БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА


RU (11) 2268061 (13) C1

(51) МПК
A61K 35/54 (2006.01)
A61P 9/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.01.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004116839/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.06.04 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.06.04 
(45) Опубликовано: 2006.01.20 
(56) Аналоги изобретения: Suzuki К. et al. Circulation, 1999, 100 (suppi I): 1-164. RU 2160112 C1, 10.12.2000. RU 2214256 C2, 20.10.1003. WO 00/14113 A, 16.10.2000. 
(72) Имя изобретателя: Гольдштейн Дмитрий Вадимович (RU); Ржанинова Алла Анатольевна (RU); Горячев Владимир Владимирович (RU); Репин Вадим Сергеевич (RU); Шаменков Дмитрий Алексеевич (RU); Фатхудинов Тимур Хайсамудинович (RU); Сабурина Ирина Николаевна (RU); Макаров Андрей Витальевич (RU); Горностаева Светлана Николаевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: ЗАО "РеМеТэкс" (RU) 
(98) Адрес для переписки: 115478, Москва, Каширское ш., 24, стр.2, ЗАО "РеМеТэкс" 

(54) БИОТРАНСПЛАНТАТ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА
Изобретение относится к области биофармакологии и медицины и касается биотрансплантатов и способов лечения ишемической болезни сердца, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала или из ткани скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности. Способы включают введение биотрансплантатов в нативную и/или стенозированную коронарную атерию и/или аорто-коронарный шунт в виде суспензии. Изобретение обеспечивает получение биотрансплантатов для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на миокард человека. 5 н. и 9 з.п. ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины и касается приготовления генетически немодифицированной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека, фетальных миобластов и способа лечения ишемической болезни сердца.

Известно, что сердечно-сосудистые заболевания в развитых странах превратились в общенациональную проблему. Примерно половина смертей обусловлена именно этими заболеваниями и среди них лидирующее место занимает ишемическая болезнь сердца. 

Согласно определению в основе ишемической болезни сердца лежит несоответствие между потребностью мышцы сердца в кислороде и доставкой кислорода кровью, что обусловлено нарушением коронарного кровотока.

Ишемическая болезнь сердца, исходя из международной классификации болезней в ее десятом пересмотре, включает стенокардию (нестабильная стенокардия, стенокардия с документально подтвержденным спазмом, другие формы стенокардии), острый инфаркт миокарда (острый трансмуральный инфаркт, острый субэндокардиальный инфаркт миокарда, острый инфаркт миокарда неуточненный), повторный инфаркт миокарда, текущие осложнения острого инфаркта миокарда, другие формы острой ишемической болезни сердца (коронарный тромбоз, не приводящий к инфаркту миокарда, синдром Дресслера), хроническую ишемическую болезнь сердца (атеросклеротическая сердечно-сосудистая болезнь, атеросклеротическая болезнь сердца, перенесенный в прошлом инфаркт миокарда, аневризма сердца, аневризма коронарной артерии, ишемическая кардиомиопатия, бессимптомная ишемия миокарда).

Большие успехи достигнуты в направлениях профилактики, медикаментозного и инструментального лечения ишемической болезни сердца. Впервые появились такие эффективные антиатеросклеротические средства, как статины. Используются антиангинальные средства: -адреноблокаторы, нитраты и антагонисты кальция, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента.

У пациентов с критическим снижением массы жизнеспособного миокарда вследствие диффузного некроза и/или апоптоза ни хирургические, ни тем более терапевтические мероприятия не эффективны, поскольку сердце относится к нерегенерируемым органам. Кардиомиоциты перестают делиться сразу после рождения человека и в дальнейшем при их повреждении преобладают не пролиферативные процессы в паренхиме, а фибропластические реакции стромы, которые почти необратимы [3]. В подобных случаях единственным альтернативным методом лечения является лишь способ создания новых сократительных элементов путем трансплантации в миокард клеток для замещения функции погибших кардиомиоцитов или трансплантации целого органа.

Клеточная трансплантация обладает рядом важных преимуществ по сравнению с пересадкой целого органа (сердца) [2]:

заместительная клеточная терапия позволяет культуральными методами избавиться от примеси сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлекаются в процесс иммунного отторжения;

подсадку клеток можно регулировать по дозам и многократно повторять;

стоимость клеточной трансплантации значительно ниже, чем пересадки органа.

