когда протеинкиназа С (РКС) активируется трифорболацетатом (ТРА) - известным агонистом каскада этой клеточной трансдукции. Эпидермальные кератиноциты здорового человека устанавливаются в качестве первичных культур (Matsui et al. (1992), J.Invest. Dermatol., 99:565-571). Культуры выращивают в бессывороточной среде (KGM), содержащей эпидермальный фактор роста (10 нг/мл), инсулин (5 мкг/мл), гидрокортизон (0,5 мкг/мл) и экстракт из коровьего гипофиза (70 мкг/мл) в модифицированной композиции MCDB 153.

Кератиноциты выращивают до 70% слияния и, после 48-час подпитывания свежей средой, обрабатывают либо 200 нг/мл ТРА, либо 2 мкл/мл ДМСО без дополнительной подпитки. В культуральную среду добавляют или не добавляют различные концентрации жидкого хрящевого экстракта. Результаты показывают отсутствие влияния жидкого экстракта на пролиферацию кератиноцитов; также не наблюдается действия на индуцированное ТРА ингибирование пролиферации. Однако, жидкий хрящевой экстракт способен ингибировать индуцированную ТРА дифференцировку кератиноцитов (фиг. 8). Уровень дифференцировки кератиноцитов под действием ТРА возрастает в 5 раз. Жидкий хрящевой экстракт сам по себе не влияет на образование кератинизированной оболочки. Однако, его присутствие ингибирует индуцированное ТРА образование кератизированной оболочки примерно более чем на 60%.

В недавно опубликованных работах показано, что активация РКС приводит нормальные кератиноциты к продуцированию возросшего количества интерлейкина-8 (IL-8) - посредника при воспалении (Chabot-Fletcher et al. (1994), J. Invest. Dermatol. , 103: 509-515). Кроме того, псориатические кератиноциты продуцируют очень большое количество TL-8, который затем промотирует образование новых сосудов в псориатических бляшках (Nickoloff et al. (1994), Am. J. Pathol. , 144:820-828). Вовлекаются также другие факторы роста и интегрины, и может оказаться важным расширить семейство молекул-мишеней, которые можно включить (I1-1, TNF и т.п.). Авторам изобретения неизвестно, стимулирует ли ТРА-индукция псориатические кератиноциты. Если это так, эти результаты предполагают, что хрящ может не действовать на псориатические (или активированные) кератиноциты. Ингибирование продуцирования IL-8 в индуцированных ТРА кератиноцитах, а также в псориатических бляшках или кератиноцитах жидким хрящевым экстрактом остается подтвердить. Пониженный уровень IL-8 и/или других факторов роста представляется интересной возможностью объяснения противовоспалительного и антиангиогенного действия этого экстракта.

Анализы с коллагеназой

а. Анализ 1. Этот анализ описан Knight et al. (1992), FEBS Let., 296, 263-266. В этом способе используется флуорогенный пептидный субстрат (Mca-pro-leu-glu-leu-Dpa-ala-arg-NH2), имитирующий активную область металлопротеиназ. Этот субстрат содержит флуореогенную группу (Мса) на одном конце и группу, гасящую флуоресценцию (Dpa), на другом. В интактном субстрате гасящая группа эффективно маскирует флуоресценцию. После ферментативного расщепления субстрата флуоресценция в экспериментальной пробирке возрастает.

Активация коллагеназы описана в Weingarten et al. (1985), Biochemistry, 24, 6730. Разводят 1 мкг до 100 мкл 50 мМ трис-HCl, 10 mm CaCl2, pH 7,5, добавляют 1 мкл раствора (10 мг/мл) трипсина (в 1 мМ НCl), инкубируют в течение 15 мин при 20oС. Активацию обрывают, добавляя 10 мкл соевого ингибитора трипсина (SBTI, 5 мг/мл). В каждую микрокювету добавляют

25 или 50 мкл ингибитора* (до 50 мкл доводят водой);

40 мкл 50 мМ трис-HCl, 200 мM NaCl, 10 мM CaCl2, pH 7,5;

8 мкл активированной коллагеназы** (всего 67 нг) и

2 мкл субстрата (1 мМ исходный раствор в ДМСО, конечный 20 мкМ).

Флуоресценцию регистрируют при ex =328 нм, em =393 нм.

* - ингибитором является контрольное вещество (например, ЭДТК, ортофенантролин) или жидкий хрящевой экстракт.

** - коллагеназа представляет человеческую коллагеназу типа I, типа IV и коллагеназу головастика амфибии; также используется желатиназа.

б. Анализ 2. Этот анализ описан в Welgus et al. (1979), JBC, 256, 9511-9516. Для проверки расщепления коллагеназой типа 1 (ММР1) в способе используется SDS-PAGE. Коллагеназа типа 1 производит единственный разрез в молекуле нативного коллагена с образованием двух фрагментов размером в 75% и 25% от исходного коллагена. После расщепления в течение нескольких часов реакцию контролируют посредством отделения продуктов от субстрата с помощью SDS-PAGE. Соотношение расщепленного и нерасщепленного коллагена оценивают визуально после окрашивания гелей Кумасси голубым (или серебряным красителем).

Добавляют 21 нг активированной коллагеназы (см. анализ 1) к 5 мкг коллагена кожи теленка (Worthington) +/ - ингибитор в конечном объеме 20 мкл. Реакционные смеси инкубируют в течение 16 ч при 35oС, затем реакции останавливают посредством добавления образца SDS-PAGE с 40 мМ ЭДТК, кипятят и загружают на 8% акриламидный гель.

В. Ингибирование в зависимости от дозы. Результаты, полученные с жидким хрящевым экстрактом, показывают в обоих анализах ингибирование, зависящее от дозы. На фиг.9 приводятся результаты, полученные при анализе 1. ED50 получают с 30 мкл жидкого экстракта (или 0,51 мг сухой массы, присутствующей в 30 мкл жидкого экстракта).

Анализы in vivo

Тест на зародышевую васкуляризацию (EVT)

а. Определение тест-системы. Нормальное развитие куриных эмбрионов включает образование наружной сосудистой системы, расположенной в желточной оболочке, которая несет питательные вещества от желтка (желтка яйца) к развивающемуся эмбриону. При размещении на желточной оболочке антиангиогенные вещества могут ингибировать развитие кровеносных сосудов, которое происходит в желточной оболочке. Для облегчения доступа к желтковой оболочке куриные эмбрионы переносят в стерильную камеру для культивирования (чашка Петри) и помещают в инкубатор с регулируемой влажностью и температурой. Затем эмбрионы развиваются в этих условиях ex ovo в течение нескольких дней.

Аликвоту жидкого хрящевого экстракта смешивают с раствором метилцеллюлозы и оставляют высыхать на воздухе до тонких дисков. Во время этой процедуры в концентратах жидкого хрящевого экстракта присутствует присущий ему NaCl и препятствует EVT, когда его количество на диск превышает 25 мкг. Поэтому может быть необходимым обессоливание жидкого экстракта; найдено, что приемлемыми способами являются диализ с мембраной, отсекающей менее 100 Д, или электродиализ.

Метилцеллюлоза образует инертную матрицу, из которой может постепенно диффундировать жидкий экстракт. Метилцеллюлозные диски, содержащие жидкий экстракт, помещают на внешнюю границу сосудистого периметра желточной оболочки, где еще активен ангиогенный процесс.

Действие содержащегося в дисках жидкого хрящевого экстракта на развитие ближайших сосудов всегда сравнивают с действием дисков, содержащих воду с добавлением эквимолярного количества NaCl. Диски помещают на желтковую оболочку эмбрионов в день 0 или день 1 процесса роста ех ovo; в этой точке желток занимают только начальные участки основных кровеносных сосудов. Затем эмбрионы помещают в условия культивирования до оценки васкуляризации (приблизительно 24 ч). Одновременно на желточную оболочку тех же эмбрионов всегда добавляют содержащие воду и жидкий экстракт диски. Оба диска располагают симметрично относительно цефалокаудальной оси эмбрионов, чтобы минимизировать межиндивидуумные изменения при сравнении экстрактов из хряща акулы с контрольными образцами.

б. Антиангиогенная активность. Осуществляют EVT с использованием различных концентраций протамина (37, 75 и 150 мкг), в качестве положительного контроля, или жидкого хрящевого экстракта. После культивирования в течение суток два сотрудника обычным слепым методом отмечают уровень васкуляризации на пространстве, закрытом диском. Для облегчения отметки местоположения дисков сразу после их нанесения на желточную оболочку вокруг размещают черное 0-образное кольцо. Шкала оценки при тесте EVT основана на показателях 1-2-3. (Показатель 3) Нормальная васкуляризация при сравнении с противоположным горизонтальным сектором или подобранным под пару сектором контрольного эмбриона; (показатель 2) кровеносные сосуды входят в пространство, закрытое диском, но исчезают на середине. Основные кровеносные сосуды пересекают пространство, закрытое диском, но их траектория очевидно изменяется, либо происходит уменьшение плотности бокового разветвления; (показатель 1) в пространстве, закрытом диском, не наблюдают кровеносных сосудов, либо их направленность быстро отклоняется, чтобы покинуть пространство, закрытое диском. Кровеносные сосуды не разрастаются ниже пространства, покрытого диском, за исключением случая, когда они обходят последнее и идут ниже него.

Получают ингибирование, зависимое от дозы, с протамином (данные не приводятся) и жидким хрящевым экстрактом (фиг.10). ED50 получают со 170 мкг жидкого экстракта (масса сухого вещества, присутствующего в жидком экстракте). Чтобы сравнить значимость различий между двумя дисками (вода и хрящевой экстракт), размещенными на одном и том же яйце, используют статистические испытания ранга, отмеченного Wilcoxon.

Мышиная модель аденокарциномы молочной железы

а. Описание тест-системы. Противоопухолевые возможности жидкого хрящевого экстракта испытывают на мышиной модели аденокарциномы молочной железы (аллотрансплантат). Тест-систему составляют мыши BALB/C, инокулированные подкожно 1106 клеток DA3. Эти клетки происходят от аденокарциномы молочной железы мыши, индуцированной 7,12-диметилбензантраценом (DMBA). Модель создана Даниелем Медина (J. Natl. Cancer Inst. (1969), 42:303-310; там же (1976): 57: 1185-1189). Инокулированные клетки постепенно растут in vivo и образуют твердую опухоль с прогнозом низкого уровня метастазов.

