СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ 
АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И СОСТОЯНИЯХ

СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И СОСТОЯНИЯХ


RU (11) 2213971 (13) C1

(51) 7 G01N33/53, G01N33/564 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002124822/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.09.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.09.19 
(45) Опубликовано: 2003.10.10 
(56) Аналоги изобретения: РЕЗАЙКИНА А.В. и др. Иммуноферментный метод выявления анти- ДНК антител при красной волчанке. Лабораторное дело, 1988, №1, с.40-42. НОВИКОВ Д.К. и др. Оценка иммунного статуса. - Москва - Витебск, 1996, с.225-227. RU 2045759 С1, 10.10.1995. SU 1074530 A 23.02.1984. 
(71) Имя заявителя: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 
(72) Имя изобретателя: Поддубиков А.В.; Ванеева Н.П.; Ястребова Н.Е.; Маркина О.А.; Цветкова Н.В. 
(73) Имя патентообладателя: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 
(98) Адрес для переписки: 105064, Москва, М. Казенный пер., 5а, НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, директору Б.Ф. Семенову 

(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И СОСТОЯНИЯХ 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния гуморального иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях. Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем органоспецифическими антигенами наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным органоспецифическим антигенам, при этом значение разности между величиной оптической плотности исследуемой и контрольной сывороток, большее или равное 0,2, свидетельствует об активности гуморального иммунитета в отношении конкретного органа. Техническим результатом является выявление активности гуморального аутоиммунитета в отношении конкретного органа, а также определение распространенности процесса в отношении системы органов. 4 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к иммунологии для оценки состояния гуморального органоспецифического иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях

Известен способ определения аутоантител к органонеспецифическим антигенам (Лабораторное дело, 1988, 1, с.40-43).

Однако описанный способ предназначен только для выявления антител к органонеспецифическим антигенам.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности иммуноферментного анализа за счет оценки состояния гуморального органоспецифического иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях.

Для достижения указанного технического результата способ оценки состояния гуморального органоспецифического иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях заключается в том, что на твердый носитель с сорбированными на нем органоспецифическими антигенами наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 36-37oС в течение 55-60 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратно-индикаторную смесь, инкубируют при температуре 18-22oС в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным органоспецифическим антигенам и по величине разности их оптической плотности судят об активности гуморального аутоиммунитета как в отношении конкретного органа, так и об распространенности процесса в отношении системы органов, при этом при величине разности оптической плотности, большей или равной 0,2, результат считают положительным.

Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.

Проводят иммуноферментный анализ (ИФА) в сыворотке крови человека для одновременного определения антител к 8 тканевым антигенам. В случае необходимости спектр антигенов может быть расширен.

В предлагаемом способе применен принципиально новый подход, заключающийся в одновременном анализе антител (AT) к органонеспецифическим антигенам? и по величине разности оптической плотности (ОП) судят об активности гуморального аутоиммунитета как в отношении конкретного органа, так и об распространенности процесса в отношении системы органов.

Для ИФА используют:

1) планшеты полистирольные однократного применения, разборные по ТУ 64-2-50390 (производство ВНИИ "Медполимер", Москва);

2) органоспецифические антигенные препараты (АГ), выделенные с помощью дезинтеграции и дифференциального центрифугирования в сахарозе из тканей гипофиза (1), щитовидной железы (2, 3), желудка (4, 5), поджелудочной железы (6), надпочечника (7) и ячника (8);

3) положительный контроль (К+) - сыворотка крови человека, содержащая IgG антитела к тканевым АГ выше диагностического уровня (ОП > 0,8);

4) отрицательный контроль (К-) - сыворотка крови человека, содержащая AT к тканевым АГ ниже диагностического уровня (ОП < 0,5);

5) конъюгат (КГ) - антитела диагностические против IgG человека;

6) хромоген - орто-фенилендиамин (ОФД) таблетированный по ТУ 6-14-113-7095;

7) фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,0-7,4 - десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д);

8) (7) цитратно-фосфатный буферный раствор рН 4,9-5,1 с перекисью водорода (ЦФБ-П);

9) стоп-реагент - 2М Н2SO4 (ГОСТ 4204-77).

Постановка реакции

1. Приготовление иммуносорбента

- Органоспецифические антигенные препараты растворяют в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,6) до концентрации (мкг/мл):

2,5 - гипофиз - микросомальная фракция (1), щитовидная железа - цитоплазматическая фракция (2), яичник - микросомальная фракция (8);

5,0 - щитовидная железа - микросомальная фракция (3);

7,5 - желудок - мышечный слой - микросомальная фракция (5);

10,0 - желудок - слизистый слой - микросомальная фракция (4);

15,0 - поджелудочная железа - микросомальная фракция (6), надпочечник - микросомальная фракция (7).

- 12 лунок каждого горизонтального ряда сорбируют растворами (100 мкл в лунку) антигенных препаратов последовательно: А - ( 1), В - ( 2), D - ( 4), Е-( 5), F- ( 6), G - ( 7), Н - ( 8).

- Пластину выдерживают 2 ч при 37oС, ночью при 4-10oС, затем содержимое лунок вытряхивают и хранят планшеты при 4-10oС.

В результате получают иммуносорбент, стрип каждого вертикального ряда (1-8) сорбирован 8 тканевыми антигенами.