В настоящее время предпринимаются попытки трансплантации клеток костного мозга или специфически дифференцированных (кардиомиобласты, скелетные миобласты) клеток для улучшения сократительной функции миокарда при кардиомиопатии. Несмотря на значительное количество накопленных к настоящему времени данных, результаты пересадок противоречивы. С одной стороны, описана трансдифференцировка различных клеточных типов в кардиомиобласты, другими авторами показана невозможность нормального функционирования трансплантата, возникновение дополнительных очагов фиброза или элиминация донорских клеток.

Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, скелетные миобласты, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев может являться критической для ряда пациентов; клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей, обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ [4]:

фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;

пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез [5]

эмбриональные и фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию; 

культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.

Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологиях миокарда обладают мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способные не только заместить погибшие кардиомиоциты, но и обеспечить реваскуляризацию зоны фиброза. Кардиомиоциты человека, в основном, прекращают делиться вскоре после рождения. Однако недавние исследования показали, что в сердце взрослого человека сохраняется небольшая популяция кардиомиоцитов, способная к пролиферации. Являясь уникальной «фабрикой» цитокинов и факторов роста, донорские МСК обеспечивают активизацию собственных резервов организма.

Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако, существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых является стволовым. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются.

При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

В настоящее время существует два основных способа трансплантации клеточного материала в сердце: интамиокардиальный и интракоронарный. При интрамиокардиальном введении часть клеток (до 45%) гибнет от ишемии, поскольку уровень васкуляризации в месте введения может оказаться недостаточным [7].

Интрамиокардиальный способ введения не может обеспечить равномерного распределения клеточного материала в толще миокарда [6].

При использовании интрамиокардиального способа большинство исследователей отмечают у своих пациентов повышенную склонность к развитию различного рода аритмий в послеоперационном периоде (от желудочковой экстрасистолии до фибрилляции желудочков). Опыт свидетельствует об очень упорном течении этих аритмий и их рефрактерности к медикаментозной терапии. Подобных недостатков лишен метод интракоронарного введения клеточного трансплантата.

Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на миокард человека и разработка наиболее эффективного способа введения при ишемической болезни сердца.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения ишемической болезни сердца, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют; далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

В качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения ишемической болезни сердца, заключающийся в том, что МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фиобластов - 2 и 8 U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на см 2, при этом используют МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) тканей человека, и МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из тканей пациента (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань). 

Предложен биотрансплантат для лечения ишемической болезни сердца, содержащий фетальные миобласты, полученные из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включающий не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).

Предложен также способ получения биотрансплантата для лечения ишемической болезни сердца, заключающийся в том, что ткань скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина в течение 40-90 минут, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование, дезагрегацию монослоя раствором трипсина, при этом процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% CO2 .

Суспензию клеток засевают на среду, содержащую ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса, и клетки засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл.

Среду в процессе культивирования неоднократно меняют.

Способ лечения ишемической болезни сердца, заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аорто-коронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.

Биотрансплантат вводят с объемной скоростью, которая предотвращает вымывание клеток в аортальный кровоток.

Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные миобласты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15. 

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК).

МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Биоматериал от доноров получают как для аутотрансплантаций, так и для аллопересадок. Для успешного выделения МСК забирают не менее 5 мл аспирата костного мозга, от 1 см2 подкожной жировой клетчатки или от 1 см 2 тимуса (у детей до 6 лет). Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций. Наиболее эффективное выделение миогенных МСК из фетального биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например, тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см2 в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2 . Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлюэнтности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см 2 в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 U/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см 2 и выращивают до состояния преконфлюэнтности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. В плотнорастущих колониях возможно появление многоядерных симпластов (миотубов), что подтверждает правильность соблюдения режима культивирования. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

система отбора источников получения МСК позволяет получить культуры клеток с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке;

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток;

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур;

режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Остальные миобласты из скелетных мышц.

Культура получена из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности и содержит не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1) и не более 20% примесных клеток (фибробластов и эндотелиальных клеток).

Способ получения культуры скелетных миобластов характеризуется тем, что мышечную ткань фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течении 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,25% раствор трипсина. Суспензию первичных диссоциированных клеток засевают с плотностью не менее 1×106 кл./мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП «ПанЭко») и фактора роста эпидермиса EGF (5-10 нг/мл). 

