СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АУТОЭРИТРОЦИТОВ, НАГРУЖЕННЫХ ТИМАЛИНОМ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АУТОЭРИТРОЦИТОВ, НАГРУЖЕННЫХ ТИМАЛИНОМ


RU (11) 2177156 (13) C2

(51) 7 G01N33/53, A61K35/18 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2001.12.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 99125851/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.12.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.12.07 
(45) Опубликовано: 2001.12.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 1743026 С, 27.09.1995. RU 2052192 С1, 10.01.1996. SU 1778707 А1, 30.11.1992. SU 1629849 А1, 23.09.1991. 
(71) Имя заявителя: Государственное учреждение Институт травматологии и ортопедии НЦРВХ ВСНЦ СО РАМН 
(72) Имя изобретателя: Кирдей Е.Г.; Дмитриева Л.А.; Белохвостикова Т.С. 
(73) Имя патентообладателя: Государственное учреждение Институт травматологии и ортопедии НЦРВХ ВСНЦ СО РАМН 
(98) Адрес для переписки: 664003, г. Иркутск, ул. Борцов революции, 1, Институт травматологии и ортопедии, патентная группа, Р.Н.Харламовой 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ИММУНОКОРРЕКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АУТОЭРИТРОЦИТОВ, НАГРУЖЕННЫХ ТИМАЛИНОМ 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунотерапии с использованием аутологичных эритроцитов, нагруженных тималином. Сущность способа: надосадочную жидкость, полученную путем инкубации и центрифугирования эритромассы с тималином, используют для постановки реакции розеткообразования. Сорбционную активность эритроцитов вычисляют по разнице показателей пробы с тималином в исходной концентрации и пробы с надосадочной жидкостью и при выявлении разницы более 5% считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином. Способ позволяет повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к тималину. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для проведения иммунотерапии с использованием аутологичных эритроцитов, нагруженных тималином.

Известен способ определения сорбционной активности рецепторного аппарата эритроцитов человека. Сущность известного способа заключается в следующем: кровь больного берут в количестве 4 - 5 мл в пробирку, содержащую 0,1 мл 2,5 тыс. ЕД гепарина, эритроциты отмывают трехкратным центрифугированием 5 - 7 минут при 1500 об/мин в фосфатно-солевом буфере. Отмытые эритроциты разводят фосфатно-солевым буфером до получения 3 - 5% суспензии и 1,5 мл полученной суспензии инкубируют при комнатной температуре в течение 40 - 45 мин с 1,5 мл мышиной сыворотки. По окончании инкубации смесь центрифугируют и измеряют оптическую плотность надсадочной жидкости против контрольной пробы на спектрофотометре. Контрольная проба представляет собой 1,5 мл мышиной сыворотки взятого разведения, к которым добавляют 1,5 мл фосфатно-солевого буфера и обрабатывают так же, как опытную пробу. Полученное значение сравнивают со средним донорским контролем и разность отражает сорбционную активность рецепторного аппарата эритроцитов.

Однако, известный способ обладает существенными недостатками, а именно:

Известный способ определения сорбционной активности позволяет судить о функциональном состоянии рецепторного аппарата эритроцитов и прогнозе в отношении выздоровления, в то время как предлагаемый способ может быть применен для оценки сорбционной активности эритроцитов в отношении конкретного препарата и возможности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутологичных эритроцитов, несущих тималин, при различных заболеваниях, сопровождающихся Т-зависимой иммунологической недостаточностью.

Исходя из известного уровня технологий определения целесообразности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином, была поставлена задача: повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к тималину.

Поставленная задача решается следующим образом:

Определение целесообразности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином, включает выделение эритромассы, которую инкубируют с раствором тималина в равных объемах и после центрифугирования проводят реакцию розеткообразования с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации. При этом в первую контрольную пробу добавляют 0,05 мл среды 199, во вторую пробу 0,05 мл тималина в концентрации 1 мг/мл, в третью 0,05 мл надосадочной жидкости после эритросорбции, затем во все пробы вносят равные объемы взвеси лимфоцитов, инкубируют и добавляют 0,5% взвесь эритроцитов барана, повторно инкубируют, центрифугируют и помещают в холодильник на 18 ч при 4oC. После чего готовят мазки и подсчитывают процентное количество лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана.