Клетки DА3 сохраняют в среде RPMI 1640 с добавлением 1 мМ меркаптоэтанола, 1 М буферного раствора Hepes, 100 мМ пирувата Na, 200 мМ L-глутамина, 10 мМ заменимых аминокислот, 1 М витаминов, 10% сыворотки плода коровы, 1% пенициллина-стрептомицина, при 37oС в присутствии 5% СO2. Для индуцирования опухоли клетки выращивают до 70% слияния в полной среде и затем собирают с использованием раствора трипсина-ЭДТК. Затем клетки центрифугируют и промывают три раза фосфатным буфером, и ресуспендируют при разведении 1106 клеток/0,1 мл.

Мыши, инокулированные клетками DА3 (n=15), получают ежесуточное пероральное введение жидкого экстракта из хряща акулы или плацебо (физиологический раствор). Обработку начинают через 7 дней после инокуляции DA3 клеток. Испытывают различные концентрации жидкого экстракта. Введенное количество жидкого экстракта выражают в виде количества сухого вещества, присутствующего в жидком экстракте. Продукты для испытаний получают так, как описано здесь: жидкий экстракт лиофилизируют и ресуспендируют в воде при различных концентрациях (0, 2, 1, 5, 3, 10 и 20 мг на 200 мкл). Конечные дозы, которые вводят ежесуточно, составляют 10, 75, 150, 500 и 1000 мг/кг массы тела.

б. Противоопухолевая активность. Результаты показывают, что максимальное ингибирование развития опухоли получают при введении примерно 75 мг/кг жидкого экстракта (фиг.11). Интересно, что большие дозы обладают меньшей силой. Это наводит на мысль, что жидкий экстракт содержит вещества, которые могут ингибировать развитие опухоли, и вещества, которые могут ингибировать действие ингибиторов опухолей. Уже сообщалось о таком явлении в случае биологических лекарственных средств.

Наконец, интраперитонеальное введение жидкого экстракта резко снижает (75х) максимальную эффективную дозу для ингибирования роста опухоли (фиг. 12).

в. Токсичность. При всех обработках не отмечаются потери в весе или смертельных исходов, связанных с жидким экстрактом. Не отмечается симптомов или изменений в поведении при ежедневном наблюдении за мышами в период обработки. По окончании обработки мышей умерщвляют, и дипломированный паталогоанатом анализирует общую морфологию всех органов; никаких отклонений не обнаруживается. Анализ крови не показывает каких-либо признаков отклонений от нормы.

г. Гистопатология. Гистопатология опухолей не показывает каких-либо общих различий между опухолями у мышей с плацебо или обработанных жидким экстрактом. Степень жизнеспособности опухоли достаточно высока во всех группах. Анализы различных органов (легких, печени, почек, поджелудочной железы, желудка, кишечника, яичников, молочной железы, головного мозга и сердца) не показывают каких-либо определенных изменений, которые можно связать с жидким экстрактом.

Мышиная модель повышенной чувствительности (CHS)

а. Описание тест-системы. Динитрофторбензол (DNFB) является сильным кожным раздражителем, который может вызвать сильную воспалительную реакцию у мышей BALB/C. В день 0 10 мышей сенсибилизируют посредством нанесения на живот DNFB. Через 5 дней после сенсибилизации мышам проводят контрольное заражение 10 мкл DNFB посредством нанесения на правое ухо. Затем через некоторые промежутки времени измеряют припухлость уха как показатель раздражения ткани.

Испытывают жидкий хрящевой экстракт, чтобы проверить, может ли он снижать воспалительную реакцию на DNFB у мыши. В течение 3 дней подряд перед сенсибилизацией и 4 последующих дней вводят перорально один носитель (0,2 мл физиологического раствора; 5 мышей) или жидкий экстракт (0,2 мл жидкого экстракта, содержащего 20 мг/мл сухой массы; 5 мышей).

б. Противоаллергическая активность. На следующий день после контрольного заражения мыши, обработанные одним носителем, показывают припухлость уха до 8,2 мм толщиной. Интересно, что мыши, обработанные хрящевым жидким экстрактом, показывают припухлость уха только 2,8 мм. Статистическая значимость этих данных имеет величину р <0,001. Эти результаты показывают, что жидкий хрящевой экстракт является сильным ингибитором воспаления.

Получение жидких фракций, содержащих активные молекулы

Анализы in vitro

Опухолевые клеточные линии

а. Получение тест-системы. Собирают акулий хрящ и обрабатывают так, как описано выше. После центрифугирования осадок отбрасывают, а супернатант подвергают ультрафильтрации, как описано выше, стерилизуя фильтрацией через фильтр 0,22 мкм. Полученный таким образом жидкий экстракт затем фракционируют различными способами. Опухолевые клеточные линии выращивают как описано в разделе, приведенном выше.

б. Условия FPLC (жидкостная экспресс-хроматография белков).

Колонка: Hiload, 26 мм60 см, сефакрил S-300. Система FPLC от Pharmacia. Перед загрузкой в колонку все образцы фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Буфер для элюирования представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР), фильтрованный и обезгаженный в течение 15 мин. Объем загружаемого образца обычно составляет 3,2 мл (может быть до 13 мл). Скорость потока составляет 1 мл/мин. Собирают фракции по 10 мл. Элюированные соединения обнаруживают по их УФ-поглощению (280 нм). Калибровочную кривую получают с помощью набора для калибровки MW-GF-1000 от Sigma, причем данный калибровочный образец имеет тот же объем, что и образец, загружаемый для анализа (3,2 мл). Объем элюирования образца устанавливают из графика зависимости молекулярной массы соединений из набора для калибровки от их объема элюирования, который вычитают из свободного объема колонки. Свободный объем получают путем впрыскивания декстранового синего (мол. м.=2000000).

Фракции испытывают на их активность на клетках ZR75-1. Идентифицируют представляющие интерес фракции и подтверждают их свойства другими исследованиями (см. ниже). Дополнительные исследования свойств проводят на ротофоре (Rotofor) (Biorad 170-2950; см. изоэлектрофокусирование, ниже) и фильтрах Amicon с различными отсекаемыми значениями для получения фракций с молекулярной массой 10-30 кД, 30-100 кД и свыше 100 кД.

в. Условия иэоэлектрофокусирования. Препарат жидкого экстракта акульего хряща (46 мл раствора 1 кг/л) диализуют в течение ночи при 4oС против 4 л чистой воды, содержащей 5% глицерина, с использованием мембраны Spectra, поры # 7, MWCO 3500 кД (Spectrum 132110). Диализованный раствор смешивают с 2,75 мл амфолитов (Pharmacia #80-1125-87), рН 3,5-10,0 и 0,5 г CHAPS (Sigma C3023; 3-[(3-хлорамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат). Объем доводят до 55 мл чистой водой. Этот раствор загружают на ротофор. Изоэлектрофокусирование проводят при 4oС, при постоянной мощности 12 В (источник питания 3000 xi, Biorad 165-0554), при непрерывной циркуляции воды для обеспечения поддержания температуры, В начале разделения напряжение составляет 380 Вт, а сила тока 31 мА. Когда сила тока стабилизируется (при 14 мА), напряжение составляет 870 В. Изоэлектрофокусирование останавливают и собирают 20 фракций (см. табл.3).

Идентификацию этих белков осуществляют посредством оценки их молекулярной массы на электрофоретическом геле (см. Laemmli, U.K. (1970), Nature (Lond.), 227:680).

Эти фракции разводят четыре раза буфером для загрузки (см. Laemmli), и аликвоты в 8 мкл подвергают электрофорезу в невосстанавливающих условиях. На фиг. 13 приводится электрофоретический профиль каждой фракции и материала до изоэлектрофокусирования.

Все фракции стерильно разливают во флаконы в вытяжном шкафу с ламинарным потоком, пропуская их через стерилизующий фильтр Millipack-60 с порами 0,22 мкм.

г. Ингибирующая активность по отношению к опухолевым клеткам. Содержание белка во фракциях оценивают с помощью метода дозировок Лоури. Растворы 1 кг/2 л (выраженные в виде общей массы хряща на литр раствора) испытывают на клетках ZR75-1 при различных концентрациях в культуральной среде. Результаты сводятся к следующему.

1-е испытание. Испытания проводят на ротофорных фракциях (раствор концентрируют испарением). Идентификация белка дается в табл.4.

2-е испытание осуществляют на фракциях FPLC (раствор концентрируют испарением): фракции 6 и 7; молекулярная масса - 0,1 - 2,5 кД.

3-е испытание осуществляют на 100-мкл фракциях, полученных на молекулярных фильтрах Amicon (см. табл.5).

Фракции FPLC 6 и 7 содержат активные компоненты с очень небольшой молекулярной массой - 0,1-2,5 кД.

Гипоплазийное действие фракций может до 33000 раз превышать действие, наблюдаемое в случае лиофилизата.

д. Дальнейшая идентификация активных компонентов элюата. Извлекают активные фракции (испытанные на клетках ZR75-1) с указанной далее молекулярной массой, определяют с помощью другого типа очистки, исходя из того же раствора (1 кг/л), на колонке с суперозой-12 диаметром 10 мм и длиной 30 см с использованием FFLC и процедур на ротофоре, описанных выше. Выбирают скорость потока 1 мл/мин. Собирают 45 фракций по 1 мл.

Фракции 20-21 - активность во фракциях, соответствующих молекулярной массе от 70 до 120 кД.

Фракция 22 - активность во фракциях, соответствующих молекулярной массе от 60 до 70 кД.

Фракции 29-32 - активность во фракциях, соответствующих молекулярной массе от 35 до 46 кД.

Фракции 34-35 - активность во фракциях, соответствующих молекулярной массе 29 кД.

Фракции 38-39 - активность во фракциях, соответствующих молекулярной массе от 0 до 2,5 кД.

Анализ с коллагеназой

а. Хроматография (ВЭЖХ). Образец жидкого экстракта (DUP) объемом 980 мл фильтруют через мембрану, отсекающую 10 кД, в установке для проточной ультрафильтрации вдоль потока (PELLICON, Millipore). Установку сначала промывают 1 л воды. Конечный выход составляет 480 мл фракции > 10кД и 1,8 л фракции < 10 кД. Фракцию > 10 кД концентрируют посредством испарения без нагревания до 180 мл (<10-10Х). Восемь раз 100-мкл аликвоты < 10-10Х загружают на CDC-S-гексил, 5-мкм ВЭЖХ-колонка (250,94 см) и элюируют сначала 100% Н2О при 4 мл/мин; а затем при 8,5 мл/мин 100% МеОН. Собирают фракции, соответствующие пикам OD214.

