СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ ОДНОВРЕМЕННЫМ ВЫЯВЛЕНИЕМ IGG АНТИТЕЛ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ ОДНОВРЕМЕННЫМ ВЫЯВЛЕНИЕМ IGG АНТИТЕЛ


RU (11) 2213972 (13) C1

(51) 7 G01N33/53, G01N33/569 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002124823/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.09.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.09.19 
(45) Опубликовано: 2003.10.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2126154 C1, 10.02.1999. БОРИСОВА А.М. и др. Некоторые новые данные по оценке гуморального звена иммунитета у больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких. Иммунология, 1996, №5, с.61-67. КУЛАКОВ А.В. Новые подходы в изучении антибактериального гуморального иммунитета при вторичных иммунодефицитных состояниях. Автореф. докт. дисс. - М., 1997. 
(71) Имя заявителя: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 
(72) Имя изобретателя: Ванеева Н.П.; Ястребова Н.Е.; Ёлкина С.И.; Сергеев В.В.; Цветкова Н.В.; Калина Н.Г. 
(73) Имя патентообладателя: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 
(98) Адрес для переписки: 105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, директору Б.Ф. Семенову 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ ОДНОВРЕМЕННЫМ ВЫЯВЛЕНИЕМ IGG АНТИТЕЛ 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния гуморального иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100 - 1:1600, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий, определяют разность между величиной оптической плотности исследуемого образца и отрицательного контроля и при разности, большей или равной 0,3, определяют повышение активности гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям. Техническим результатом является определение активности гуморального иммунитета в отношении условно-патогенных бактерий. 6 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к методам иммуноферментного анализа антител к условно-патогенным бактериям, и может быть использовано для одновременного выявления IgG антител к антигенам условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека для определения состояния гуморального иммунитета.

Известен способ выявления высокоафинных поли- и моноклональных антител к водонерастворимым гаптенам путем инкубирования исследуемой пробы с антигеном, выделением полученного иммунного комплекса с последующей его детекцией, в качестве антигена используют соответствующее водонерастворимое поликонденсированное ароматическое или гетероциклическое соединение, предварительно конденсированное с радиоактивно меченным олигонуклеотидом (RU 2035189, А 61 К 39/116, опубл. 20.05.95).

Однако описанный способ предназначен только для выявления антител и обеспечения возможности выявлять высокоафинные антитела к водонерастворимым гаптенам.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности иммуноферментного анализа за счет одновременного выявления IgG антител к антигенам 12 видов условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека.

Для достижения указанного технического результата способ одновременного выявления IgG антител к антигенам условно-патогенных бактерий в сыворотке крови человека для определения состояния гуморального иммунитета заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратно-индикаторную смесь, инкубируют при температуре 18-22oС в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий и по величине разности их оптической плотности судят об активности иммунитета к каждому виду условно-патогенных бактерий, при этом при величине разности оптической плотности, большей или равной 0,3, результат считают положительным.

Кроме того, в качестве условно-патогенных бактерий берут: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella minnesota Re, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae.

Кроме того, в качестве твердого носителя берут 96-луночный разборный полистироловый планшет.

Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.

Пример. Проводят иммуноферментный анализ в сыворотке крови человека для одновременного выявления IgG антител к 12 антигенам условно-патогенных бактерий (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sp., Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella minnesota Re, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae). Выявление антител к антигенам условно-патогенных бактерий необходимо для определения гуморального иммунитета.

В предлагаемом способе применен принципиально новый подход, заключающийся в одновременном анализе антител сразу к 12 представителям условно-патогенных бактерий по величине разности оптической плотности между анализируемой сывороткой и отрицательным контролем в оптимальном для каждого представителя условно-патогенных бактерий рабочем разведении сывороток (от 1:1000 до 1:1600). В случае необходимости спектр антигенов может быть сужен или расширен.