Определяют биологическую активность тималина в пробе с его исходным количеством и в контрольной пробе без тималина. Вычисляют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей пробы с тималином в исходной концентрации и пробы с надосадочной жидкостью и при выявлении разницы более 5% считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов.

При инкубации эритромассы с раствором тималина эритроциты неспецифически сорбируют и концентрируют на своей поверхности тималин.

Полученную после инкубации и центрифугирования эритромассы с тималином надосадочную жидкость используют для постановки реакции розеткообразования и оценки сорбционной способности эритроцитов по степени падения биологической активности тималина после его инкубации с эритромассой.

Первую пробу с добавлением 0,05 мл среды 199 используют как контрольную для последующего сравнения.

Вторую пробу с добавлением 0,05 мл раствора тималина в исходной концентрации 1 мг/мл используют для оценки биологической активности тималина по сравнению с контрольной пробой.

Третью пробу с 0,05 мл надосадочной жидкости после эритросорбции используют для оценки сорбционной способности эритроцитов, которую определяют по степени падения биологической активности тималина в сравнении со второй пробой.

Внесение во все пробы равных объемов взвеси лимфоцитов и 0,5% взвеси эритроцитов барана с последующей инкубацией, центрифугированием и повторной инкубацией при 4oC в течение 18 ч необходимо для приготовления мазков и определения процентного количества лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана.

Биологическую активность тималина оценивают по проценту увеличения розеткообразующих клеток в пробе с тималином в исходной концентрации по сравнению с контрольной пробой.

Наличие и величину сорбционной активности эритроцитов вычисляют по разнице показателей пробы с тималином в исходной концентрации и пробы с надосадочной жидкостью.

5 %-ная разница исключает ошибку при подсчете розеткообразующих клеток и предполагает получение достоверных результатов при определении целесообразности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов периферической крови пациента.

Проведенные патентные исследования по подклассу G 01 N 33/53, A 61 K 37/02 и анализ научно-медицинской информации, отражающей существующий уровень способов определения сорбционной способности эритроцитов, не выявили технологий, идентичных предложенной. Таким образом, предлагаемый способ определения способности эритроцитов человека сорбировать тималин является новым.

Взаимосвязь и взаимодействие существенных приемов предлагаемого способа определения способности эритроцитов сорбировать тималин обеспечивает достижение нового медицинского результата в решении поставленной задачи, а именно: повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к тималину.

Предлагаемый способ может быть широко применен в практическом здравоохранении, так как может быть воспроизведен неоднократно и не требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов.

Сущность предлагаемого способа определения способности эритроцитов человека сорбировать тималин заключается в следующем:

Получают кровь больного на гепарине. Выделяют мононуклеарные клетки для постановки реакции розеткообразования с эритроцитами барана с помощью общепринятого метода. Параллельно выделяют эритроциты, трижды отмывают в физиологическом растворе и в виде 80% взвеси (эритромассы) инкубируют с равным объемом тималина в различных концентрациях (1 - 0,1 мг/мл). Инкубацию проводят при 37oC в течение 60 мин. После инкубации взвесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют в дальнейших исследованиях. Реакцию розеткообразования проводят в планшете для иммунологических исследований. В первой пробе используют 0,05 мл среды 199, во второй - 0,05 мл тималина в исходной концентрации, в третьей 0,05 мл надосадочной жидкости эритроцитов после эритросорбции. Во все пробы вносят равные объемы взвеси лимфоцитов (0,05 - 2х10 /мл). Пробы инкубируют при 37oC в течение 30 мин, а затем добавляют 0,05 мл 0,5% взвесь эритроцитов барана, предварительно трижды отмытых физиологическим раствором. Повторно инкубируют 5 мин при 37oC, центрифугируют и помещают в холодильник на 18 ч при 4oC. После этого готовят мазки с предварительной фиксацией глютаровым альдегидом. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза или метиленовым зеленым, определяют процентное количество лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана (не менее трех эритроцитов на один лимфоцит). Определяют биологическую активность тималина в пробе с его исходным количеством и в контрольной пробе без тималина. Вычисляют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей пробы с тималином в исходной концентрации и пробы с надосадочной жидкостью и при выявлении разницы более 5% считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином.

Сущность предлагаемого способа поясняется клиническими примерами:

Пример N 1. Больная Б., 29 лет.