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 5×10 кл./мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% углекислого газа.

Трансплантацию осуществляют в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения гомогенной взвеси клеток в нативные и/или стенозированные коронарные артерии и/или аорто-коронарные шунты. Взвесь суспендирована в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов, предотвращающей их быструю агрегацию.

В процессе выполнения процедуры необходимо постоянное перемешивание суспензии для поддержания клеток во взвешенном состоянии.

Доступ к нативным и/или стенозированным коронарным артериям и/или аорто-коронарным шунтам осуществляется по стандартной методике через бедренную артерию с использованием катетеров Judkins и Sones. После выполнения коронаро- и/или шунтографии по стандартной методике, оценивается объем миокарда левого желудочка, кровоснабжаемого каждым из коронарных сосудов и/или аорто-коронарных шунтов. Распределение общей дозы клеток для введения в каждый из коронарных сосудов и/или аорто-коронарных шунтов производится прямо пропорционально этому объему. Введение клеток осуществляют стерильным шприцом.

Введение клеточного трансплантата осуществляется в три этапа:

1. Первый этап - установка катетера в устье коронарной артерии. На этом этапе следует подобрать такой диаметр катетера, который позволял бы установить его кончик на расстояние не менее 4-5 мм дистальнее устья коронарной артерии или аорто-коронарного шунта без значимого нарушения коронарного кровообращения (т.е. при отсутствии у пациента загрудинных болей).

2. Второй этап - подбор оптимальной объемной скорости введения клеточной взвеси. Для этого в установленный согласно п.1 катетер хирург с помощью инфузомата вводит контрастное вещество. Объемная скорость введения подбирается такой, какая предотвращает вымывание контраста в аортальный кровоток.

3. Третий этап - собственно введение клеточной взвеси с помощью инфузомата с объемной скоростью, определенной на этапе 2.

Окончание процедуры не отличается от такового после рутинной коронарографии.

В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Выписка на 2-е сутки с рекомендацией контрольного осмотра через 1 месяц.

В ИСК и КТ совместно с Самарским областным кардиологическим диспансером разработана и реализуется программа клинического исследования по применению клеточной кардиомиопластики при ИКМП и ДКМП. С февраля 2003 г. в Самарском кардиологическом диспансере было проведено 8 операций интракоронарного введения аллогенных фетальных скелетных миобластов при ишемической болезни сердца.

В группе больных (средний возраст 52,4±5,8 года) с ИБС 3 пациента перенесли ИМ, у 2 больных два ИМ в анамнезе, всем пациентам за 2 года и более проводилась операция АКШ. Диагноз у всех пациентов устанавливался на момент операции и формулировался как ИБС, ишемическая кардиомиопатия, постинфарктный кардиосклероз, состояние после аорто-коронарного шунтирования, гипертоническая болезнь 2-3 стадии, хроническая сердечная недостаточность 2б функционального класса (3-4 класса по NYHA). В период провидения исследования все пациенты получали стабильную медикаментозную терапию средними терапевтическими дозами ингибиторов АПФ, -адреноблокаторами, диуретиками.

На протяжении всего исследования пациенты не получали иммуносупрессивной терапии.

В контрольную группу включены пациенты с аналогичным диагнозом, с хронической сердечной недостаточностью 2б функционального класса, получающие соответствующую стабильную медикаментозную терапию, 14 пациентов с ИБС.

Всем пациентам проводили динамическое обследование пациентов: общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ, ЭхоКГ, ангиокардиография, в том числе по методике Centrline.

Имплантацию осуществляли в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения суспензии аллогенных скелетных миобластов 10 млн. кл./кг массы тела в 100 мл физиологического раствора в аорто-коронарные шунты. Доступ к коронарным артериям и аорто-коронарным шунтам осуществляли по стандартной методике через бедренную артерию. В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления.

В раннем послеоперационном периоде ни у одного из пациентов не наблюдалось каких-либо реакций, побочных эффектов или осложнений, связанных с процедурой.

Через 1-3 месяца после имплантации все пациенты отмечали улучшение самочувствия, объективно наблюдалось улучшение общего состояния, повышение толерантности к физическим нагрузкам, уменьшение одышки, периферических отеков, гепатомегалии, при инструментальном обследовании выявлено незначительное уменьшение объемов сердца, размеров зон гипокинетичного миокарда, увеличение ФВ ЛЖ. В контрольной группе в условиях стабильной медикаментозной терапии состояние и клинико-лабораторные показатели пациентов не изменились или отмечалась отрицательная динамика. 

