СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ

СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ


RU (11) 2302635 (13) C1

(51) МПК
G01N 33/53 (2006.01)
G01N 33/50 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 09.07.2007 - нет данных 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005141145/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.12.28 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.12.28 
(45) Опубликовано: 2007.07.10 
(56) Аналоги изобретения: Р.П.Нарциссов "Применение пара-нитротетразолия фиолетового для количественного цитохимического определения дегидрогеназ лимфоцитов человека", Архив анатомии, гистологии, эмбриологии, 1969, №5. RU 2127882 C1, 20.03.1999. RU 2222812 C1, 27.01.2004. WO 03100088 А2, 04.12.2003. US 5180662 A, 19.01.1993. US 6455243 В1, 24.09.2002. 
(72) Имя изобретателя: Петричук Светлана Валентиновна (RU); Измайлова Татьяна Дмитриевна (RU); Радыгина Татьяна Вячеславовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное учреждение Научный центр здоровья детей РАМН (ГУ НЦЗД РАМН) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 119991, Москва, ГСП-1, Ломоносовский пр-т, 2/62, ГУ НЦЗД РАМН 

(54) СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ
Изобретение относится к области медицины, в частности к способу измерения митохондриальной активности дифференцированных популяций лимфоцитов путем измерения активности сукцинатдегидрогеназы с использованием проточной лазерной цитометрии, что позволяет выявить популяции лимфоцитов с нарушением метаболизма. Способ обеспечивает расширение диагностических возможностей в иммунологической и аллергологической диагностике. 1 ил.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, а конкретно к способу иммунологической диагностики.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано как в фундаментальных, так и прикладных сферах медицины и ветеринарии, а именно иммунологии и цитохимии.

Известен способ иммунологической диагностики: иммунофенотипирование лимфоцитов с применением проточной лазерной цитометрии [Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. // Пособие для врачей-лаборантов под ред. Р.М.Хаитова. М.: ГНЦ РФ Институт иммунологии Минздрава РФ, 2001, 53 с.]. Способ имеет высокую диагностическую значимость, позволяет определять количество клеток в различных популяциях лимфоцитов. Недостатком данного способа является то, что он не дает представления о функциональном состоянии клеток в этих популяциях. В клинической практике встречаются ситуации, при которых результаты иммунологической диагностики, не соответствующие нормативным показателям, еще не свидетельствуют о наличии патологии и, наоборот, нормальные значения субпопуляций лимфоцитов могут наблюдаться у пациентов с отклонениями в функционировании иммунной системы.

Известен способ оценки функционального состояния лимфоцитов путем проведения реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) [Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М.: Медицинская книга, 2003, 443 с.]. Сущность способа состоит в выявлении митотической активации лимфоцитов под влиянием стимулов (митогенов и антигенов). В зависимости от качества используемого митогена можно исследовать как митотическую активность всего лимфоцитарного пула, так и отдельных популяций лимфоцитов. Недостатком этого способа является различие результатов, получаемых при использовании различных модификаций, что затрудняет четкую их трактовку в клинике. Таким образом, отсутствие стандартизированной технологии и необходимость стерильной работы ограничивают широкое распространение этого метода диагностики.

Известен способ оценки функционального состояния лимфоцитов путем определения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности лимфоцитов [Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М.: Медицинская книга, 2003, 443 с.]. Принцип способа заключается в том, что суспензию очищенных лимфоцитов инкубируют с клетками-мишенями, после чего определяют цитотоксический эффект лимфоцитов по количеству оставшихся живыми клеток-мишеней по выбросу лизированными клетками-мишенями радиоактивного изотопа 51Cr в культуральную среду. Недостатком данного способа является то, что он требует сложной аппаратуры и условий работы с изотопами, поэтому применяются преимущественно в специализированных лабораториях.

Перечисленные способы определения функционального состояния лимфоцитов не дают представления об их метаболических особенностях, что исключает возможность направленной метаболической коррекции иммунных нарушений. Известно, что функциональная активность клеток напрямую определяется их энергетическим метаболизмом.

Известен способ оценки энергетического метаболизма лимфоцитов периферической крови, основанный на определении активности основного митохондриального фермента - сукцинатдегидроненазы (Нарциссов Р.П. Применение пара-нитротетеразолия фиолетового для количественного цитохимического определения дегидрогеназ лимфоцитов человека. // Архив анатомии, гистологии, эмбриологии. - 1969. - №5. - С.85-91).