Собирают 5 фракций (фиг.14): фр1, фр2, фр3, фр4 и фр5. Первые три фракции включают по меньшей мере главный пик.

б. Противоколлагенолитическая активность. Результаты показывают, что фр1 является наиболее активной фракцией для ингибирования коллагеназы; во всех других фракциях уровень активности ниже: анализ 1 - см. фиг.14, анализ 2 - см. табл.6.

ЭДТК, 40 мМ, ингибирует коллагеназу. Общий жидкий экстракт DUP показывает низкую противоколлагенолитическую активность. Фракции 1-5 являются активными; наиболее активна фракция 1. Фракция с молекулярной массой свыше 10 кД не показывает существенной ингибирующей активности.

в. Другое определение противоколлагенолитического фактора. Жидкий хрящевой экстракт фракционируют с использованием прибора для проточной фильтрации вдоль потока и фильтра 10 кД (Pellicon, Millipore). Находят, что фильтрат (фракция < 10 кД) содержит все противоколлагеназные активные компоненты и в дальнейшем характеризуется следующим образом. Фракцию < 10 кД далее диализуют с использованием мембраны, отсекающей номинальную молекулярную массу 100 Д (Spectra/Por_ CE (эфир целлюлозы), MWCO: 100 Д, по каталогу 131015). Противоколлагенолитическую активность получают в фильтрате (фракция < 100 Д). Фракцию < 100 Д вносят в колонку С8 для хроматографии с обращенной фазой (ЕМ Science Lichroprep RP-8, по каталогу 9242) и элюируют Н2О, затем 60% метанолом и заканчивают 100% метанола. Основная масса активных коллагенолитических компонентов (98%) извлекается в элюате Н2О, причем 2% активности элюируется 60% метанола.

Итак, противоколлагенолитическая активность в экстракте обусловлена низкомолекулярным соединением (или соединениями), которые могут диализоваться или проходить через мембрану Spectra/Por_CE (эфир целлюлозы), MWCO: 100, и не адсорбируется на матриксе колонки С8 для хроматографии с обращенной фазой (Lichroprep_), когда вносится в Н2О.

Анализ in vivo

Тест на зародышевую васкуляризацию

Фракционируют жидкий хрящевой экстракт с использованием прибора для проточной фильтрации вдоль потока и фильтра 10 кД (Pellicon, Millipore). Фракции жидкого хрящевого экстракта меньше и больше 10 кД испытывают в одинаковых условиях. Они показывают равную силу (фиг.15) ингибирования образования новых сосудов. Это противоречит тому обстоятельству, что во фракции свыше 10 кД отсутствует противоколлагенолитическая активность.

а. Фракция < 10 кД. Антиангиогенный фактор в этой фракции проявляет себя во время стадий очистки, описанных выше, так же, как противоколлагенолитический фактор.

б. Фракция > 10 кД. Фракцию хроматографируют на колонке для гельпроникающей хроматографии (сефакрил S-300, Pharmacia). Фракцию (S300-4) с антиангиогенной активностью характеризуют с помощью SDS-PAGE. Активная фракция (S300-4) имеет несколько белковых полос с молекулярной массой в промежутке приблизительно от 8 до 18 кД (при сравнении с маркерными белками BioRad SDS-PAGE). Эту фракцию затем фракционируют, применяя анионообменную хроматографию (Mono-Q, Pharmacia) с использованием 25 мМ трис-HCl, рН 8,0, и градиента NaCl от 0 до 1,0 М. Фракция, элюирующаяся между 0,8 и 1,0 М NaCl, обладает антиангиогенной активностью. Фракции, элюирующиеся между 0,3 и 0,6 М NaCl и 0,08 и 0,2 М NaCl, имеют меньшую антиангиогенную активность.

Сравнение с продуктами известного уровня техники

Определение известного уровня техники

Поскольку авторы не первые, кто проявил большой интерес к хрящевым экстрактам, они подтверждают уникальный характер жидкого экстракта из хряща акулы, полученного по способу данного изобретения, параллельными сравнительными испытаниями с двумя продуктами, описанными или полученными на известном уровне техники, а именно, продуктами, полученными по способу Balassa (патент США 4822607) и способу Oikawa и др. (цит. выше).

Oikawa и др. описывают способ, с помощью которого получают две основные фракции, причем одна содержит молекулы с молекулярной массой от 1 до 10 кД, а другая содержит компоненты крупнее 10 кД. Авторы приписывают антиангиогенные свойства только первой фракции, причем упоминают, что у другой фракции отсутствует какая-либо антиангиогенная активность по тесту САМ. С целью адекватного сравнения с продуктами Oikawa авторы данного изобретения фракционируют свой общий жидкий экстракт на две соответствующие фракции и сохраняют фракцию в 0-10 кД.

Так как Balassa описывает способ экстракции общего жидкого экстракта, авторы сравнивают свой общий жидкий хрящевой экстракт (0-500 кД) с продуктом, полученным при воспроизведении способа Balassa, заменяя хрящ теленка как исходный материал на хрящ акулы.

Авторы данного изобретения полагают, что если Balassa и Oikawa описывают способ, эквивалентный настоящему способу, картины, получаемые при FPLC, ВЭЖХ и CZE, должны, по существу, совпадать, а при EVT должна обнаруживаться одинаковая антиангиогенная активность. Все образцы перед хроматографией FPLC и ВЭЖХ готовят с конечной концентрацией 12 мкг/мкл (масса в сухом состоянии /объем раствора). Продукт Oikawa перед хроматографией центрифугируют и фильтруют, поскольку он содержит нерастворимые вещества.

ПОЛУЧЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

Образцы акульего хряща, экстрагированные тремя способами, обозначают (с предварительной оценкой массы в сухом состоянии на объем раствора) следующим образом.

1) DUP представляет фракционированный препарат настоящего изобретения, который содержит молекулы в 0-500 кД (12 мкг/мкл);

2) BAL представляет препарат, соответствующий способу Balassa и др. (12 мкг/мкл);

3) OIK представляет препарат фракции 3 по Oikawa и др. Все образцы перед любым анализом получают с конечной концентрацией 12 мкг/мкл (масса в сухом состоянии/объем). Образец OIK содержит большое количество нерастворимых веществ, которые можно легко осадить центрифугированием при 13200 об/мин или отфильтровать через мембранный фильтр 0,2 мкм. Удаление нерастворимого вещества посредством фильтрации обязательно перед FPLC, ВЭЖХ и CZE (фиг.16, 17, 18).

СРАВНЕНИЕ ПРИ FPLC

Условия

Супероза 12 (Pharmacia); колонка для гельпроникающей хроматографии. Образцы пропускают через колонку для гельпроникающей хроматографии с суперозой 12 (10/30) с забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) в качестве элюента при скорости потока 0,5 мл/мин (скорость движения диаграммной бумаги 0,25 см/мин). Аликвоты в 100 мкл образцов с установленной концентрацией перед впрыскиванием фильтруют через мембранный фильтр 0,2 мкм. Контролируют OD280.

Колонку калибруют со следующими стандартами (мол. м. в Д): каталаза (232000), альдолаза (158000), альбумин (56000), овальбумин (44000), химотрипсин (25700), рибонуклеаза (13700), инсулин (5700), В-цепь инсулина (3500), А-цепь инсулина (2500), бацитрацин (1450), витамин В-12 (1335). Молекулярную массу основных пиков вычисляют с помощью уравнения Log10 MW=7,52-0,212 X RT, где RT - объем элюирования в мл. R2=0,976. Общий объем колонки (Vt) составляет 21,93 мл при определении с использованием цитидина (246 Д). Свободный объем (V0) при определении с синим декстраном (2106 Д) составляет 8,38 мл.

Краткое изложение результатов

На фиг. 16а) образец по изобретению DUP имеет первый основной пик (1), который элюируется при 18,76 мл, что дает молекулярную массу примерно 3500 Д. Последующие пики при 22,7 (2) и 27,3 (3) мл выходят за общий объем колонки (21,93 мл при определении с цитидином). Оказывается, что эти пики имеют некоторую аффинность к матриксу колонки.

На фиг.16б) образец по Balassa BAL имеет небольшой пик (1), элюирующийся вблизи Vo колонки (8,4 мл), пик (2) при 18,5 мл (4000 Д) и два пика, элюирующиеся после Vt - (3) - 22,6 мл и (4) - 28,2 мл.

На фиг.16в) образец по Oikawa OIK также имеет небольшой пик (1) при V0, пик (2) при 18,9 мл (3300 Д), пик (3) при 21,5 мл (1000 Д) и небольшой пик (4) при 27,3 мл.

При сравнении образцов достойно внимания, что, помимо пика 3500 Д, основные полосы (пики) образца DUP не наблюдаются при той же интенсивности в других образцах. Оказывается, что образец OIK имеет небольшой пик при 27,3 мл. Образец BAL имеет пик, перемещающийся к 28,2 мл, который может коррелировать с одним из второстепенных пиков в образце DUP.

СРАВНЕНИЕ ПРИ ВЭЖХ

Условия

Колонка CS-S-гексил, 5 мкм, 250,94 см, CSC #059-085; колонка для хроматографии с обращенной фазой.

Краткое изложение результатов

В случае гексил-колонки для ВЭЖХ с обращенной фазой одновременно контролируют OD210 и OD280. Загружают 50-мкл аликвоты центрифугированных образцов (все с 12 мкг/мл) и элюируют 100% Н2О. Обозначают пики на каждой хроматограмме, соответствующие OD210 (напр. , 1), и пики, соответствующие OD280 (напр., 1). V0 этой колонки 5,5 мл (1,4 мин).

На фиг 17а) DUP имеет 3 основных пика, которые наблюдаются при OD210 (1, 2 3), и 2 второстепенных пика (4, 5). Два пика наблюдают по сторонам пика 1, обозначенные 1а и 1б. Существенное поглощение при OD280 связывается с пиками 1, 1a, 1б и 3. При сравнении соответствующее OD280 поглощение в случае пика 2 значительно меньше относящегося к OD210.

На фиг. 17б) BAL показывает больше пиков OD210, но их интенсивность меньше по сравнению с пиками DUP. Поскольку перекрытие пиков может быть показателем идентичности молекул, оказывается, что только пики 3 и 7 в образце Balassa коррелируют с временами удерживания пиков в образце DUP (пик 1а или 1б, и пик 4, соответственно).

В экстракте OIK наблюдают только три основных пика (1, 2, 3) (фиг.17в). Пики 1 и 3 могут коррелировать с пиками 1 и 3 образца DUP, но пиков рядом с 1 на OIK-хроматограмме не отмечается. Высота пиков в образце OIK меньше, чем в случае DUP. Следовательно, картины FPLC и ВЭЖХ являются характеристиками различных продуктов.