Диагноз: открытый оскольчатый внутрисуставной перелом средней трети и нижней трети большеберцовой кости, хронический остеомиелит, ИДС гипосупрессорного типа выраженного характера (Е-РОК - 69%, Е-РОК т.р. - 64%, Е-РОК т.ч. - 5%).

Сорбционную активность эритроцитов (САЭ) оценивают по способности тималина увеличивать число Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) перед и после инкубации его с эритроцитами. Инкубацию осуществляют при 37oC в течение 1 ч после смешивания равных объемов эритромассы и раствора тималина в концентрации 1 мг/мл. САЭ вычисляют в процентах падения биологической активности тималина после его инкубации с эритроцитами.

В контрольной пробе без тималина процент Е-РОК составил 49%. В первой опытной пробе с добавлением тиамалина в исходной концентрации число Е-РОК - 65%. Во второй опытной пробе с добавлением надосадочной жидкости после инкубации эритроцитов с тималином число Е-РОК составило 56%. Биологическая активность тималина составила 16%. Величина САЭ - 9% (65 - 56 = 9%).

При определении способности эритроцитов больного сорбировать тималин показатель числа Е-РОК в пробе с тималином в исходной концентрации превышает показатель числа Е-РОК в пробе с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации его с эритроцитами. Считаем целесообразным проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином. После проведения курса (5 процедур) экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином, получили устранение гипосупрессии и нормализацию показателей, характеризующих T-клеточное звено иммунитета (Е-РОК - 71%, Е-РОК т.р. - 59%, Е-РОК т.ч. - 13%).

Пример N 2. Больная И., 22 года.

Диагноз: спицевой остеомиелит большеберцовой кости нижней трети правой голени, сросшийся перелом обеих костей нижней трети правой голени, T-клеточный ИДС гипосупрессорного типа. Сорбционную активность эритроцитов оценивают по способности тималина увеличивать число Е-РОК перед и после инкубации его с эритроцитами. Инкубацию осуществляют при 37oC в течение 1 ч после смешивания равных объемов эритромассы и раствора тималина в концентрации 1 мг/мл. САЭ вычисляют в процентах падения биологической активности тималина после инкубации его с эритроцитами.

В контрольной пробе (без тималина) процент Е-РОК составил 42%. В первой опытной пробе с добавлением тималина в исходной концентрации число Е-РОК 63%. Во второй опытной пробе с добавлением надосадочной жидкости после инкубации эритромассы с тималином число Е-РОК составило 21%. Величина САЭ - 3% (63 - 60 = 3%).

При определении способности эритроцитов больной сорбировать тималин показатель числа Е-РОК в пробе с тималином в исходной концентрации менее чем на 5% превышает показатель числа Е-РОК в пробе с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации его с эритроцитами.

Проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином, нецелесообразно ввиду низкой САЭ больной. Больной проведена фармакологическая иммунокоррекция с тималином путем внутримышечного введения препарата.

Таким образом, предлагаемый "Способ определения целесообразности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином" позволяет по сравнению с известными технологиями повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к тималину.

Источник информации

1. А.С. СССР N 1778707, 1992, БИ 44, G 01 N 33/531. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ определения целесообразности проведения экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином, включающий выделение эритромассы, которую инкубируют с раствором тималина в равных объемах, и после центрифугирования проведение реакции розеткообразования с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации, при этом в первую контрольную пробу добавляют 0,05 мл среды 199, во вторую пробу - 0,05 мл тималина в концентрации 1 мг/мл, в третью - 0,05 мл надосадочной жидкости после эритросорбции, затем во все пробы вносят равные объемы взвеси лимфоцитов, инкубируют и добавляют 0,5%-ную взвесь эритроцитов барана, повторно инкубируют, центрифугируют и помещают в холодильник на 18 ч при 4oС, после чего готовят мазки, подсчитывают процентное количество лимфоцитов, образующих розетки с эритроцитами барана, и определяют биологическую активность тималина в пробе с его исходным количеством и в контрольной пробе без тималина и вычисляют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей пробы с тималином в исходной концентрации и пробы с надосадочной жидкостью, и при выявлении разницы более 5% считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунокоррекции с использованием аутоэритроцитов, нагруженных тималином.