СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА


RU (11) 2252962 (13) C1

(51) 7 C12P21/00, A61K39/10 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 29.08.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.05.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004101021/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.01.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.01.19 
(45) Опубликовано: 2005.05.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2086258 С1, 10.08.1997. RU 2085212 С2, 27.07.1997. RU 2133470 С1, 20.07.1997. 
(72) Имя изобретателя: Желудков М.М. (RU); Яшина Н.В. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Желудков Михаил Михайлович (RU); Яшина Наталия Вячеславовна (RU) 
(98) Адрес для переписки: 121374, Москва, ул. Багрицкого, 12, кв.56, Н.В. Яшиной 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА
Изобретение относится к микробиологии и иммунологии и может найти применение в ветеринарии. Для осуществления способа культивируют вакцинный штамм Brucella abortus 104 биовар 1, отмывают микробные клетки. Далее осадок ресуспендируют щелочью, предпочтительно, 0,5 N раствором NaOH при постоянном помешивании до конечной концентрации микробных клеток 1×1011 м.кл. в 1 мл. Проводят гидролиз при температуре 55-57°С при постоянном перемешивании в течение 10-12 мин с последующим охлаждением при температуре (4-6)°С в течение не менее 30 мин. Затем суспензию нейтрализуют 2N уксусной кислотой и осаждают антиген этанолом, предпочтительно, при соотношении бруцеллезный антиген/этанол, равном 1:10. Использование изобретения позволяет упростить способ, сокращает его длительность и позволяет увеличивать выход бруцеллезного антигена до 30% (на сухой вес микробной массы). 2 з.п. ф-лы, 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицине и ветеринарии, и может быть использовано для производства бруцеллезных диагностикумов.

Известен способ получения бруцеллезного антигена, используемый для диагностики бруцеллеза, включающий культивирование бруцелл, инактивацию бактериальных клеток нагреванием и окрашивание (RU 2133470 С1, 20.07.1999). Однако антиген, полученный этим способом, используется только для постановки реакций агглютинации Райта и Хеддльсона.

Известен также способ получения единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Он включает культивирование штамма В. abortus 19, концентрирование и очистку на ультрафильтрационной установке, а также инактивацию антигена в биореакторе при температуре 80°С в течение часа (RU 2085212 С1, 27.07.1997). Этот способ требует специальных технических средств для его реализации.

Известен также способ получения бруцеллезного антигена, включающий выращивание бруцелл, отмывку микробных клеток, обработку их щелочью, нейтрализацию уксусной кислотой, осаждение ацетоном и/или этиловым спиртом, высушивание. Антиген, полученный данным способом, используют для постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции нейтрализации антител (РНАт) и в реакции агрегат-гемагглютинации (РАГА) (RU 2086258 C1, 10.08.1997) - ближайший аналог.

Однако этот способ получения бруцеллезного антигена имеет недостатки: используется вакцинный штамм В. abortus 19, который нестабилен, подвержен диссоциации, вследствие чего наблюдается низкий выход антигена. Кроме того, велика длительность процесса получения бруцеллезного антигена - от момента культивирования она составляет 7 суток.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода антигена, упрощение технологии, сокращение длительности процесса получения антигена.

Технический результат - повышение выхода антигена, упрощение технологии и сокращение длительности процесса достигается тем, что способ получения бруцеллезного антигена включает культивирование вакцинного штамма Brucella abortus, отмывание микробных клеток, их ресуспендирование щелочью с последующей нейтрализацией 2N уксусной кислотой, осаждение этанолом целевого продукта и высушивание.

Культивируют вакцинный штамм Brucella abortus 104 биовар 1, регистрационный номер 1425 в музее живых культур бруцелл ГУНИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, при этом после обработки микробных клеток щелочью проводят гидролиз при температуре 55-57°С при постоянном перемешивании в течение 10-12 мин с последующим охлаждением при температуре 4-6°С в течение не менее 30 мин.

Способ может характеризоваться тем, что ресуспендирование микробных клеток проводят 0,5 N раствором щелочи при постоянном перемешивании до конечной концентрации 1×1011 микробных клеток в 1 мл.

Способ может характеризоваться также тем, что целевой продукт осаждают этанолом при соотношении объемов бруцеллезный антиген/этанол, равном 1:10.