СРАВНЕНИЕ ПО CZE

Условия

Аппаратура. Система Beckman (p/ace система 2050) с целевым программным обеспечением (версия 7.11 U); капилляр Silice (TSPO 50375), 50 мкм97 см; буфер - 2 М муравьиная кислота; сенсибилизирующий раствор - 5%, p/v, гексадиметренбромида и 2%, о/о, этиленгликоля в воде; детектор УФ (200 нм); ток 30 кВ; впрыскивание ~ 34,5 кПа (0,5 ф/д2), 20 секунд; температура 22oС.

Капилляр обрабатывают 1 М NaOH (~75,7 кПа (20 ф/д2), 10 мин), водой (75,7 кПа, 10 мин), сенсибилизирующим раствором (75,7 кПа, 20 мин) и буфером (75,7 кПа, 10 мин). Затем устанавливают рабочие условия: буфер (75,7 кПа, 2 мин), образец для впрыскивания (34,5 кПа, 20 с), рабочий режим (-30 кВ, 45 мин), 1 М NaOH (75,7 кПа, 3,5 мин), вода (75,7 кПа, 3,5 мин), сенсибилизирующий раствор (75,7 кПа, 4 мин) и буфер (75,7 кПа, 4 мин).

Каждый образец (BAL, DUP, фракция 3 OIK) ресуспендируют при 16,5 мг/мл. Величина рН каждого раствора составляет 7,1, 6,8 и 8,2 - BAL, DUP и OIK, соответственно. Концентрация NaCl в каждом растворе составляет 2,08, 4,37 и 0,71 мг/мл - в BAL, DUP и OIK, соответственно.

Краткое изложение результатов

Молекулярный профиль каждого образца (BAL, DUP и OIK-3) приводится на фиг. 18. Сравнение образцов DUP и BAL показывает, что образец BAL содержит большую часть пиков с % площади < 1. BAL и DUP делят пики при MT/EOF = 1,06, 1,54, 1,59, 1,66 и 3,22. Пики с соотношением 1,06, 1,54 и 3,22 имеют похожие % площади в BAL и DUP, в то время как пики с соотношением 1,59 (в DUP) в 8 раз более интенсивнее, чем в BAL, а при соотношении 1,66 наоборот.

Образцы DUP и OIK предоставляют весьма различающиеся электрохроматограммы. OIK имеет основной пик с несколькими второстепенными пиками. Ни один из этих пиков нельзя соотнести с пиками образца DUP.

СРАВНЕНИЕ ПО EVT

Антиангиогенный потенциал образцов DUP BAL и OIK анализируют по EVT (фиг.19). Существенной антиангиогенной активности в экстракте Balassa не находят. Общий экстракт DUP сравнивают с фракцией 3 в OIK no Oikawa. Как DUP, так и OIK почти эквивалентны. Тем не менее, Oikawa и др. не причастны к настоящему изобретению, так как пишут, что нет обнаруживаемой активности во фракции с молекулярной массой свыше 10 кД, что находится в противоречии с результатами авторов данного изобретения, приведенными на фиг.15.

Следовательно, несмотря на похожесть способов Balassa и данного изобретения, продукты, полученные с помощью этих способов, явно не одинаковые.

СРАВНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ

Содержание белков в образцах BAL, DUP и OIK (все содержат 16,5 мг/мл массы в сухом состоянии) измеряют по методу Лоури; результаты показывают величины 3,31, 0,27 и 4,15 мг/мл для образца BAL, DUP и OIK, соответственно. Соотношения белок/масса в сухом состоянии весьма различаются при сравнении образца DUP с BAL и OIK.

Выполняют анализы также с целью проанализировать содержание аминокислот в каждом жидком хрящевом препарате. Фиг.20 иллюстрирует содержание каждой аминокислоты в образцах BAL, DUP и OIK. Доля свободных аминокислот весьма различная для каждого хрящевого препарата - 23%, 74% и 4% в образцах BAL, DUP и OIK, соответственно. Очевидно, доля аминокислот белкового происхождения также будет весьма различная для каждого хрящевого препарата - 77%, 27% и 86% в образцах BAL, DUP и OIK, соответственно. См. данные в табл.7.

ВЫВОДЫ

Два продукта известного уровня техники (BAL и OIK), которые сравнивали с продуктами данного изобретения (DUP),

относятся, к тому же, к продуктам классических способов получения хрящевых экстрактов. Приведенные выше результаты показывают, что способ данного изобретения дает продукт (DUP) с неожиданно высокой активностью при рассмотрении антиангиогенной, противоопухолевой, противовоспалительной и противоколлагенолитической активности. Авторы полагают, что способ данного изобретения действительно приводит к успешному извлечению многих водорастворимых факторов в едином хрящевом экстракте.

Непосредственное сравнение молекулярных профилей BAL, DUP и OIK и содержания белка показывает, что каждый хрящевой препарат имеет особые характеристики. Хотя кажется, что в них входят некоторые одни и те же составные части, очевидно, что их соотношения различные. Это особенно важно при рассмотрении того факта, что DUP обладает противоопухолевым действием при пероральном введении при дозах ниже примерно 75 мг/кг и постепенно теряет это действие при более высокой дозировке. Этот результат наводит на мысль, что вся масса нескольких факторов является критической в жидком хрящевом экстракте DUP. Следовательно, различные хрящевые препараты, подобные BAL, DUP и OIK, могут показывать весьма различные биологические свойства, так как доли каждых отдельных компонентов в них очень различаются.

КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

ПОЛУЧЕНИЕ ЖИДКИХ ЭКСТРАКТОВ ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ

Проводят предварительные клинические испытания с жидким экстрактом из акульего хряща данного изобретения. Жидкий экстракт, полученный после ультрафильтрации, фильтруют на фильтре Millipore с порами 0,22 мкм. Предельное содержание микроорганизмов в жидком экстракте проверяют в соответствии со стандартом фармакопеи США ХХIII <61>. Жидкий экстракт разливают в стерильные флаконы (аликвоты по 7 мл, примерно 85 мг белков), замораживают при -60oС в течение ночи и затем хранят при -20oС до использования.

АНТИАНГИОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ

Жидкий хрящевой экстракт применяют для лечения ангиогенеззависимых заболеваний. Проводят испытания при лечении людей в случае примеров трех различных типов ангиогенеззависимых заболеваний, причем первый тип представляет рак (рак предстательной железы), вторым типом является дерматологические нарушения (псориаз) и третий тип представляет артрит (ревматоидный артрит и остеоартрит). Приведенные ниже примеры будут иллюстрировать и показывать по меньшей мере антиангиогенную активность жидкого экстракта.

Результаты, приведенные здесь ниже, являются весьма обнадеживающими и позволяют предсказать полезность общего раствора и его фракций при лечении всех ангиогенеззависимых заболеваний, а не только заболеваний, при которых конкретно проводились испытания. Постольку поскольку заболевание имеет ангиогенный компонент, предполагается, что хрящевой экстракт данного изобретения будет эффективным в этом отношении при условии, что он входит в композицию, содержащую его эффективное количество, и что эта композиция находится в форме, подходящей для надлежащего введения. Поэтому, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается приведенными далее конкретными композициями для применения при лечении ангиогенных заболеваний, так как специалист в этой области техники сможет создать много композиций, выбор которых определяется способом введения и нацеленностью на больную ткань. Композиции можно вводить различными способами, например, местно, перорально, под язык, ректально, внутривенно, внутримышечно, внутриглазным способом, интраперитонеально, посредством диффузии и т.д.

Вследствие рыбного вкуса и запаха хрящевого экстракта в него можно добавлять корригенты или отдушки, или можно создать другие галеновые композиции (липосомы. Включения в желатиновые капсулы, пэтчи, и т.д.), чтобы стимулировать согласие пациента. Термин "пациент" обозначает больного человека или больное животное.

Рак

Пациенту, страдающему от рака предстательной железы, добавляют жидкий хрящевой экстракт в его пищу, и отмечают существенное улучшение здоровья в силу этого. Аденокарциному диагностировали в 1986. В это время предпринята радиотерапия. В 1991 уровень PSA (простатический сывороточный антиген) составляет 138 мкг/л, в то время как нормальный приемлемый верхний предел равен 4 мкг/л. Затем пациента подвергли совершенно иному лечению посредством кастрации в сочетании с антиандрогенной терапией (EUFLEX). Это лечение было эффективным в течение трех лет, после чего уровень PSA снова начал повышаться. С июня 1994 этому пациенту добавляют в его рацион жидкий хрящевой экстракт (суточная доза для перорального приема примерно 75 мг массы сухого вещества в 7 мл экстракта, что эквивалентно примерно 1-1,5 мг/кг массы тела в сутки). Уровень PSA постепенно снижается от 12 до менее 4,0 мкг/мл (нормальный предел), причем последний результат получают в апреле 1996. Эту схему приема лекарственного средства следует модифицировать в соответствии со способом введения, биологической доступностью активных ингредиентов и желательным вмешательством, с которым необходимо регулировать патологию. В этом случае жидкий экстракт, вероятно, поглощается в желудочно-кишечном тракте в значительных пропорциях. Можно полагаться на результаты, полученные на крысах, обработанных DMBA, и инокулированных мышей (см. выше). В это же время на крысах, мышах (см. выше) и обезьянах (данные не приводятся) подтверждается нетоксичность.

Пероральное введение жидкого экстракта обработанным DMBA крысам и мышам с имплантированным DA3 предполагает норму дозировки от 1 до 300 мг на кг массы тела, которая, возможно, вносит большой вклад в ингибирование развития опухоли и опухолевой васкуляризации у животных моделей. Интраперитонеальное введение жидкого экстракта мышам (модель DA3) показывает, что для получения эффективной дозировки при ингибировании развития опухоли является важным способ введения. Это наводит на мысль, что величина дозы 1 мг/кг, эффективная в случае рака предстательной железы, может быть снижена почти до 0,01 мг/кг, если выбрать парентеральный способ введения. Поэтому принимается, что доза примерно от 0,01 до, примерно, 200 мг/кг массы тела составляет приблизительный разумный интервал половинных доз (ED50) в случае лечения рака, благодаря, по меньшей мере частично, уменьшению или устранению ангиогенеза.

