СРЕДСТВО

СРЕДСТВО "ЦЕРЕБРАЛ" ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛЬТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2151605 (13) C1

(51) 7 A61K35/30 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.06.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 98115191/14 
(22) Дата подачи заявки: 1998.08.05 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.08.05 
(31) Номер конвенционной заявки: 97125796 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1997.12.03 
(33) Страна приоритета: UA 
(45) Опубликовано: 2000.06.27 
(56) Аналоги изобретения: 1. RU 2104702 C1, 20.02.98. 2. US 4067963, 10.01.78. 3. FR 2657784, 08.09.91. 4. EP 0464206, 08.01.92. 5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1986, ч.2, с.99. 6. Cerebrolysin. EBEWE PHARMACEUTICALS LTD. Austria. 
(71) Имя заявителя: Макаренко Александр Николаевич (UA) 
(72) Имя изобретателя: Макаренко Александр Николаевич (UA); Королев Юрий Никифорович (UA) 
(73) Имя патентообладателя: Макаренко Александр Николаевич (UA) 
(98) Адрес для переписки: 254073, г.Киев, ул.Фрунзе 172, кв.77, Макаренко Александр Николаевич 

(54) СРЕДСТВО "ЦЕРЕБРАЛ" ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛЬТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 

Изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано при получении средств для лечения инсульта в остром и острейшем периодах его развития. Способ получения средства для лечения инсульта, который состоит в дроблении мозга свиней, предварительно подвергшихся моделированию двустороннего геморагического инсульта, гомогенизации в среде pH 7,3 - 7,6, отделении от гомогената нерастворимых фрагментов, экстракции гексаном из полученной жидкой смеси липидных компонентов, осветляющей и стерилизующей фильтрации и лиофилизации замороженного при температуре -30oС продукта. Средство характеризуется наличием специфических травмотрофических пептидов с мол. массой 400 - 1500 Д, а ряд доминирующих аминокислот представлен аспарагиновой, глутаминовой, аланином, глицином и серином. Технический результат: создание средства для лечения инсульта нового качественного состава, который достигается особенностью операций и режимов способа его получения, в результате чего полученный способ приобретает высокую активность, повышается эффективность лечения и расширяется существующий арсенал лекарственных средств, направленных на лечение инсульта. 2 с. п. ф-лы, 3 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано при получении средств для лечения инсульта в остром и острейшем периодах его развития.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является средство для лечения геморагического или ишимического инсультов "Церебролизин" фирмы Ebewe (Австрия), который является продуктом обработки мозга интактных свиней. В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (~85%), пептин (~15%), микроэлементы, вода. Трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов, а доминирующими аминокислотами, определяющими свойства препарата, являются лизин, лейцин и аланин. Препарат-прототип предназначен для внутривенного введения (Справочник по клинической фармакологии. Под ред. И. С.Чекмана, А.П.Полещука, О.А. Пятака. Киев, "3доров'я", 1987 г.).

"Церебролизин" обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время.

Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, короткий период ремиссии, его низкая активность, что в целом характеризует его как недостаточно эффективный.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения "Церебролизина" (Машковский М. Д. Лекарственные средства, М., "Медицина" 1986, т. 2, с. 99).

В способе-прототипе в качестве исходного сырья используют мозг интактных свиней, его подвергают дроблению, гомогенизации, после чего полученный гомогенат подвергают дальнейшей обработке, основной стадией который является гидролиз.

Известный способ позволяет получать средство для лечения инсульта, характеристика которого упомянута выше. Способ является простым в исполнении, пердполагает использование легко доступного сырья.

Однако недостатком способа является то, что совокупность его действий и режимов такова, что не обеспечивает достаточно высокой активности средства для лечения инсульта.

Задачей настоящего изобретения является создание средства для лечения инсульта нового качественного состава, который достигается особенностью операций и режимов способа его получения, в результате чего полученный способ приобретает высокую активность, повышается эффективность лечения и, кроме того, расширяется существующий арсенал лекарственных средств, направленных на лечение инсульта.

Поставленная задача достигается тем, что средство для лечения инсульта, выделенное из мозга свиней и содержащее в себе ряд доминирующих аминокислот, согласно изобретению характеризуется наличием специфических травмотрофических пептидов с мол.массой 400 - 1500 Д, а ряд доминирующих аминокислот представлен аспарагиновой, глутаминовой, аланином, глицином и серином.

Полученное средство является аминокислотно-пептидным комплексом, особенность которого определяет его специфичность и активность. Среди травмотрофических пептидов, которые в наибольшей степени определяют свойства заявляемого средства, являются нейротрофины.

Авторами настоящего изобретения определено, что молекулярная масса специфических травмотрофических пептидов находится в диапазоне 400-1500 Д, а аминокислотный состав заявляемого средства представлен 18 аминокислотами, доминирующими среди которых, а поэтому в значительной степени влияющими на его свойства, являются аспарагиновая, глутаминовая, аланин, глицин и серин. В табл. 1 приведен аминокислотный состав заявляемого средства "Церебрал" и известного "Церебролизина" (в % мМ).