Используемые реагенты:

(1) иммуносорбенты - планшеты полистирольные для иммуноферментного анализа однократного применения, разборные, по ТУ 64-2-50390. Каждые 2 стрипа в них сорбированы препаратами клеточных стенок (КС) одного из 12 представителей условно-патогенных бактерий.

(2) отрицательный контрольный образец (К -) - сухой, в ампуле содержит антитела к условно-патогенным бактериям ниже диагностического уровня. Получен смешением равных объемов 100 сывороток здоровых доноров - 1 амп., 0,1 мл.

(3) положительный контрольный образец (К+) - жидкий, пул не менее 12 сывороток крови, содержащий высокую активность антител к большинству условно-патогенных бактерий выше диагностического уровня - 1 фл., 0,1 мл.

(4) конъюгат (КГ) - антитела диагностические против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, сухие или жидкие по ТУ 42-14-276-82 - 1 фл. или 1 амп., 0,1-0,2 мл.

(5) хромоген (ОФД) - орто-фенилендиамин, таблетированный по ТУ 6-14-113-7095 - 1 фл., 2 табл.

(6) промывающий буферный раствор (ФСБ-Д)к - фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом, рН 7,0-7,4, 1 фл., 100 мл.

(7) субстратная смесь ЦФБ-П - цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 4,9-5,1 с перекисью водорода, 1 или 2 фл., 25 мл.

(8) стоп-реагент - 2М Н2SO4 (ГОСТ 4204-77).

Приготовление растворов для проведения анализа:

Раствор 1. Предназначен для приготовления рабочих разведений сывороток, конъюгата и отмывки планшетов. Его готовят разведением (ФСБ-Д)к в 10 раз дистиллированной водой (ГОСТ 6709-72) до объема 1,0 л. Хранят не более 3-х недель при температуре 4-8oС.

Раствор 2. К- растворяют в 0,1 мл дистиллированной воды при температуре 18-22oС. Раствор хранят не более 3-х недель при температуре 4-8oС.

Раствор 3. Сухой конъюгат растворяют в дистиллированной воде до объема, указанного на ампуле или флаконе. Условия растворения и хранения - как в растворе 2.

Раствор 4. Рабочий раствор конъюгата готовят разбавлением исходного жидкого конъюгата или раствора 3 раствором 1 до соотношения, указанного на этикетке. Раствор не хранят.

Раствор 5. Представляет собой субстратно-индикаторную смесь. Одну таблетку ОФД растворяют в 12,5 мл ЦФБ-П при периодическом перемешивании в темноте. После полного растворения таблетки раствор сразу же разливают по лункам.

Рабочие растворы сывороток. К-, К+, а также анализируемые сыворотки разводят раствором 1 до соотношения 1: 100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 во вспомогательных пробирках или на пластиковых панелях с лунками вместимостью 2,0 мл.

Последовательность операций

Вертикальные ряды каждого из 2-х планшетов помечены от 1 до 12. В стрипах под 1 сорбированы антигены Staphylococcus aureus, 2 - Staphylococcus epidermidis, 3 - Staphylococcus saprophyticus, 4 - Streptococcus pneumoniae, 5 - Streptococcus sp., 6 - Micrococcus luteus, 7 - Pseudomonas aeruginosa, 8 - Escherichia coli, 9 - Proteus vulgaris, 10 - Salmonella minnesota Re, 11 - Haemophilus influenzae, 12 - Kebsiella pneumoniae.

Отмывка иммуносорбента. В лунки планшета вносят раствор 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживают при комнатной температуре в течение 2-6 мин. Затем содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 2 раза.

Внесение рабочих растворов сывороток. Для контроля конъюгата в первую лунку каждого вертикального ряда вносят по 0,1 мл раствора 1. В одну лунку вносят рабочее разведение К+, рабочее разведение К- вносят в две следующие лунки в том же объеме 0,1 мл. Каждый образец анализируемой сыворотки вносят в необходимом разведении в соседние лунки планшета.