Этот способ выбран в качестве прототипа заявляемого изобретения. В основу этого способа положен принцип подсчета гранул - продукта ферментной реакции. В качестве индикатора ферментного процесса принят п-нитротеразолий фиолетовый, образующий при восстановлении в лимфоцитах крупные сферические гранулы формазана.

Реакции проводили на мазках крови, приготовленных на обезжиренных предметных стеклах. Мазки высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Постановка реакции включает в себя три этапа: фиксацию мазков, реакцию для выявления активности сукцинатдегидрогеназы, докраску ядер.

Фиксация препаратов проводилась в 60% растворе ацетона, насыщенном динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при рН 5.3 при комнатной температуре в течение 30 секунд. Для фиксации ацетонтрилоном используется надосадочная жидкость. Фиксатор хранится и используется при комнатной температуре. После фиксации препараты промывались дистиллированной водой и высушивались при комнатной температуре на воздухе.

Среда для выявления активности сукцинатдегидрогеназы состояла из инкубационной среды и субстрата - янтарнокислого натрия, специфичного для выявляемого данного фермента. Среда готовится на фосфатном буфере и хранится в холодильнике в стеклянной посуде не более 2-х недель. Приготовление инкубационной среды: на 40 мл фосфатного буфера 13 мг п-нитротетразолия фиолетового, 13 мг трилона Б и 540 мг янтарнокислого натрия. Приготовление фосфатного буфера: 100 мл фосфатного буфера составляются из 20 мл КН2PO4 (9.1 грамм на 1 литр воды) и 80 мл Na2HPO 4 (11.9 грамм на 1 литр воды), рН 7.2-7.4. Реакция проводится при рН 7.3 и температуре 37°С в течение 60 минут в водном термостате. После инкубации мазки промывались водой и погружаются в насыщенный раствор метилового зеленого (ядерного красителя) на 15-20 секунд, после чего мазки вновь промывались и высушивались при комнатной температуре на воздухе.

Готовые мазки микроскопировались под водной иммерсией (увеличение 400 раз) на микроскопе Биолам Р-16. Об активности фермента в клетке судили по количеству темно-фиолетовых гранул формазана, образовавшихся в процессе ферментативного восстановления п-нитротетразолия фиолетового. Для определения активности фермента в популяции лимфоцитов подсчитывали количество гранул в 50 клетках, а затем рассчитывали среднее число гранул в лимфоците (чертеж).

Недостатком данного способа является отсутствие возможности оценки функционального состояния митохондриального аппарата в отдельных популяциях лимфоцитов. Подобные недостатки ограничивают диагностические возможности данного способа в иммунологической и аллергологической диагностике, так как не позволяют выявить популяции лимфоцитов с нарушенным метаболизмом.

Задачей данного исследования являлось создание способа измерения митохондриальной активности в отдельных популяциях лимфоцитов.

Поставленная задача решается путем измерения показателей активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах с помощью инкубации пермеабилизированных клеток в инкубационной среде, состоящей из специфичного для данного фермента субстрата - янтарно-кислого натрия, фосфатного буфера, п-нитротетразолия фиолетового и трилона Б и анализа результата цитохимической реакции с помощью инструментального метода, для анализа используют лимфоконцентрат венозной крови, обработанный моноклональными антителами с флуоресцентной меткой, причем в качестве инструментального метода используют проточную лазерную цитометрию, при этом показатель митохондриальной активности в выделенных популяциях определяют по формуле:

МА=КБС1/КБС2·100%, где

МА - митохондриальная активность,

КБС1 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток до проведения цитохимической реакции,