Нескольким другим пациентам добавляют в их пищу жидкий хрящевой экстракт (ежесуточная пероральная доза примерно 75 мг массы в сухом состоянии на 7 мл экстракта, эквивалентная примерно 1-1,5 мг/кг массы тела/сутки) в сочетании с более традиционными способами лечения (операция, химиотерапия, антигормонотерапия и т.д.). Краткое описание некоторых клинических случаев дается в табл. 8. Результаты показывают, что комбинационное лечение с жидким хрящевым экстрактом может увеличить коэффициент выживаемости и качество жизни пациентов, страдающих от твердых опухолей.

Псориаз

Готовится приведенная ниже дерматологическая композиция и испытывается для подтверждения ее эффективности на пациентах, страдающих от псориаза.

- EMULGADE CLB, 29% (м/м),

- общий раствор, 20Х, 69,5% (м/м),

- GERMABEN 11, 1% (м/м) и

- Lavandula Angustifolia, 0,5% (м/м).

EMULGADE CLB - смесь эфиров стеариновой кислоты, жирных спиртов и неионогенных эмульгаторов (закупается у Hencel Canada Ltd.) нагревают при 65-70oС при перемешивании. Нагревание прекращают, а смесь продолжают перемешивать. Когда температура смеси станет 45oС, добавляют эфирное масло Lavandula Angustifolia и консерванты GERMABEN II (диазонидилмочевина - 30%, метилпарабен - 11%, пропилпарабен - 3% и пропиленгликоль - 56%; закупают у Sutton Laboratories, Нью-Джерси США). Когда температура смеси достигнет 30oС, добавляют жидкий хрящевой экстракт. Полученная таким образом композиция представляет однородный нежирный крем; изменяя процентное содержание EMULGADE, можно получить другие дерматологические композиции различной вязкости, в соответствии с указаниями изготовителя (молочко, лосьон, мазь). Другие носители или эксципиенты можно использовать для получения паст, гелей и любой другой формы трансдермального препарата.

Приведенный выше состав дают дважды в день в течение двенадцати недель группе из 9 пациентов (местное применение), страдающих от псориаза, которые восприимчивы к обычному проверенному лечению, но со временем становятся невосприимчивыми к нему. Для этого исследования отбирают пациентов с подобным и симметричным псориазом на обеих сторонах конечностей. Эти испытания проводят вдвойне слепым методом, причем ни дерматолог, ни пациент не знают, какая пораженная сторона обрабатывается композицией, содержащей хрящевой экстракт, а какая обрабатывается контрольной композицией. Заметное улучшение наблюдается у пяти пациентов, у которых псориаз не осложняется гиперкератозом; у пациентов с гиперкератозом результаты умеренно хорошие. Фотографии пораженных участков тел двух пациентов приводятся на фиг.21. Фиг.21, а и б, показывают, что у пациента, пораженного псориазом с гиперкератозом, тем не менее заметно весьма существенное уменьшение эритемы, не связанное с отсутствием зуда, уже только после лечения в течение одного месяца. Однако, гиперкератоз остался, что важно. Фотографии второго пациента, страдающего псориазом, не осложненным гиперкератозом (фиг.21, в и г), показывают более значительное улучшение после лечения в течение трех месяцев. Так как очевидно, что псориаз является многофакторным заболеванием, предполагается, что реакция пациентов зависит от значения компонентов поражения, подобных ангиогенезу и воспалению, при создании и закреплении этого состояния. Антиангиогенная активность действительно присутствует в экстракте по изобретению, как показано на крысах, обработанных DMBA (фиг.5), в случае пролиферации эндотелиальных клеток (фиг.7) и EVT (фиг.10). Противовоспалительное действие также подтверждено (модель CHS на мышах). Возможно, что более хорошие результаты можно получить, если композиции такого рода дополнить другими терапевтическими средствами, обращенными к другим вовлеченным в процесс факторам (кератолитические средства, дополнительные противовоспалительные средства, антигистаминные средства, иммуносупрессоры и т.д.).

Такое дополнение может принимать форму изменения состава, который включает, например, эффективное количество кератинолитического средства. Этого также можно достичь посредством отдельного введения такого комплементарного терапевтического средства, одновременно или поочередно с применением композиции для местного применения по настоящему изобретению. Кроме того, комплементарная лекарственная терапия не требует введения одним и тем же способом.

Приведенная выше композиция не обнаруживает системного действия (действие ограничивается обрабатываемым пространством) и другого действия, несмотря на большое количество жидкого хрящевого экстракта.

Артрит

Пациенты, страдающие от артрита, добровольно, в порядке испытания, принимают одну или две дозы по 7 мл общего жидкого экстракта в сутки в течение нескольких месяцев. Эти пациенты замечают постепенное улучшение своего состояния через восстановление функции суставов, уменьшение боли и воспаления (до 60%). Так как артрит имеет ангиогенный и воспалительный компоненты, указанный выше эффект можно приписать антиангиогенной и противовоспалительной активности хрящевого экстракта.

Затем группой специалистов в области ревматологии проводятся экспериментальные клинические исследования. Семь осведомленных добровольцев в возрасте от 39 до 60 лет, страдающих ревматоидным артритом, записываются для участия в этом исследовании. Диагноз устанавливается на основе классификационных показателей в исправленном издании Американской ревматической ассоциации (Arnett, F.C., et al., 1988, Arthritis & Рheumatism, vol.31, 315-325).

Лечение длится 30 дней и состоит в приеме ежесуточной дозы в 21 мл жидкого экстракта акульего хряща (12 мг/мл массы в сухом состоянии). Эффективность лечения определяют по суставному индексу для оценки болезненности суставов (Ritchie, D.M., et al., 1968, Quaterly J.Med., New Series XXXVII, vol. 147, 393-406). Индекс складывается из ряда количественных оценок боли, испытываемой пациентом, когда суставы крепко сжимают над суставным краем, или, в некоторых случаях, при движении сустава. Результаты показывают, что у 4 пациентов из 7 имеются улучшения при лечении жидким хрящевым экстрактом (см. таблицу 9), что наводит на мысль, что продукт может быть полезен при лечении ревматоидного артрита или других состояний, осложненных хроническим воспалением.

Сосудистые звездочки

Для этого исследования отбирают 16 участников. Участники имеют видимую, но не избыточную телеангиэктазию на лице. Участников разделяют на две группы по 8 человек в каждой. Группа А получает холестеринлипосомную композицию-базу, содержащую 5% жидкого хрящевого экстракта, в то время как вторая группа (Б) получает только одну холестеринлипосомную композицию-базу. Продукты применяют на всем лице, дважды в день, в течение 3 месяцев. Для получения изображения минимум 4 участков лица с сосудистыми звездочками пользуются волоконно-оптическим микроскопом. Изображение анализируют на серый показатель с помощью анализатора изображений Ibas, Zeiss. Вычисляют интегральную оптическую плотность (IOD) для каждого участка каждого участника испытаний. Усредняют данные для четырех участков каждого участника на каждый момент времени.

Результаты показывают, что через 4 недели имеется 35% снижение IOD, и этот эффект сохраняется в ходе исследований (фиг.22). Холостая холестеринлипосомная база показывает фоновое улучшение в 5% и 8% после 8 и 12 недель применения, соответственно.

Темные круги вокруг глаз

Цвет кожи является не только следствием присутствия или отсутствия меланина, но также кровоснабжения и содержимого плазмы. Когда кровоток вялый и большее количество кислорода удаляется для метаболизма, кожа выглядит синеватой по цвету. Эти различия в цвете увеличиваются в области глаз, поскольку кожа здесь тоньше (Oresajo et al. (1987), Cosmetics & Toiletries, 102:29-34). Сосудистые изменения в перегородках, которые присутствуют под глазами, также могут усиливать темные круги. Темные круги вокруг глаз также появляются вследствие жирового отложения, отека под веками и просачивания кровеносных сосудов в области вокруг глаз. Планируют клинические исследования для оценки действия жидкого экстракта акульего хряща на регулирование ангиогенеза в области вокруг глаз, за счет чего снижается появление темных кругов вокруг глаз.

В исследовании принимают участие всего 18 женщин-добровольцев в возрасте 18-65 лет. У участниц испытаний обнаруживаются отчетливые темные круги вокруг глаз. Все участницы здоровы, без явных острых или хронических заболеваний, включая дерматологические или офтальмологические проблемы.

Из исследований исключают субъектов с солнечной эритемой, высыпаниями, ссадинами, следами от ожогов и т.д., которые могут помешать оценке результатов испытаний. Также исключаются беременные или кормящие женщины. Участок испытаний должен быть свободен от бородавок, родимых пятен, солнечной эритемы, загара, шрамов и активных повреждений кожи, заметных при осмотре.

Участниц разделяют на две группы - 10 в группе А и 8 в группе Б, применяющие, соответственно, носитель, содержащий 5% жидкого хрящевого экстракта, или один носитель. Участницы испытаний получают достаточное количество средства для нанесения на область вокруг глаз дважды в день в течение 12 недель. Измерения проводят в начале испытаний и через 4, 8 и 12 недель. При каждом осмотре получают фотографии и анализируют с помощью анализатора изображений.

Фотографии анализируют на серый показатель, который отражает отношение темная/светлая кожа. Видно, что группа, применявшая жидкий хрящевой экстракт, обнаруживает хорошее увеличение серого показателя (что отражает посветление участков темного цвета). После 4, 8 и 12 недель имеется 11%, 21% и 14% посветление кожи вокруг глаз в группе, которую лечат жидким хрящевым экстрактом. В группе, применявшей один носитель, никаких изменений не отмечается (фиг.23).

Варикозные вены

Набирают для испытаний всего 20 участников. У участников испытаний имеются видимая, но не избыточная телеангиэктазия на ногах. Участников испытаний разделяют на две группы. Группе А (n=9) дают крем, содержащий жидкий хрящевой экстракт, в то время как группе В (n=11) дают только один крем-носитель, для нанесения на всю поверхность ног дважды в день в течение 3 месяцев. Для получения изображений 2-4 участков на ногах с варикозными венами пользуются волоконно-оптическим микроскопом. Изображения анализируют на серый показатель с помощью анализатора Ibas, Zeiss. Вычисляют интегральную оптическую плотность (IOD) для каждого участка каждого участника испытаний. Результаты на каждый момент времени для всех участков каждого пациента усредняют.

Результаты приводятся на фиг.24. Имеется 21%, 17% и 26% снижение IOD после 4, 8 и 12 недель применения, соответственно. Контрольный носитель показывает фоновое улучшение в 5%, 0% и 0% после 4, 8 и 12 недель применения, соответственно.

