СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОЙ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОЙ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ


RU (11) 2249464 (13) C1

(51) 7 A61K39/395, C07K16/12, G01N33/531 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.04.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003123187/13 
(22) Дата подачи заявки: 2003.07.22 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.07.22 
(45) Опубликовано: 2005.04.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2010577 C1, 15.04.1994. RU 2157538 C1, 10.10.2000. RU 2116344 С1, 27.07.1998. RU 2065308 C1, 20.08.1996. RU 2116348 C1, 27.07.1998. 
(72) Имя изобретателя: Алексеев В.В. (RU); Пивень Н.Н. (RU); Кулаков М.Я. (RU); Пушкарь В.Г. (RU); Плеханова Н.Г. (RU); Вобленко Р.А. (RU); Каплиев В.И. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (RU) 
(98) Адрес для переписки: 400131, г.Волгоград, ул. Голубинская, 7, ВолгНИПЧИ 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЛИОИДОЗНОЙ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ
Изобретение относится к микробиологии и иммунологии и может найти применение в иммунодиагностике. Для осуществления способа в качестве антигена для иммунизации животных используют атипичный штамм мелиоидоза Burkholderia pseudomallei-111-6-1 с измененным фенотипом, дефектным по синтезу 8 антигена, вызывающий иммунодепрессивное действие. Иммунную сыворотку получают после 2 циклов иммунизации животных-продуцентов с титром в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) не менее 1:128. Способ позволяет увеличивать специфическую активность получаемой иммунной сыворотки. 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и может найти применение в иммунодиагностике для обнаружения возбудителя мелиоидоза для целей профилактики, диагностики и лечения этого заболевания.

Мелиоидоз, особо опасное инфекционное заболевание, широко распространенное в эндемичных районах. Зарегистрирован как в ряде географически отдаленных странах, так и в Европе. Возбудитель мелиоидоза Burkholderia pseudomallei вызывает инфекционное заболевание как у людей, так и у животных. Летальная доза может составлять несколько десятков клеток. Решающую роль в диагностике мелиоидоза продолжают играть серологические (основанные на использовании сыворотки) методы исследований, такие как иммуноферментный (ИФА), метод флюоресцирующих антител (МФА), радиоизотопный анализ (РИА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция иммунодиффузии в геле (РИД) и др. Все эти методы требуют наличия высококачественных активных (гипериммунных) сывороток для получения из них специфических мелиоидозных иммуноглобулинов. Поэтому проблема получения активных гипериммунных сывороток к этому возбудителю для целей диагностики, профилактики и лечения мелиоидоза остается актуальной.

Известен способ получения мелиоидозных агглютинирующих сывороток (см. Регламент производства иммуноглобулинов диагностических мелиоидозных адсорбированных видоспецифических люминесцирующих сухих N 313-83, авторы Кулаков М.Я., Рыбкин B.C., Локтионов А.М. и др. ВолгНИПЧИ. Утвержден Начальником Главного Управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Министерства здравоохраненя СССР 11.01.1984 г.).

Активность и специфичность полученных сывороток зависит от штамма и его антигенного состава, который используется при иммунизации животных-продуцентов в процессе получения иммунной сыворотки. Согласно указанному регламенту используют штамм Burkholderia pseudomallei-59361.

Штамм 59361 выделен из гноя тестикул свиньи во Вьетнаме. Получен из ГИСК им. Л.А.Тарасовича. Типичен для возбудителя мелиоидоза по всем основным свойствам. Микроскопически - это нежная палочка с закругленными концами размером 2-6 мкм в длину и 0,5-1 мкм толщиной, полиморфная, грамотрицательная. Капсулы не имеет, спор не образует, подвижна. Температурный оптимум роста 37°С. Наиболее благоприятной реакцией среды является рН 6,8-7,0. Недостатком этого штамма является недостаточно высокая активность получаемой сыворотки.

Известно также использование для этих целей штаммов мелиоидоза - 57576, 56830, 60263, 100, а также штамма VPA ( AC 712999, Штамм Pseudomonas pseudomallei VPA для получения диагностической мелиоидозной агглютинирующей сыворотки. Авторы: Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Сычева Н.М. Волгоградский НИПЧИ - прототип). Недостатком перечисленных штаммов является невысокая иммунная активность получаемых сывороток.

Известен также штамм мелиоидоза 100-16-1 с измененным фенотипом для моделирования легочного мелиоидоза (Патент RU 2157538 С1). Использование его для иммунизации животных с целью производства гипериммунных мелиоидозных сывороток ранее не описано.

Цель изобретения - повышение специфической активности получаемой мелиоидозной иммунной сыворотки.

Цель достигается использованием атипичного штамма мелиоидоза Burkholderia pseudomallei-111-6-1 с измененным фенотипом, утратившим способность синтезировать биологический комплекс, условно обозначенный как антиген 8 (Аг8), с которым связывают антифагоцитарную активность микроба, который также снижает протективную защиту макроорганизма, обладая выраженным иммунодепрессивным действием.

Штамм получен нами методом селекции на питательных средах с антисывороткой к Аг8 и находится в рабочей коллекции культур патогенных микроорганизмов лаборатории иммунохимии; зарегистрирован в коллекционном центре Волгоградского НИПЧИ под N 3 журнала учета ПБА, форма N518/V. 

Пример 1. Иммунизацию животных прводили по методике 1 цикла согласно Регламента производства N 313-83.

Иммунизация включала 4 инъекции животным-продуцентам с интервалом в 7 дней возрастающими дозами антигена (1,2·109; 2,5·10 9; 5·109; 1·1010 м.т.). Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Активность сыворотки после иммунизации животных (1 цикл) в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) 
Опыт № 1 2 3 4 5 Среднее 
Активность 
Штамм 59361 4 4 4 4 8 4,8 
Штамм 100 4 8 4 4 4 4,8 
Штамм 111 8 4 16 16 16 12,0 
Штамм 100-16-1 4 8 4 4 8 5,6 
Штамм 111-6-1 32 64 64 64 32 51,5 


Пример 2. После месячного перерыва иммунизацию тех же животных проводили по методике 2 цикла согласно Регламенту производства N 313-83.

Иммунизация включала 4 инъекции животным-продуцентам с интервалом в 7 дней убывающими дозами антигена (1·10 10; 5·109; 2,5·109; 1,2·10 9 м.т.). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Активность сыворотки после иммунизации животных (2 цикл) в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) 
Опыт № 1 2 3 4 5 Среднее 
Активность 
Штамм 59361 32 64 32 32 64 44,8 
Штамм 100 64 4 64 8 32 34,8 
Штамм 111 64 32 32 32 32 38,4 
Штамм 100-16-1 64 64 64 64 64 64 
Штамм 111-6-1 128 128 128 128 128 128 


Из приведенных примеров следует, что применение предложенного штамма повышает активность иммунной сыворотки на обоих циклах иммунизации по сравнению с известными способами получения в 3,3-4,3 раза и позволяет получить иммунную сыворотку с титрами в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) 1:128.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ получения мелиоидозной иммунной сыворотки путем многократной иммунизации животных-продуцентов антигеном с последующим отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве антигена иммунизации используют штамм возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei 111-6-1, несинтезирующий поверхностный гетерополимер белково-углеводной природы (800 kDa), вызывающий иммунодепрессивное действие, иммунизацию проводят в 2 цикла и отделяют целевой продукт с титром в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) не менее 1:128.