КБС2 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток после проведения цитохимической реакции, при этом для популяции CD3+ (Т клетки) снижение МА ниже 152,7% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т клеток, повышение МА выше 175,9% свидетельствует о митохондриальной активации Т клеток при норме МА= от 152,7 до 175,9%, для популяции CD3+/CD4+ (Т-хелперы) снижение МА ниже 155,6% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т-хелперов, повышение МА выше 187,6% свидетельствует о митохондриальной активации Т-хелперов при норме МА= от 155,6 до 187,6%, для популяции CD3+/CD8+ (Т-цитотоксические) снижение МА ниже 135,1% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т-цитотоксических лимфоцитов, повышение МА выше 158,1% свидетельствует о митохондриальной активации Т-цитотоксических лимфоцитов при норме МА= от 135,1 до 158,1%, для популяции CD3+/CD19+ (В клетки) снижение МА ниже 133,6% свидетельствует о митохондриальной недостаточности В клеток, повышение МА выше 157,4% свидетельствует о митохондриальной активации В клеток при норме МА= от 133,6 до 157,4%, для популяции CD3-CD16+ CD56+ (NK-клетки) снижение МА ниже 98,3% свидетельствует о митохондриальной недостаточности NK клеток, повышение МА выше 158,3% свидетельствует о митохондриальной активации NK клеток при норме МА= от 98,3 до 158,3%.

Существенным отличием заявляемого решения от известного прототипа является то, что для анализа используют лимфоконцентрат венозной крови, обработанный моноклональными антителами с флуоресцентной меткой, причем в качестве инструментального метода используют проточную лазерную цитометрию, при этом показатель митохондриальной активности в выделенных популяциях определяют по формуле:

МА=КБС1/КБС2·100%, где

МА - митохондриальная активность,

КБС1 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток до проведения цитохимической реакции,

КБС2 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток после проведения цитохимической реакции.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Маркируют пробирки для каждого пациента в расчете на две пробы.

Пробирки первой пробы "стандарт"(А, В, С, D, Е) предназначены для стандартных иммунологических реакций. Пробирки второй пробы "цитохимия" (В+, С+, D+, Е+) предназначены для иммуноцитохимических реакций.

А - CD45/CD14 (для идентификации популяции лейкоцитов и выделения лимфоцитарного окна по малоугловому и боковому светорассеянию)

В - CD3/CD19 (для определения количества Т- и В-лимфоцитов соответственно)

С - CD3/CD4 (для определения количества Т-хелперов - CD3+CD4+)

D - CD3/CD8 (для определения количества цитотоксических Т-лимфоцитов -CD3+CD8+)

Е - CD3/CD16, CD56 (для определения содержания натуральных киллеров

NK -CD3-CD16+ CD56+)

В+ - CD3/CD19 (для определения активности СДГ в Т- и В-лимфоцитах соответственно)

С+ - CD3/CD4 (для определения активности СДГ в Т-хелперах CD3+CD4+)

D+ - CD3/CD8 (для определения активности СДГ в цитотоксических Т-лимфоцитах - CD3+CD8+)

Е+ - CD3/CD16, CD56 (для определения активности СДГ в натуральных киллерах NK - CD3-CD16+ CD56+).

В каждую пробирку внести чистым наконечником по 4 мкл антител, соответствующих маркировке пробирки.

2. Выделение мононуклеарной суспензии.

3 мл венозной крови пациента забирают в стерильную пробирку с ЭДТА (BD Vacutainer №368860).

Проба крови разбавляется в соотношении 1:3 средой RPMI-1640 (ПО ПанЭко), предварительно подогретой до 37°С. Разбавленная кровь наслаивается на градиент фиколл-Гипак плотностью 1,077 (Histopaque-1077 Sigma diagnostics №1077-1) в соотношении 4:1 в силиконизированную пробирку с коническим дном. Проба центрифугируется 20 минут при 1850 об/мин.

После центрифугирования с помощью пипетки собирается интерфазное кольцо, содержащее мононуклеары. После этого клетки отмываются реагентом для разведения клеток Cell Wash (BD Cell Wash №349524) (5 минут при 1500 об/мин). Надосадочную жидкость отбирают, к осадку добавляют реагент Cell Wash до общего объема 450 мкл.

3. Полученную клеточную суспензию добавляют в маркированные пробирки по 50 мкл в каждую.

Пробирки выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.

4. Клеточную суспензию пробы "стандарт" (пробирки A, B, C, D, E) отмывают реагентом Cell Wash (5 минут при 1500 об/мин). После отмывки в каждую пробирку к клеточной суспензии добавляется 200 мкл фиксирующего раствора CellFIX (BD CellFIX №340181), пробы готовы к анализу на проточном цитофлуориметре.