Больной Т., 54 лет, поступил в Самарский областной клинический кардиологический диспансер с жалобами на выраженную общую и мышечную слабость, быструю утомляемость, одышку при незначительной физической нагрузке, иногда - в состоянии покоя, отеки на нижних конечностях, доходящие до уровня верхней трети голеней, чувство дискомфорта в области правого подреберья.

Из анамнеза известно - перенес два инфаркта миокарда (в 1996 и 1997 годах). В 1998 году пациенту проведена операция аорто-коронарного шунтирования и вентрикулопластика по Дору. После операции чувствовал себя несколько лучше в течение полутора лет, после чего вновь вернулась одышка при незначительной физической нагрузке, а зачастую и в покое.

При объективном исследовании отмечен цианоз кожи и видимых слизистых оболочек, похолодание кожи конечностей. Аускультативно в легких - на фоне жесткого дыхания в нижних отделах выслушиваются влажные мелкопузырчатые хрипы. Тоны сердца глухие, ритм правильный. ЧСС 84 в 1 мин. Печень выступает из-под края реберной дуги на 4 см, болезненна при пальпации, гладкая, край ее закруглен.

Общий анализ крови: гемоглобин - 130 г/л, эритроциты - 4,2·1012 в 1 л, лейкоциты - 6,8·109 в 1 л, СОЭ - 18 мм/ч.

Биохимические показатели: билирубин общий - 29 мкмоль/л, белок общий - 70 г/л, мочевина 7,3 ммоль/л, креатинин - 149 мкмоль/л, коэффициент атерогенности 4,9.

ЭКГ: ритм синусовый, вертикальное положение ЭОС, гипертрофия ЛЖ с изменениями комплекса QRS, гипертрофия ПЖ.

ЭхоКГ: Регургитация на митральном клапане 1 ст. Диаметр основания аорты 32 мм. Регургитации на аортальном клапане нет. Градиент между ЛЖ и аортой 11 мм рт.ст. Регургитация на трехстворчатом клапане 1 ст. Систолический градиент на трехстворчатом клапане 47 мм рт.ст. Диаметр легочной артерии 29 мм. Давление в легочной артерии 41 мм рт.ст. Недостаточности клапана легочной артерии нет. Передне-задний размер ЛП 47 мм. Медиально-латеральный размер ЛП 48 мм. Верхне-нижний размер ЛП 60 мм. КДРЛЖ 74 мм, КСРЛЖ 61 мм, КДОЛЖ 164 мл, КСОЛЖ 94 мл, ФВ 32% (по Симпсону 25%). Толщина МЖП 8/9 мм. Толщина задней стенки ЛЖ 11/17 мм. Гипокинезия апикально-латерального сегмента, апикального сегмента предсердной стенки. Акинезия верхушки, апикально-септального сегмента.

Ангиокардиография: КДО 317 мл, КСО 207 мл, УО 57 мл, ФВ 27%. При исследовании по методике Centraline 50% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипо- и акинезии, а уровень сократимости остальных 50% миокарда находился на нижней границе нормы.

Поставлен диагноз: ИБС. Ишемическая кардиомиопатия. Постинфарктный кардиосклероз (1996, 1997). Состояние после аорто-коронарного шунтирования и резекции ЛЖ (1998). Гипертоническая болезнь 3 стадии. Хроническая сердечная недостаточность 2б функционального класса (3-4 класса по NYHA).

10 ноября 2003 года больному проведена операция коронаро-вентрикулографии с интракоронарным введением клеточного биотрансплантата.

В течение 16 часов после операции пациент наблюдался в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Послеоперационное течение гладкое. Больной выписан на 2-е сутки. 

При контрольном осмотре через 7 месяцев пациент отмечает значительное улучшение состояния, уменьшение слабости, утомляемости. Одышка возникает только при физической нагрузке. Без остановки поднимается на 3-4 этаж. Отеков нет, отмечает пастозность стоп к вечеру. Сохраняется дискомфорт в правом подреберье.

При осмотре кожа и видимые слизистые обычной окраски. Аускультативно в легких дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны сердца глухие, ритм правильный. ЧСС 76 в 1 мин печень выступает из-под края реберной дуги на 1 см.