Другие возможные клинические и ветеринарные применения

Офтальмология. Падение зрения или слепота могут вызываться многими состояниями, характеризующимися аномальным ростом кровеносных сосудов или образованием новых сосудов. К ним относятся корнеальное образование новых сосудов (вызываемое химическим или физическим раздражением), корнеальная инфекция, отторжение корнеального трансплантата, неоваскулярная глаукома, дегенерация желтого пятна, герпетический кератит и диабетическая ретинопатия. Жидкий хрящевой экстракт может действовать при всех этих клинических состояниях через ингибирование образования новых кровеносных сосудов и через снижение телеангиэктазии и воспаления.

Заживление ран. Заживление ран включает комплексное взаимодействие между клетками, биохимическими медиаторами, молекулами экстрацеллюлярного матрикса и микроокружением клеток. После глубокого ранения грануляционная ткань (фибробласты, капилляры и клетки зоны воспаления) сначала растет от края раны в определенной последовательности. В пределах 24 ч фибробласты начинают мигрировать в пространство раны от соединительной ткани по краям раны. По мере продвижения фибробласты продуцируют молекулы матрикса (коллаген и гликозаминогликаны), которые образуют экстрацеллюлярный матрикс. Первые зачатки капилляров можно видеть в перфузированной микроциркуляции по краям раны уже через 18 ч после ранения. Эта зачатки растут в пространстве раны и дают новую капиллярную сеть для соединительной ткани раны. Пролиферация и миграция фибробластов и рост капилляров продолжается как целое до тех пор, пока пространство раны не заполнится полностью новой тканью. Некоторые условия ранозаживления, которые осложняются сверхэкспрессией факторов грануляции, такие как гипертрофическое рубцевание, и заживление кожи у людей с сильными ожогами может улучшить введение жидкого хрящевого экстракта (пероральное или местное), так как ослабление процесса ангиогенеза должно замедлять заживление раны.

Папулосквамозная болезнь кожи. Благоприятное действие жидкого хрящевого экстракта на псориатические повреждения наводит на мысль, что при других заболеваниях с подобными характеристиками также может быть полезным местное или системное введение жидкого экстракта. Папулосквамозные болезни кожи характеризуются папулами от красного до фиолетового цвета и бляшками, которые образуются в результате утолщения эпидермиса и/или подкожного воспаления, и к ним относятся псориаз, болезнь Рейтера, pityriasus rosea, красный плоский лишай, красный отрубевидный лишай, вторичный сифилис, грибовидный микоз и ихтиозоподобные высыпания.

Алопеция. Лигирование мелких латеральных артерий, создающих кровоток к волосистой части кожи головы, приводит к успеху в предотвращении потери волос, вызываемой передозировкой андрогена. Местное нанесение жидкого хрящевого экстракта на некоторый участок волосистой части кожи головы может предотвратить потерю волос за счет сокращения сети сосудов и, следовательно, воздействия гормонов.

Применение в ветеринарии. Твердый и/или жидкий хрящевой экстракт можно назначать животным для такого же терапевтического и косметического применения, которые описаны для людей.

ДЕЙСТВИЕ, НЕ ЯВЛЯЮЩЕЕСЯ АНТИАНГИОГЕННЫМ

Акне

Хотя акне, как известно авторам изобретения, не относят к заболеванию или нарушению с ангиогенным компонентом, тем не менее и в этом случае испытывается жидкий хрящевой экстракт на пациентах, пораженных ей, на основании того, что жидкий экстракт обладает также противовоспалительным действием. Для опробования хрящевого экстракта на пациентах, пораженных акне, готовят композицию, приведенную ниже, %:

CARBOPOL - 1,2

Очищенная вода - 77,2

NaOH - 0,3

PHENOXETOL - 0,3

ТВИН 80 - 0,3

Жидкий хрящевой экстракт - 20,0

Экстракт алоэ, 40Х - 0,5

Жидкий хрящевой экстракт содержит 9-12 мг/мл массы в сухом состоянии. Эта композиция показывает заметное улучшение состояния кожи пациентов, пораженных акне в более или менее тяжелой форме (воспалительная акне и кистозная акне). Фиг. 25 показывает значительное улучшение состояния пациента, страдающего от акне, при местном лечении содержащим жидкий хрящевой экстракт носителем в течение 12 недель.

Эти результаты могут быть следствием антиангиогенного действия (причем таким образом обнаруживается ангиогенный компонент в акне), или они имеют место из-за активных ингредиентов, которые оказывают иное, чем антиангиогенное действие (например, противовоспалительное действие). Все результаты, полученные при описанных выше клинических испытаниях, указывают на большие возможности жидкого хрящевого экстракта при лечении ангиогенеззависимых и/или воспалительных заболеваний. Количество хрящевого экстракта, как и содержащая его композиция могут изменяться в зависимости от конкретных требований.

Можно отметить, что, основываясь на содержании белка, композиция для местного применения и все другие композиции могут содержать дозы хрящевого экстракта в широком диапазоне. В трех конкретных испытанных случаях использовали весьма различные дозировки и/или композиции.

Раздражение кожи

Так как ангиогенез при многих заболеваниях часто ассоциируется с воспалением, желательно определить каждый вид активности хрящевого экстракта по отдельности. В этом отношении, для испытания экстракта на его противовоспалительное и успокаивающее действие выбирают модель с раздражением кожи, при которой не допускается появление ангиогенеза. Выбирают для исследований девять добровольцев с анамнезом чувствительности кожи к бальзаму Перу. Испытуемые соединения перечислены ниже.

1. IX акулий хрящ, 50%, в среде D-MEM.

2. IX акулий хрящ, 20%, в среде D-MEM.

3. IX акулий хрящ, 10%, в среде D-MEM.

4. Cola nitida (Indena), 10%, вода-спирт, 1:1.

Наносят 4 испытуемых соединения на вентральные предплечья участников испытаний. Материалу дают абсорбироваться в течение 20 мин, а затем на участки для испытаний наносят раздражитель - бальзам Перу. Раздражение кожи определяют в показателях повышения покраснения кожи. Степень покраснения измеряют цветометром Minolta и сравнивают с положительным и отрицательным контролем. Положительным контролем является цвет кожи, обработанной одним бальзамом Перу, а отрицательным контролем является участок кожи, обработанный раствором кола и веществами, подобными испытываемым продуктам. Статистическую значимость вычисляют с помощью Т-теста вероятности с двумя ограничениями. Фиг. 26 показывает, что кола 10% является 70% активным. Акулий хрящ является 58% и 60% антираздражителем при концентрации 20% и 10%, соответственно. Это не является действием, зависимым от дозы. Эти результаты приводят к мысли, что хрящевой экстракт обладает противовоспалительным и успокаивающим действием, которое отличается от антиангиогенного действия.

Рак

Женщине в возрасте 53 лет диагностирована крупноклеточная, не являющаяся болезнью Ходжкина, лимфома В-типа. Анализ методом радиоизотопной CAT показывает аденопатию вокруг сонной артерии и яремной вены (2,5 см в диаметре) и объемистую аденопатию над гилусом правой почки. Больная отказывается от химиотерапии и добавляет в свою пищу жидкий хрящевой экстракт (октябрь 1993) (ежедневная пероральная доза примерно 75 мг массы в сухом состоянии/7 мл экстракта, эквивалентно примерно 11,5 мг/кг массы тела/сутки). Три месяца спустя (январь 1994) анализ методом радиоизотопной CAT показывает в области шеи полностью рассосавшуюся аденопатию. В ноябре 1994 абдоминальная аденопатия уменьшается в объеме на 75%. С тех пор болезнь стабилизируется, и пациента чувствует себя хорошо.

Этот результат приводит к мысли, что некоторые виды нетвердого рака также могут реагировать на противоопухолевое действие жидкого хрящевого экстракта.

Защитный барьер кожи

В этом исследовании принимает участие группа из шести здоровых добровольцев. Участники испытаний получают крем, содержащий жидкий хрящевой экстракт, который наносят на правое предплечье, и один носитель, который наносят на левое предплечье, дважды в день в течение четырех недель.

Участниками испытаний являются женщины в возрасте 21-45 лет без признаков острого или хронического заболевания, включая дерматологические и офтальмологические проблемы. Из исследований исключают субъектов с солнечной эритемой, высыпаниями, ссадинами, следами от ожогов и т.д., которые могут помешать оценке результатов испытаний. Участок испытаний должен быть свободен от бородавок, родимых пятен, солнечной эритемы, загара, шрамов и активных повреждений кожи, заметных при осмотре. В день испытаний участницам дают указания воздерживаться от применения каких-либо лосьонов, кремов или других средств для лица. В ходе измерений участницы испытаний по меньшей мере в течение 30 минут перед испытанием приходят в равновесие с регулируемой окружающей средой с температурой 20-22oС и относительной влажностью 40%.

Участками для испытаний являются правое и левое ладонные предплечья. На каждой руке отмечают небольшую площадку (3,5 см 7 см), и проводят базовые измерения трансдермальной потери влаги (TEWL) в трех местах в пределах этой площадки (Pinnagoda et al. (1990), Contact Dermatitis, 22:164-178; Grove (1994), в The effects of aging in oral mucosa and skin, Ed. Sguier & Hill, CRC Press, pp. 124-125).

Чтобы закрыть экспериментальный участок, используют лейкопластырь (Tuck), и после крепкого приглаживания в обоих направлениях пластырь снимают (Elias (1993), J. Invest. Dermatol., 80: 044s-049s). Пластырь наклеивают и снимают всего 5 раз. Снова регистрируют TEWL. "Отрывы" с последующими измерениями TEWL продолжают с группой из 5 человек. Отрывы прекращают, когда TEWL достигает 18 г/м2/ч. Снова измеряют TEWL после последнего чередования наклеивания и снятия пластыря. Число отрывов, необходимое для повреждения кожного барьера, вычисляют, отмечая число максимума отрывов для каждой руки, в каждый момент времени, когда TEWL становится 18 г/м2/ч или больше. Результаты анализируют на статистическую значимость между обработкой в различные моменты времени и базой с использованием Z-теста с коэффициентом одноограниченного ранга.

На руке, обработанной носителем, не выявляется значительного улучшения, так как только на 26% и на 21% больше нужно отрывов, чтобы повредить кожный барьер после 2-недельной и 4-недельной обработки, соответственно. Значительное улучшение состояния барьера (р<0,05) имеется у каждой участницы испытаний после обработки средством с жидким хрящевым экстрактом в течение 2 и 4 недель, когда для разрушения кожного барьера требуется отрывов на 60% и 55% больше (фиг.27).