5. Клетки пробы "цитохимия" (пробирки В+, С+, D+, Е+) пермеабилизируют в течение 20 минут при комнатной температуре реагентом Cytofix/Cytoperm (BD Cytofix/Cytoperm №554722), после чего клетки отмывают реагентом Cell Wash (5 минут при 1500 об/мин). Затем клетки выдерживают в реагенте Perm/Wash (BD Pharmingen Perm/wash Buffer №554723) в течение 15 минут и отмывают реагентом Cell Wash (5 минут при 1500 об/мин).

На следующем этапе к клеткам пробы "цитохимия" (пробирки В+, С+, D+, Е+) добавляется по 1 мл инкубационной среды для определения активности СДГ, клетки инкубируются в течение 30 минут в водном термостате при температуре 37°С. После этого клетки от отмывают реагентом Cell Wash (5 минут при 1500 об/мин). После отмывки в каждую пробирку к клеточной суспензии добавляется по 200 мкл реагента Cell Wash, пробы готовы к анализу на проточном цитофлуориметре.

Показатели, полученные при цитофлуометрии, заносят в таблицу.

Ниже приводятся клинические примеры.

Пример 1.

Пациент П. 7 лет. (Обследование во время диспансеризации)

Д-з: здоров.

Проба "стандарт" тип клеток процент клеток КБС сред. 
В CD19+ (В-лимфоциты) 9 144,51 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 154,73 
С CD3+CD4+ (Т-хелперы) 31 144,2 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 157,49 
D CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 27 156,72 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 147,67 
Е CD3-CD16+ CD56+ (NK-клетки) 26 159,34 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 147,82 
Проба "цитохимия" тип клеток процент клеток КБС сред. 
В+ CD19+ (В-лимфоциты) 9 198,99 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 290,09 
С+ CD3+CD4+ (Т-хелперы) 31 252,45 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 327,01 
D+ CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 27 266,03 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 294,91 
Е+ CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) 26 249,83 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 285,21 


На основании данных протокола составляется результирующая таблица и вычисляются значения прироста для каждой популяции, для популяции CD3+ (Т-лимфоциты) данные усредняются по 4-м пробам.

Показатель % клеток Среднее значение коэффициента бокового светорассеяния Процент прироста (%)=МА 
"стандарт" "цитохимия" 
CD3+ (Т-лимфоциты) 63 151,93 299,31 197,00 
CD19+ (В-лимфоциты) 9 144,51 198,99 137,99 
CD3+CD4+ (Т-хелперы) 31 144,2 252,45 175,07 
CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 27 156,72 266,03 169,75 
CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) 26 159,34 249,83 156,79 


Заключение:

Митохондриальная активация Т клеток за счет умеренной митохондриальной активации популяции Т-цитотоксических лимфоцитов. У ребенка отмечаются умеренные метаболические нарушения, требующие коррекции коротким курсом метаболитной терапии.

Пример 2. Пациент Д. 11 лет

Клинический диагноз: Атопический дерматит, распространенная форма, тяжелое течение. Эритродермия. Стафилодермия. Бронхиальная астма, атопическая форма, средне-тяжелое течение. Пищевая аллергия. Круглогодичный аллергический ринит. Хронический гастродуоденит.

Проба "стандарт" тип клеток процент клеток КБС сред. 
В CD19+ (В-лимфоциты) 14 146,81 
CD3+ (Т-лимфоциты) 76 155,1 
С CD3+CD4+ (Т-хелперы) 53 153,55 
CD3+ (Т-лимфоциты) 76 156,52 
D CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 19 155,49 
CD3+ (Т-лимфоциты) 75 151,04 
Е CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) 2 175,74 
CD3+ (Т-лимфоциты) 80 180,29 
Проба "цитохимия" тип клеток процент клеток КБС сред. 
В+ CD19+ (В-лимфоциты) 14 213,49 
CD3+ (Т-лимфоциты) 78 274,83 
С+ CD3+CD4+ (Т-хелперы) 53 266,53 
CD3+ (Т-лимфоциты) 78 276,14 
D+ CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 19 348 
CD3+ (Т-лимфоциты) 75 297,21 
Е+ CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) 2 404,11 
CD3+ (Т-лимфоциты) 80 279,33 