Лабораторные показатели крови без существенной динамики.

ЭхоКГ: Регургитация на митральном клапане 1 ст. Диаметр основания аорты 32 мм. Регургитации на аортальном клапане нет. Регургитация на трехстворчатом клапане 1 ст. Систолический градиент на трехстворчатом клапане 36 мм рт.ст. Диаметр легочной артерии 27 мм. Давление в легочной артерии 38 мм рт.ст. Недостаточности клапана легочной артерии нет. Передне-задний размер ЛП 40 мм. Медиально-латеральный размер ЛП 52 мм. Верхне-нижний размер ЛП 52 мм. КДРЛЖ 66 мм, КСРЛЖ 49 мм, ФВ 49% (по Симпсону 42%). Толщина МЖП 9/13 мм. Толщина задней стенки ЛЖ 9/17 мм. Гипокинезия верхушки, септально-апикального сегмента, апикального сегмента МЖП, передней стенки, латерально-апикального сегмента.

Ангиокардиография - КДО - 189 мл, КСО - 138 мл, УО - 110 мл, ФВ 37%. При исследовании по методике Centraline 30% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипокинезии, уровень сократимости 25% миокарда на нижней границе нормы, а сократимость 45% сегментов миокарда была нормальной. 

По результатам обследования данного пациента через 7 месяцев после операции улучшились общее состояние и клинико-лабораторные показатели. По ЭхоКГ ФВ возросла на 12%, КДОЛЖ уменьшился на 2,8%, при проведении ангиокардиографии в динамике значимо уменьшился размер зоны гипокинетичного миокарда.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии каких-либо побочных эффектах и осложнений в ранний и поздний послеоперационный период при интракоронарном введении алогенных скелетных миобластов без проведения иммуносупрессии. Кроме того, получены предварительные данные о эффективности клеточной кардиомиопластики при хронической ишемической болезни сердца.

Источники информации

1. В.Ю.Мареев, Ю.Н.Беленков. Перспективы в лечении хронической сердечной недостаточности.

2. Репин В.С, Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М., РАМН: БЭБиМ, 1998. - 200 с.

3. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М., Медицина, 1979. - 284 с.

4. Сухих ГТ. Трансплантация фетальных тканей и клеток: настоящее и будущее. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1998; 126 (приложение 1): 3-13.

5. Leor J., Patterson M., Qumones M.J. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium. Circulation 1996; 94 [suppl II]: II-332-II-336.

6. Suzuki K., Brand N.J., Morrison K.J. et al. Development of a Novel Method for Cell Transplantation via Coronary Artery. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-164.

7. Zhang M., Murry C.E. Death of Grafted Cardiomyoctyes Limits Formation of New Myocardium in Injured Hearts. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-837.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Биотрансплантат для лечения ишемической болезни сердца, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют, далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

2. Биотрансплантат по п.1, где в качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

3. Биотрансплантат по п.1, где в качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации. 

4. Способ получения биотрансплантата для лечения ишемической болезни сердца, характеризующийся тем, что МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фиброластов - 2 и 8 U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на 1 см2.

5. Способ по п.4, где используют МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке выделенные из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) тканей человека.

6. Способ по п.4, где используют МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из тканей пациента (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань).

7. Биотрансплантат для лечения ишемической болезни сердца, характеризующийся тем, что он содержит фетальные миобласты, полученные из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).

8. Способ получения биотрансплантата для лечения ишемической болезни сердца, характеризующийся тем, что ткань скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина, в течение 40-90 мин, полученную суспензию диссоциированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование, дезагрегацию монослоя раствором трипсина, при этом процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% CO2 .

9. Способ по п.8, где суспензию клеток засевают на среду, содержащую ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса.

10. Способ по п.8, где клетки засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл.

11. Способ по п.4, где среду в процессе культивирования неоднократно меняют.

12. Способ лечения ишемической болезни сердца, характеризующийся тем, что биотрансплантат по п.1 и/или 7 вводят в нативную и/или стенозированную коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.

13. Способ по п.12, где биотрансплантат вводят с объемной скоростью, которая предотвращает вымывание клеток в аортальной кровоток.

14. Способ по п.12, где мезенхимальные стволовые клетки и фетальные миобласты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.