Следовательно, доказано, что жидкий хрящевой экстракт полезен для усиления кожного барьера против физических повреждений.

Экзема

Жидкий хрящевой экстракт испытывают в косметическом салоне на том основании, что он способен снижать воспалительные повреждения, вызванные экземой. Специалистка косметического салона, применяющая крем, содержащий жидкий экстракт, многие годы страдает от хронической экземы на руках. Интересно, что применение содержащего хрящ крема существенно снижает проявление экземы на ее руках. Теперь она успешно применяет содержащий хрящ крем для предупреждения выражения экземы.

Бородавки

Женщина в возрасте 36 лет с анамнезом подошвенных бородавок лечится у дерматолога почти в течение трех лет, чтобы бороться с бородавками и связанной с ними болью. Среди лечебных средств были жидкий азот, салициловая кислота (40%), анаэробы, азотная кислота и серная кислота. Такое лечение осуществлялось обычно каждую неделю в течение трех месяцев, а результаты были почти нулевые. В марте 1996 она начала наносить ежедневно (5 минут) жидкий экстракт акульего хряща непосредственно на бородавки; двумя неделями позже вокруг бородавок образуется зона розового цвета из нового эпидермиса; на следующей неделе бородавки пропали. Поэтому такой результат наводит на мысль, что жидкий хрящевой экстракт может помочь при лечении бородавок.

Другие возможные клинические и ветеринарные применения

Отторжение трансплантата. Воспаления являются одним из основных факторов, участвующих в отмирании трансплантированных клеток. Следовательно, на тканевый трансплантат могут благоприятно воздействовать противовоспалительные компоненты, присутствующие в жидком экстракте из хряща акулы данного изобретения.

Рассеянный склероз. Причина рассеянного склероза неизвестна. Тканевая реакция имеет признаки иммунопатологического процесса с инфильтрацией перивенулярных мононуклеарных клеток и отсутствием каких-либо явных гистопаталогических признаков инфекции. Металлопротеиназы матрикса являются важным фактором, вовлеченным в воспалительную реакцию. Так как жидкий хрящевой экстракт является сильным ингибитором металлопротеиназ матрикса, он может быть полезен при лечении рассеянного склероза.

Фиброз. В настоящее время принято считать, что фиброз походит на нормальное ранозаживление, но не прекращающееся вовремя, что ведет к замене нормальной ткани шрамом. Большинство фиброзных реакций являются производными травмы, инфекции, воспаления или, по неизвестным причинам, могут иметь генетический компонент. Обычно сверхпродуцируется TGF- и индуцирует пролиферацию фибробластовых клеток и сверхпродукцию коллагена. Так как избыточное отложение коллагена является признаком фиброза, авторы полагают, что жидкий хрящевой экстракт, который может приостанавливать образование грануляционной ткани, может оказать долговременную пользу при подавлении фиброзных реакций.

Воспалительные заболевания кишечника. Этиология воспалительных заболеваний кишечника неизвестна, но нарушенный кишечный иммунитет вовлекается в патогенез болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Мукоидные одноядерные клетки отображают измененные продуцирование антител, пролиферацию, цитотоксичность и синтез цитокинов (FGF, PDGF, EGF, TNF). Жидкий хрящевой экстракт демонстрирует противовоспалительную активность, и его пероральное введение может принести пользу при лечении воспалительного заболевания кишечника.

Болезни сердца. Эндотелиальная дисфункция коронарных сосудов может нести ответственность за нарушения коронарной микроциркуляторной части сосудистого русла и, вероятно, ишемию миокарда и боль в грудной клетке. На клеточном уровне эндотелиальная дисфункция ассоциируется с пониженной экспрессией оксида азота (NO) - производимого эндотелием расслабляющего фактора. Синтез NO дает возможность сосудистой системе сохранять состояние вазодилатации, причем посредством этого регулируется артериальное давление. Дефицит эндогенного синтеза NO вносит вклад в такие состояния, как артериальная гипертензия, легочная гипертензия и болезнь сердца. Авторы предварительно получили результаты на культивированных эндотелиальных клетках, показавшие, что жидкий хрящевой экстракт увеличивает продуцирование NO. Следовательно, можно показать, что жидкий экстракт, через посредство NO, является полезным при некоторых болезненных состояниях сердца, а также для больных детей с врожденной болезнью сердца, осложненной легочной гипертензией.

Кроме того, жидкий хрящевой экстракт может способствовать уменьшению связанных с воспалением осложнений при атеросклерозе.

Склеродермия. Склеродермия (отвердение кожи) представляет необычное заболевание, отмеченное ростом фиброзной соединительной ткани кожи, а также часто внутренних органов. Она часто проявляется в виде гиперкератинизации отдельных бляшек на коже. Гиперкератинизация является клеточным процессом, при котором кератиноциты кожи полностью дифференцируются и накапливаются в виде жестких кератиновых волокон. Такое состояние кожи может привести к ограниченной подвижности суставов, если кожа поражена в вокругсуставной области. При добавлении в экспериментальную систему, в которой поддерживается дифференцировка кератиноцитов, жидкий хрящевой экстракт частично предотвращает процесс дифференцировки или кератинизацию. Следовательно, жидкий экстракт может быть полезен в случае таких состояний кожи, благодаря предотвращению чрезмерного накапливания полностью дифференцированных кератиноцитов.

Ветеринарное применение. Твердый и/или жидкий хрящевые экстракты можно назначать животным для такого же лечебного и косметического применения, которое описано для людей.

Косметическое применение и композиции

Описанные выше тесты и испытания показывают, что хрящевой экстракт данного изобретения может найти много применений в медицине. Среди разнообразных активных компонентов, извлекаемых в этом экстракте, компоненты, обеспечивающие антиангиогенное, противоколлагенолитическое, противовоспалительное и ингибирующее действие на индуцируемую РКС дифференцировку, желательны, в частности, для косметического применения. Так как хрящевой экстракт настоящего изобретения обнаруживает антагонистическое действие на опосредованные РКС клеточные события, и так как такое антагонистическое действие оценивается в технике как действие, улучшающее функцию кожного барьера, способ улучшения барьерной функции в коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции, которая содержит хрящевой экстракт и фармацевтически приемлемый носитель, и такая композиция входит в объем данного изобретения. Можно также предположить применение в способе других или подобных композиций с целью смягчения кожи или для снижения воспаления кожи млекопитающего. Воспаление может вызываться различными агентами, такими как химический раздражитель, физическое повреждение и воздействие ультрафиолетового излучения. Композиции и способы для ингибирования коллагеназы в коже также рассматриваются. Коллагеназа и воспаление связаны с преждевременным старением (разрушение коллагена) и, следовательно, активные антагонисты, переходящие в хрящевой экстракт, также могут внести свой вклад в композиции и способы для замедления преждевременного старения, и для регулирования образования морщин или атрофии в коже млекопитающего. Причинами образования морщин или атрофии могут быть, например, возраст, воздействие ультрафиолетового излучения или загрязнители окружающей среды. Композиции для местного применения могут содержать эффективное количество хряща акулы, которое определяется для каждого конкретного применения. Как правило, такие композиции могут содержать от 0,1 до 75 мас.% жидкого хрящевого экстракта и от 25 до 99,9% фармацевтически приемлемого носителя. Эти композиции могут содержать антиоксидант, такой как средство, предотвращающее образование в коже пероксидов липидов. Примерами такого антиоксиданта являются токоферол, производные токоферола, аскорбиновая кислота, производные аскорбиновой кислоты и ВНТ (бутилокситолуол). Композиции могут дополняться противовоспалительными средствами, подобными ингибитору фосфолипазы А2 или полученным из лекарственного сырья не вызывающим раздражения экстрактам колы и зеленого чая. Композиции для местного применения могут иметь различные формы, такие как растворы, суспензии, лосьоны, настои, гели, кремы, спреи, карандаши, мази или липосомы (причем по меньшей мере часть жидкого хрящевого экстракта находится в липосомах). К другим косметическим применениям относятся случаи темных кругов вокруг глаз и функция кожного барьера.

ВЫВОДЫ

Способ настоящего изобретения представлен как способ, который относится к получению хрящевых экстрактов большого клинического значения. Экстракты из хряща акулы, полученные с помощью этого нового способа, содержат множество активных компонентов, которые извлечены с хорошим выходом. Хрящевые экстракты, в частности, жидкий экстракт и его фракции, обладают большими возможностями, так как они нетоксичны для здоровых клеток, в то время как являются эффективными при многих заболеваниях или состояниях.

В случае всех предсказанных применений (от глазных капель до лекарственных композиций для лечения кожи и рака) предполагается, что минимальная конечная концентрация белка в общем хрящевом экстракте может быть очень небольшой (примерно от 0,01 мг/мл). Этот нижний предел интервала доз зависит от доступности и от проникновения активных ингредиентов к месту действия, а также от эффективного захвата этих ингредиентов и чувствительности или реакции ткани на ингибиторы ангиогенеза. Верхний предел конечной концентрации белка в композициях в случае некоторых применений на сегодня не известен. Самые высокие испытанные концентрации при местном введении составляют примерно 9 мг/мл белков в композиции в случае псориаза, а при пероральном введении примерно 12 мг/мл в стандартной дозе 7 мл, назначаемой ежесуточно, в случае рака и 21 мл при испытаниях при артрите.

Жидкий экстракт акульего хряща может терять часть своей активности при лиофилизации. Однако, добавление перед лиофилизацией стабилизаторов или защитных средств, известных в технике, может сохранить чувствительные активные компоненты и сделать возможным введение более высоких доз хрящевого экстракта в сухом состоянии.

НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ

- Охладители (средства охлаждения).

- Хирургические инструменты.

- Мясорубка.

- Пластиковые мешки.

- Промышленный смеситель 3-скоростной смеситель Waring, купленный у Fisher Scientific.

- Система очистки воды (обратный осмос и фильтрация 0,1 Еm; Continental Water System, модель PRE 2202, серийный номер 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing System, закуплена у Fisher Scientific, Монреаль, Квебек). Эта система дает апирогенную воду высокого качества.

- Точные весы Mettler, серия АЕ, закуплены у Fisher Scientific.

- Центрифуга Sorvall RC-285, закуплена у DuPont, Канада.

- Центрифуга СЕРА.

- Нейлоновый мешок с порами 1 мкм.

- Автоклав (автоматический паровой стерилизатор Sanyo, модель MAC 350P).

- 500-мл сосуды Nalgene, стерилизованные при 132oС в течение 10 мин и высушенные в течение 35 мин.