2. Внесение анализируемых и контрольных препаратов

- В лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают при комнатной температуре 2-6 минут. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 2 раза;

- контрольные образцы и анализируемые сыворотки разводят ФСБ-Д до состояния 1:100 (рабочее разведение);

- во все лунки первого стрипа (ряд 1 лунки от А до Н) вносят рабочее разведение раствора отрицательного контроля по 100 мкл;

- во все лунки второго стрипа (ряд 2 лунки от А до Н) вносят раствор положительного контроля (1:100) по 100 мкл;

- каждый образец испытуемой сыворотки вносят в рабочем разведении в 8 лунок последующих стрипов планшета. Например, в ряд 3 (А - Н) - сыворотка первого пациента, в ряд 4 (А - Н) - сыворотка второго пациента и т.д. - по 100 мкл:

Всего на 1 планшете возможен анализ 10 сывороток без дублей.

- планшет выдерживают при 37oС в течение 60 мин.;

- затем содержимое вытряхивают и отмывают от избытка антител ФСБ-Д как в п.1.

3. Внесение КГ

- Готовят рабочее разведение КГ, разбавляя исходный раствор до соотношения, установленного ранее. Например, если рабочее разведение КГ 1:1000, то 10 мкл исходного раствора доводят ФСБ-Д до объема 10 мл;

- в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего разведения КГ;

- планшет выдерживают при 37oС 60 минут;

- жидкость из лунок удаляют и 3-кратно отмывают планшет от избытка КГ, как описано в п.1.

4. Внесение субстратной смеси

- Готовят субстратно-индикаторную смесь. Для этого 1 таблетку ОФД растворяют в 12,5 мл ЦФБ-П при периодическом перемешивании в темноте;

- после полного растворения таблетки раствор сразу же разливают по 100 мкл в каждую лунку планшета;

- планшет выдерживают при 18-22oС в течение 10-15 минут в защищенном от света месте.

5. Остановка реакции

Реакцию останавливают внесением в лунки по 0,05 мл "стоп-реагента".

6. Учет результатов

- Регистрацию проводят на вертикальном спектрофотометре типа "Multiskan" при длине волны 492 нм; выведение спектрофотометра на нулевой ("blank") уровень осуществляют по воздуху;

- в лунках с раствором К- допускается значение ОП в пределах 0,2-0,5;

- в лунках с раствором К+ значение ОП должно превышать ОП К- на >0,2 (ОП между К+ и К-);

- для каждой испытуемой сыворотки вычисляют ОП между значениями ОП этой сыворотки и К- (для анализа АT к каждому из 8 AГ отдельно);

- если полученная ОП>0,2, результат исследования считают положительным.

Чем выше значения ОП, тем активнее патологический процесс.

7. Пример результатов анализа сыворотки больной аутоиммунным тироидитом (ж. 36 лет) приведен в табл.1.

Таким образом, у больной выявлен высокий уровень AT к АГ щитовидной железы, что свидетельствует об аутоиммунном поражении щитовидной железы и подтверждает диагноз. Одновременно выявлен повышенный уровень AT к микросомальной фракции надпочечника, что свидетельствует о вовлечении в аутоиммунный процесс и этого гормонпродуцирующего органа (таблица 1).

Результаты апробации

При анализе сывороток 225 доноров станций переливания крови г. Москвы и г. Тулы установлено, что сыворотки доноров Тулы достоверно чаще, чем доноров Москвы (р<0,05) давали позитивные реакции с антигенами щитовидной железы (таблица 2).

При анализе сывороток крови 618 больных с различными заболеваниями органов эндокринной системы установлено, что наибольшая активность антител к антигенам щитовидной железы была у больных диффузным токсическим зобом и аутоиммунным тироидитом (до 40%). У больных сахарным диабетом 1 типа частота позитивных реакций с антигенными препаратами поджелудочной железы не превышала 17,9%. Полученные данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о выявлении антител к антигенам поджелудочной железы только в доклинической и ранней клинической стадиях заболевания. У больных хроническим гастритом в значительном проценте случаях выявляли антитела к антигенным препаратам желудка (24-30%) и щитовидной железы (18-20%), что сочетается с данными литературы. Достоверно чаще, чем у доноров, в сыворотках больных с первичной хронической надпочечниковой недостаточностью была выявлена высокая активность антител к антигенам микросомальной фракции надпочечников (58,3%) (таблица 3).

При исследовании сывороток больных системной красной волчанкой (СКВ) и ревматоидным артритом (РА) выявлены положительные реакции со всеми органонеспецифическими и органоспецифическими антигенами, но в различном проценте случаев, что на наш взгляд, свидетельствует о степени вовлеченности тех или иных органов в аутоиммунный процесс. При этом клинические проявления в той или другой группе были множественными и различными. Диагностическое значение имеет определение ДНК в группе больных СКВ и определение антител к коллагену и эластину у больных РА (таблица 4). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ оценки состояния гуморального органоспецифического иммунитета при аутоиммунных заболеваниях и состояниях путем выявления аутоантител к антигену ткани того или иного органа, отличающийся тем, что на твердый носитель с сорбированными на нем органоспецифическими антигенами наносят исследуемые и контрольную сыворотки в рабочем разведении 1:100, проводят иммуноферментный анализ, измеряют оптическую плотность исследуемых и контрольной сывороток на содержание антител к различным органоспецифическим антигенам, при этом значение разности между величиной оптической плотности исследуемой и контрольной сывороток, большее или равное 0,2, свидетельствует об активности гуморального органоспецифического иммунитета.