Рабочее разведение 1:100 используют при анализе антител к антигенам Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus sp., Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae; 1:200 - Staphylococcus epidermidis; 1:400 - Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Haemophilus influenzae; 1:800 - Salmonella minnesota Re; 1: 1600 - Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae.

Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин.

Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и отмывают путем внесения раствора 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживания при комнатной температуре в течение 2-6 мин.

Внесение рабочего разведения конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора 4.

Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин.

Отмывка от избытка конъюгата. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и отмывают путем внесения раствора 1 в объеме не менее 0,2 мл, выдерживания при комнатной температуре в течение 2-6 мин.

Внесение субстратно-индикаторной смеси. Во все лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора 5.

Инкубация. Планшет выдерживают при температуре 18-22oС в течение 15-20 мин в защищенном от света месте.

Остановка реакции. Реакцию останавливают внесением в лунки планшета по 0,05 мл "стоп-реагента".

Учет результатов:

Вывести спектрофотометр на нулевой уровень по воздуху.

Измерить оптическую плотность в лунках планшета.

Рассчитать среднюю арифметическую величину значений оптической плотности К-.

Оптическая плотность при контроле конъюгата не должна превышать значения 0,15. Среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с К- не должно превышать величину 0,5. Разность оптической плотности между К+ и К- в рабочих разведениях должна превышать или быть равной величине +0,3.

Положительными на содержание антител к различным условно-патогенным бактериям считаются исследуемые сыворотки, оптическая плотность которых превышает оптическую плотность К- на величину 0,3 и более. По величине разности оптической плотности судят об активности иммунитета к каждому виду условно-патогенных бактерий.

Результаты апробации

При анализе 326 сывороток доноров станций переливания крови г. Москвы и г. Тулы установлено, что число лиц с высокой активностью IgG антител к различным антигенам колеблется от 0% до 10,7% (таблица 1).

Анализ сывороток крови 130 лиц пожилого возраста (старше 65 лет), живущих в пансионате для ветеранов труда г. Москвы, позволил установить, что в этой группе людей с высокой активностью IgG антител ко многим антигенам условно-патогенных бактерий значительно больше (таблица 2).

Анализ сывороток крови работников Московского метрополитена, работающих в условиях повышенной загрязненности воздуха станций бактериальной микрофлорой, показал достоверное, по сравнению с донорами, увеличение в этой группе лиц с высоким уровнем IgG антител к Staphylococcus aureus и Escherichia coli.

При анализе сывороток крови 208 больных различными заболеваниями людей, в 90% случаев результаты иммуноферментного анализа совпали с данными бактериологических высевов (таблица 3).

В результате анализа 200 сывороток взрослых и детей больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких установлено, что в данной группе наиболее частыми являются положительные реакции с КС пневмококка и гемофильной палочки. А в сыворотках группы больных с различными заболеваниями ЖКТ - наиболее часто выявляется высокая активность IgG антител к антигенам Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli (таблица 4).

Анализ 26 сывороток людей с болезнью Бехтерева выявил, что более чем в 60% у лиц этой группы имеются высокие показатели активности IgG антител к Klebsiella pneumoniae, что сочетается с данными литературы о клебсиеллезной этиологии такого заболевания. Одновременно показано, что у таких больных имеется высокий уровень антител к другим видам условно-патогенных бактерий (таблица 5).

При анализе 39 сывороток больных пищевой токсоинфекцией преобладали образцы с высокой активностью IgG антител к Proteus vulgaris, Salmonella minnesota, Pseudomonas aeruginosa (таблица 6). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ оценки состояния гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям, отличающийся тем, что на твердый носитель с сорбированными на нем двенадцатью антигенами различных условно-патогенных бактерий наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100-1:1600, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным антигенам условно-патогенных бактерий, определяют разность между величиной оптической плотности исследуемого образца и отрицательного контроля и при разности, большей или равной 0,3, определяют повышение активности гуморального иммунитета к условно-патогенным бактериям.