- Конические фильтры с порами 24 мкм, Whatman Reeve Angel.

- Колонка для ультрафильтрации (отсекаемая молекулярная масса 500 кД и 1 кД, когда подходит; поверхность ~2,23 м2 (25 кв. фут.); поток 130 л/мин; давление на входе ~207 кПа (30 ф/д2); давление на выходе ~ 35 кПа (5 ф/д2); закуплена у Koch Membrane Systems Inc., Уилмингтон, Миннесота, США).

- Центробежный насос санитарной системы (Monarch Industries, модель ACE-S100, тип А) для обеспечения потока 130 л/мин.

- Стерильный бокс (бокс с ламинарным потоком NuAire, закуплен у Ingram & Bell).

- Фильтры для стерилизации Millipack-60, 0,22 мкм.

- Стерильные чистые или засмоленные стеклянные флаконы.

- Концентратор DC-10 Amicon.

- Ротофор Biorad 170-2950.

- Фильтры Amicon S10Y10, S10Y30 и S10Y100, отсекающие 10, 30 и 100 кД, соответственно.

- FPLC, Pharmacia 216007 (компьютер Pharmacia 216014).

- Hilstand S-300, 26 мм/см (Pharmacia).

- Супероза S-12, 10 мм/30 см (Pharmacia).

- Лиофилизатор Labcono 10273A.

Данное изобретение описано выше, и следует иметь в виду, что в пределах возможностей и знаний специалистов в этой области техники, без отхода от его сущности, можно внести изменения посредством замены некоторых элементов данного изобретения их эквивалентами, что практикуется, чтобы достичь тех же его целей. Такие очевидные изменения считаются защищенными данной заявкой. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения жидкого экстракта из хряща, содержащего значительную часть биологически активных водорастворимых компонентов, присутствующих в исходном хряще, включающий следующие стадии: а) гомогенизацию хряща в водном растворе при условиях, совместимых с сохранением целостности указанных биологически активных компонентов, до тех пор, пока хрящ не измельчится до частиц, размер которых меньше или равен 500 мкм, с образованием в результате смеси частиц и неочищенного жидкого экстракта, содержащего указанные биологически активные компоненты; б) центрифугирование указанного гомогената для отделения частиц от неочищенного жидкого экстракта; в) дальнейшая сепарация неочищенного жидкого экстракта таким образом, что получают конечный жидкий экстракт, содержащий молекулы составляющих хряща с молекулярной массой, меньшей или равной 500 кД, и г) концентрирование указанного конечного жидкого экстракта, при котором по меньшей мере удаляется часть молекул с молекулярной массой меньше 100 Д.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные условия включают рабочую температуру примерно от 0 до 20oС.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные условия включают рабочий интервал рН указанного водного раствора от примерно 6 до примерно 8.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадию а) выполняют в пределах от 15 мин до 24 ч.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что стадию а) выполняют в пределах от 15 мин до 1 ч.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный хрящ и водный раствор находятся в соотношении 1 кг на по меньшей мере примерно 1 л.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную стадию концентрирования г) выполняют посредством фильтрации указанного конечного жидкого экстракта через мембрану с величиной отсекаемой молекулярной массы примерно 0,1 кД, причем посредством этого удаляются молекулы с молекулярной массой меньше отсекаемой величины.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная стадия концентрирования г) включает лиофилизацию указанного конечного жидкого экстракта.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанную лиофилизацию выполняют в присутствии стабилизаторов или защитных средств, добавляемых к указанному жидкому экстракту в количестве, достаточном для улучшения сохранности указанных биологически активных компонентов.

10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что указанный хрящ берут от акулы.

11. Способ получения жидкого экстракта из хряща акулы, содержащего противоколлагенолитические и антиангиогенные водорастворимые компоненты, присутствующие в исходном хряще, включающий следующие стадии: а) гомогенизация хряща в водном растворе при условиях, совместимых с сохранением целостности указанных биологически активных компонентов, до тех пор, пока хрящ не измельчится до частиц, размер которых меньше или равен 500 мкм, с образованием в результате смеси частиц и общего жидкого экстракта, содержащего указанные биологически активные компоненты; б) центрифугирование указанного гомогената для отделения частиц от общего жидкого экстракта; в) дальнейшая сепарация общего жидкого экстракта таким образом, что получают конечный жидкий экстракт, содержащий молекулы составляющих хряща с молекулярной массой, меньшей или равной 500 кД; г) фильтрация указанного конечного жидкого экстракта через мембрану с величиной отсекаемой молекулярной массы примерно 100 Д, и д) извлечение фракции, содержащей молекулы с молекулярной массой менее 0,1 кД.

12. Способ получения жидкого экстракта из хряща акулы, содержащего антиангиогенные водорастворимые компоненты, присутствующие в исходном хряще, включающий стадии а) гомогенизации хряща в водном растворе при условиях, совместимых с сохранением целостности указанных биологически активных компонентов, до тех пор, пока хрящ не измельчится до частиц, размер которых меньше или равен 500 мкм, с образованием в результате смеси частиц и общего жидкого экстракта, содержащего указанные биологически активные компоненты;

б) центрифугирования указанного гомогената для отделения частиц от общего жидкого экстракта; в) дальнейшей сепарации общего жидкого экстракта таким образом, что получают конечный жидкий экстракт, содержащий молекулы составляющих хряща с молекулярной массой, меньшей или равной 500 кД; г) фильтрации указанного конечного жидкого экстракта через мембрану с величиной отсекаемой молекулярной массы примерно 10 кД; д) извлечения фракции, содержащей молекулы с молекулярной массой выше 10 кД; е) фракционирования этой фракции на колонке для анионообменной хроматографии, и ж) извлечения фракции, которая элюируется в промежутке 0,8-1,0 М NaCl.

13. Хрящевой экстракт, полученный из акулы и способом по любому из пп. 1-6.

14. Хрящевой экстракт, полученный из акулы и способом по п.7.

15. Хрящевой экстракт, полученный способом по п.10.

16. Противоколлагенолитический и антиангиогенный хрящевой экстракт, полученный способом по п.11.

17. Антиангиогенный хрящевой экстракт, полученный способом по п.12.

18. Композиция для лечения заболеваний или состояний с одним или несколькими этиологическими компонентами, выбираемых из группы, состоящей из пролиферации опухоли, ангиогенеза, воспаления и коллагенолиза, содержащая эффективное количество хрящевого экстракта по любому из пп.13-15 и фармацевтически приемлемый носитель.

19. Композиция для лечения заболеваний или состояний с коллагенолитическим этиологическим компонентом, содержащая эффективное количество хрящевого экстракта по п.16.

20. Композиция для лечения заболеваний или состояний с ангиогенным этиологическим компонентом, содержащая эффективное количество хрящевого экстракта по пп.16 или 17 или комбинацию хрящевых экстрактов по пп.16 и 17.

21. Композиция по п.18 для интраперитонеального, чрескожного, глазного, назального, перорального, ректального, подъязычного внутримышечного, интрадермального или трансдермального применения.

22. Композиция по п.18, являющаяся композицией для местного применения.

23. Композиция по п.22, отличающаяся тем, что указанный хрящевой экстракт добавляют до достижения конечного массового содержания твердых веществ от примерно 1 до примерно 50 мг на 1 мл композиции.

24. Композиция для местного применения для лечения акне, содержащая на 1 мл композиции примерно 2 мг хрящевого экстракта по любому из пп.13-15 в пересчете на массовое содержание твердых веществ в качестве терапевтически эффективного ингредиента в сочетании с фармацевтически подходящим носителем.

25. Композиция для местного применения для лечения псориаза, содержащая на 1 мл композиции примерно 30-50 мг хрящевого экстракта по любому из пп. 13-15 в пересчете на массовое содержание твердых веществ в качестве терапевтически эффективного ингредиента в сочетании с фармацевтически подходящим носителем.

26. Композиция для лечения рака, содержащая терапевтически эффективное количество хрящевого экстракта по любому из пп.13-15 в сочетании с фармацевтически подходящим носителем.

27. Композиция по п.26, отличающаяся тем, что указанный хрящевой экстракт дозируют для достижения общей массы в сухом состоянии указанного экстракта от 0,01 до 200,0 мг на 1 кг массы тела пациента.

28. Композиция по п.27, являющаяся композицией, которую вводят пациенту, нуждающемуся в таком лечении, перорально или под язык.

29. Способ лечения воспаления у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий пероральное введение эффективного против воспаления количества хрящевого экстракта по любому из пп.13-15 в сочетании с приемлемым фармацевтическим носителем.

30. Способ ингибирования ангиогенеза у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий пероральное введение эффективного против ангиогенеза количества хрящевого экстракта по любому из пп.13-17 в сочетании с приемлемым фармацевтическим носителем.

31. Способ улучшения функции кожного барьера в коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.22.

32. Способ смягчения кожи млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.22.

33. Способ уменьшения воспаления кожи млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.22.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанное воспаление вызвано физическим нарушением.

35. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанное воспаление вызвано химическим раздражителем.

36. Способ ингибирования коллагеназной активности в коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции, содержащей хрящевой экстракт, по любому из пп.13-16.

37. Способ регулирования образования морщин или атрофии в коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.22.

38. Способ ослабления акне в коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.24.

39. Способ лечения псориаза на коже млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.25.

40. Способ замедления преждевременного старения кожи млекопитающего, включающий стадию нанесения на кожу композиции по п.22.

41. Способ лечения заболеваний или состояний с одним или несколькими этиологическими компонентами, выбираемых из группы, состоящей из пролиферации опухоли, ангиогенеза, воспаления и коллагенолиза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, композиции по п.18.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что указанные заболевания или состояния выбирают из группы, состоящей из рака, папулосквамозной болезни кожи, артрита, акне, сосудистых звездочек, варикозных вен, темных кругов вокруг глаз, гипертрофического рубца, алопеции, экземы, бородавок, рассеянного склероза, фиброза, воспалительного заболевания кишечника, склеродермии, вазоконстрикционных заболеваний, корнеальной неоваскуляризации, корнеальной инфекции, неоваскулярной глаукомы, герпетического кератита, диабетической ретинопатии и отторжения трансплантата.

43. Способ ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток, включающий стадию контактирования указанных эндотелиальных клеток с композицией, содержащей хрящевой экстракт, по любому из пп.13-15.

44. Способ ингибирования дифференцировки активированных кератиноцитов, включающий стадию контактирования кератиноцитов с композицией, содержащей хрящевой экстракт, по любому из пп.13-15.