Показатель % клеток Среднее значение коэффициента бокового светорассеяния Процент прироста (%) 
"стандарт" "цитохимия" 
CD3+ (Т-лимфоциты) 77 155,74 281,83 180,96 
CD19+ 14 146,81 213,49 145,42 
(В-лимфоциты) 
CD3+CD4+ (Т-хелперы) 53 153,55 266,53 173,58 
CD3+CD8+ (Т-цитотоксические) 19 155,49 348 223,81 
CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) 2 175,74 404,11 229,95 


Заключение:

Выраженная митохондриальная активация Т-цитотоксических лимфоцитов и NK клеток при резком снижении количества этих клеток, что свидетельствует о значительной функциональной активации клеток в этих популяциях на фоне снижения их количества. У ребенка отмечаются значительные иммунометаболические нарушения, требующие коррекции как препаратами метаболического действия, так и иммуномодуляторами.

Таким образом, изобретение позволило измерить митохондриальную активность в отдельных популяциях лимфоцитов. Использование лимфоконцентрата, а не лимфоцитов, фиксированных на стекле, позволило уменьшить количество субстрата ферментной реакции в 20 раз, время инкубации клеток в 2 раза по сравнению с прототипом. Для оценки результата цитохимической реакции используется наиболее современный метод цитологического исследования - лазерная проточная цитометрия, что позволило оценивать результат цитохимической реакции в большем количестве клеток (в прототипе анализируется 50 клеток, в настоящем решении до 5000 клеток, что повышает достоверность исследования. Кроме того, появляется возможность дифференцированной оценки результата цитохимической реакции в отдельных клеточных популяциях, что достигается наличием возможности иммунофенотипирования исследуемых клеток.

Подобное изменение технических параметров позволяет одновременно проводить иммунологические и цитохимические реакции в образце венозной крови, что приводит к более детальной оценке как иммунологических, так и метаболических изменений в организме и повышает диагностическую значимость анализа.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ измерения митохондриальной активности лимфоцитов, включающий в себя измерение показателей активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах с помощью инкубации пермеабилизированных клеток в инкубационной среде, состоящей из специфичного для данного фермента субстрата - янтарно-кислого натрия, фосфатного буфера, n-нитротетразолия фиолетового и трилона Б, отличающийся тем, что для анализа используют лимфоконцентрат венозной крови, обработанный моноклональными антителами, с флуоресцентной меткой для выявления различных популяций лимфоцитов, причем в качестве инструментального метода используют проточную лазерную цитометрию, при этом показатель митохондриальной активности в выделенных популяциях определяют по формуле

МА=КБС1/КБС2·100%,

где МА - митохондриальная активность,

КБС1 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток до проведения цитохимической реакции,

КБС2 - средний коэффициент интенсивности бокового светорассеяния в популяции клеток после проведения цитохимической реакции,

при этом для популяции CD3+ (Т-клетки) снижение МА ниже 152,7% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т-клеток, повышение МА выше 175,9% свидетельствует о митохондриальной активации Т-клеток, при норме МА=от 152,7 до 175,9%, для популяции CD3+/CD4+ (Т-хелперы) снижение МА ниже 155,6% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т-хелперов, повышение МА выше 187,6% свидетельствует о митохондриальной активации Т-хелперов, при норме МА=от 155,6 до 187,6%, для популяции CD3+/CD8+ (Т-цитотоксические) снижение МА ниже 135,1% свидетельствует о митохондриальной недостаточности Т-цитотоксических лимфоцитов, повышение МА выше 158,1% свидетельствует о митохондриальной активации Т-цитотоксических лимфоцитов, при норме МА=от 135,1 до 158,1%, для популяции CD19+ (В-клетки) снижение МА ниже 133,6% свидетельствует о митохондриальной недостаточности В-клеток, повышение МА выше 157,4% свидетельствует о митохондриальной активации В-клеток, при норме МА=от 133,6 до 157,4%, для популяции CD3-CD16+CD56+ (NK-клетки) снижение МА ниже 98,3% свидетельствует о митохондриальной недостаточности NK-клеток, повышение МА выше 158,3% свидетельствует о митохондриальной активации NK-клеток, при норме МА=от 98,3 до 158,3%.