Высокая активность заявляемого средства и его достаточная концентрация составляют ту особенность, которая позволяет вводить его как капли в нос, что очень удобно и способствует достижению быстрого лечебного эффекта, поскольку препарат попадает в мозг, обходя гематоэнцефалический барьер.

Для определения активности и эффективности заявляемого средства были проведены опыты на 71 полозрелых котах обоих полов, у которых предварительно моделировали двусторонний геморагический инсульт (а. с. СССР N 1767518 от 08.06.1992 г.).

Степень тяжести инсульта была приблизительно одинаковой и контролировалась при неврологическом обследовании (геми и тетрапарез, плегия, анастезия, нистагм и др.). Животные были разделены на 3 группы - контрольную (n= 25) и 2 опытные, которые получали соответственно "Церебролизин" (n=22) и "Церебрал" (SNC-TTR) (n=24). За три дня после восстановления геморагического инсульта животные, которые выжили, единоразово получили соответствующее лечение: животные контрольной группы - физиологический раствор (0,85% раствор NaCl в/бр), а опытной - соответственно "Церебролизин" (1 мл/кг; в/бр) или "Церебрал" (SNC-TTR) (1 мл 2,5% раствора; в/бр). На основании 14-дн. исследования ЭКоГ различных зон неокортекса, восстановления поведенческих и, наконец, данных биопсинного исследования сенсомоторного неокортекса был сделан вывод, что противоинсультная эффективность "Церебрала" в 2-3 раза превышает таковую часто, длительно и в больших дозах препарата "Церебролизина", который назначается для лечения геморагического и ишимического инсульта у больных (табл. 2). О высокой противоинсультной эффективности "Церебрала" по сравнению с "Церебролизином" свидетельствуют восстановление вольтажа ЭКоГ и нормализация ее ритмов уже на 4-6 сутки после моделирования инсульта и, соответственно, на 8-10 сутки после использования "Церебролизина". По сравнению с контролем в 2,6 раза ускоряется восстановление самостоятельной ходьбы, пищевого и Мангус-рефлекса (и в 1,6 раза при введении "Церебролизина").

Еще более выразительно эти различия проявляются при исследовании выживаемости животных, при этом "Церебрал" фактически в 2 раза превышает "Церебролизин" по данным показателям. В табл. 3 этот вывод детализирован и уточнен. После начала лечения животных с 3-го дня заболевания уровень смертности животных, которым вводился "Церебрал", уменьшается в 2 раза по сравнению с животными, которые получали "Церебролизин", и в три раза по сравнению с контролем.

Упомянутое лечебное средство обладает чрезвычайно низкой токсичностью, полной совместимостью с другими видами терапии, не вызывает аллергических реакций и побочных эффектов, противопоказаний не выявлено.

Средство проявляет выразительный неотропный эффект и цитопротекторное действие, оказывает регулирующее влияние на биоэлектрическую активность мозга.

Кроме того, поставленная задача решается тем, что в способе получения средства для лечения инсульта, который состоит в дроблении мозга свиней, его гомогенизации и последующей обработки гомогената, полученному согласно изобретению, дробят мозг свиней, предварительно подвергшихся моделированию двустороннего геморагического инсульта, из полученного гомогената при рН 7,3-7,6 с концентрацией раздробленных частей мозга не более 20% выделяют нерастворимые фрагменты, после чего из оставшейся жидкой смеси после добавления в нее гексана в соотношении 1:(3-5) экстрагируют липидные компоненты, выделяют экстракт и осуществляют фильтрацию полученной смеси до достижения ее осветления, после чего - стерилизующую фильтрацию, а замороженный при температуре -30oC полученный фильтрат лиофилизуют.

При осуществлении заявляемого способа в качестве исходного сырья используют мозг свиней, которые предварительно были подвергнуты моделированию двустороннего геморагического инсульта согласно известной методики. Из мозга свиней преимущественно брали его цереброкортекс (неокортекс), поскольку эта часть мозга обладает максимальным количеством нейротрофических и цитопротекторных факторов. Выбор мозга свиней в качестве исходного сырья обусловлен тем, что эти животные наиболее близки к людям, более устойчивы к заболеваниям и, кроме того, более доступны и экономически целесообразны в промышленном выпуске препарата.

Во время моделирования геморагического инсульта у животных развивается соответствующая реакция, при которой клетки мозга выделяют ростовые факторы (нейротофины), оказывающие на них защитное влияние, вызывает ускоренный фармакотерапевтический эффект.

Все операции и режимы способа взаимосвязаны и такая связь позволяет придать заявляемому способу для лечения инсульта желаемые свойства.

Мозг свиней с опытным геморагическим инсультом подвергают дроблению, после чего гомогенизируют его в выбранной определенным образом среде при pH 7,3-7,6, при выборе среды ориентируются на максимальное сохранение клеток мозга. На этой стадии существенно устанавливать концентрацию раздробленных частей мозга не более 20%, поскольку при более высоких концентрациях возникают трудности технологического характера. Концентрация гомогената является одним из факторов, от которого зависят свойства получаемого лечебного средства.