Изобретение характеризуется использованием вакцинного штамма B.abortus 104 биовар 1, регистрационный номер 1425 в музее живых культур бруцелл ГУНИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, обладающего высокой стабильностью, более полноценной антигенной структурой и обильным ростом на плотных питательных средах. Он представляет собой типичный и стойкий S-вариант; не образует H2S; растет на средах с фуксином и не растет на средах с тионином; агглютинируется сывороткой анти-abortus и не агглютинируется сывороткой анти-melitensis.

Для реализации способа не требуется какого-либо специального оборудования. Штамм культивируют на плотных питательных средах в стеклянных матрацах, гидролиз бактериальной суспензии проводят с использованием водяной бани и холодильника, а осаждение осуществляют центрифугированием.

Как показали эксперименты, рекомендованный режим последовательных процессов нагревания (56±1°С) в течение 10-12 мин и охлаждения (4-6°С) в течение не менее 30 мин оптимален для проведения полного гидролиза, сопровождающегося экстракцией антигенов из клеточной стенки бруцелл.

Пример. Бруцеллы вакцинного штамма В. abortus 104 биовар 1 выращивали в течение 48 ч. Микробные клетки смывали нейтральным физиологическим раствором (НФР), центрифугировали, осадок промывали трехкратно НФР при центрифугировании. Далее осадок ресуспендировали 0,5 N раствором NaOH при постоянном перемешивании до конечной концентрации суспензии 1×1011 микробных клеток в 1 мл. Затем проводили гидролиз суспензии при температуре 56±1°С при постоянном перемешивании в течение 10 мин и охлаждали при температуре +4°С в течение 30 мин. Далее суспензию нейтрализовали 2 N уксусной кислотой до рН=7,0, проводили осаждение антигена этанолом в соотношении объемов 1:10, осадок отделяли центрифугированием и лиофилизировали.

В табл.1 представлена сравнительная характеристика параметров способов, а в табл.2 - сравнительная иммунохимическая характеристика и основной состав бруцеллезных антигенов, полученных патентуемым способом и способом - ближайшим аналогом.

Из представленных данных табл. 1 видно, что патентуемый способ позволяет повысить выход бруцеллезного антигена в 2 раза, а также сократить длительность процесса получения антигена более чем в 1,5 раза (с 7 сут до 4 сут).

Из табл.2 следует, что способ позволяет получить полноценный антиген белковолипополисахаридной природы.

Из результатов исследований также следует, что полученный бруцеллезный антиген может быть использован не только как антиген для постановки РНГА, РНАт, ИФА, но также и в реакции агглютинации латекса (РАЛ). 

Таблица 1. 
Сравнительная характеристика предлагаемого способа получения бруцеллезного антигена и прототипа 
№ п/п Характеристика Предлагаемый способ получения антигена Прототип 
1. Выход антигена в % (на сухой вес микробной массы) 30 15 
2. Использование штамма-продуцента Вакцинный штамм В. abortus 104 биовар 1 Вакцинный штамм В. abortus 19 
3. Время приготовления антигена с момента культивирования в сут. 4 7 
4. Применение бруцеллезного антигена РНГА, РНАт, ИФА. РАЛ для получения противобруцеллезной сыворотки высокой активности и специфичности РНГА, РНАт, РАГА,

для получения противобруцеллезной сыворотки высокой активности и специфичности 


Таблица 2. 
Характеристика бруцеллезных антигенов, полученных предлагаемым способом и известньм способом (прототип) 
Бруцеллезный антиген, полученный способом Серологическая активность в титрах: Содержание в % (на сухой вес антигена) 
реакции кольцепреципитации РНГА Общие сахара Белок Общие липиды Нуклеиновые кислоты 
Предлагаемый 1;256000 1:12800 42 36 15 5 
Прототип 1:128000 1:12800 38 25 12 3 





ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ получения бруцеллезного антигена, включающий культивирование вакцинного штамма Brucellа abortus, отмывание микробных клеток, их ресуспендирование щелочью с последующей нейтрализацией 2N уксусной кислотой, осаждение этанолом целевого продукта и высушивание, отличающийся тем, что культивируют вакцинный штамм Brucellа abortus 104 биовар 1 регистрационный номер 1425 в музее живых культур бруцелл ГУНИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, при этом после обработки микробных клеток щелочью проводят гидролиз при температуре 55-57°С при постоянном перемешивании в течение 10-12 мин с последующим охлаждением при температуре (4-6)°С в течение не менее 30 мин.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ресуспендирование микробных клеток проводят 0,5N раствором щелочи при постоянном перемешивании до конечной концентрации 1×1011 м.кл. в 1 мл.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что целевой продукт осаждают этанолом при соотношении объемов бруцеллезный антиген:этанол, равном 1:10.