Из полученного гомогената необходимо выделить разрушенные фрагменты клеток, которые препятствуют дальнейшей концентрации активного аминокислотно-пептидного комплекса. Указанную операцию осуществляют, например, центрифугированием.

Полученную жидкую смесь после отделения нерастворимых фрагментов смешивают с гексаном в соотношении 1:(3-5), которое соответствует максимально возможной экстракции липидных компонентов. Выбор гексана в качестве экстракта для липидных компонентов обусловлен его дополнительными преимуществами, а именно он малотоксичен, что существенно, поскольку получают лечебное средство, кроме того, он действует как консервант, т.е. обладает противомикробной активностью.

После отделения экстракта, содержащего липидные продукты, проводят фильтрацию оставшейся жидкости (просветляющую фильтрацию), которая предназначена для удаления больших молекул, липопротеинов, микробов, оставшихся липидов и т.п.

И наконец, стерилизующая фильтрация необходима для удаления вирусов, микробов, агрегатов молекул.

Все предыдущие операции заявляемого способа позволили максимально выделить компоненты, которые снижают активность полученного средства.

Полученный фильтрат замораживают при температуре -30oC, в этих условиях возникают структурные изменения полученного продукта, что способствует оптимизации последующего процесса лиофильной сушки, т.е. максимальному сохранению биологической активности аминокислотно-липидного комплекса.

Изобретение поясняется конкретным примером его воплощения.

Пример. После промышленного забоя опытных свиней - самок в возрасте 1-1,5 лет массой 100-150 кг производили отсечение головы, извлекали мозг, высушивали его от крови, после чего на холоде выделяли цереброкортекс, дробили его до состояния фарша.

Для приготовления 10% гомогената брали соответствующее количество фарша и смешивали его со средой гомогенизации, представляющей собой раствор 0,34 М цукрозы и 0,005 М трис - HCl - буфера (рН 7,4) и гомогенизировали смесь с помощью гомогенизатора РТ-2 при температуре (-3oC) - (-4oC) в течение 3 - 4 минут.

После этого полученную смесь центрифугировали при 780 g в течение 20 минут, осадок отделяли, а супернатант смешивали в делительной воронке с гексаном в соотношении 1:3. Экстракцию выполняли дважды, экстракт отделяли.

Затем жидкость после отделения экстракта фильтровали на фильтре с размером пор 0,48 мкм в течение 2 часов, в результате чего произошло осветление жидкости.

Затем проводили стерилизующую фильтрацию с использованием фильтров с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат разливали по 2 мл в ампулы объемом 5 мл, содержимое замораживали при температуре -30oC и выдерживали в таких условиях не менее 20 часов, проводили лиофилизацию замороженного продукта.

Осветляющую и стерилизующую фильтрации, лиофилизацию и запайку ампул проводили в стерильных условиях.

Полученный препарат представляет собой пышный порошок белого цвета, хорошо растворимый в воде и спирте. Другие особенности полученного способа "Церебрал" приведены выше.

Таким образом, заявляемое средство имеет выразительную противоинсультную активность.

Проведенные опыты на животных позволяют сделать вывод, что "Церебрал" способен оказывать высокое фармакологическое воздействие на больных инсультом в остром и острейшем периодах его развития. Природа полученного способа определяет его использование не только для лечения инсульта, но и для других заболеваний, связанных с поражением головного мозга, в частности: ДЦП, рассеяный склероз и др.

Кроме того, заявляемый способ с указанными выше свойствами получают в такой концентрации активных компонентов, которая определяет простой и легкодоступный для больного способ его применения.

Способ получения предлагаемого средства является простым в выполнении и пригодным для широкого внедрения.

Кроме того, преимуществом заявляемого решения является расширение существующего арсенала противоинсультных лечебных средств. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Средство для лечения инсульта, выделенное из мозга свиней и содержащее в себе ряд доминирующих аминокислот, отличающееся тем, что он выделен из мозга свиней, предварительно подвергшихся моделированию двустороннего геморагического инсульта, и характеризуется наличием специфических травмотрофических пептидов с мол.массой 400 - 1500 Д и рядом доминирующих аминокислот: аспаргиновой, глутаминовой, аланина, глицина и серина.

2. Способ получения средства для лечения инсульта, который состоит в дроблении мозга свиней, его гомогенизации и последующей обработки гомогената, отличающийся тем, что дробят мозг свиней, предварительно подвергшихся моделированию двустороннего геморагического инсульта, из полученного гомогената при рН = 7,3 - 7,6 с концентрацией раздробленных частей мозга не более 20% выделяют нерастворимые фрагменты, после чего из оставшейся жидкой смеси после добавления в нее гексана в соотношении 1 : (3 - 5) экстрагируют липидные компоненты, выделяют экстракт и осуществляют фильтрацию полученной смеси до достижения ее осветления, после чего - стерилизующую фильтрацию, а замороженный при температуре -30oC полученный фильтрат лиофилизуют.