ИММУНОГЕННЫЙ КОНЪЮГАТ БЕТА-ПРОПИОНАМИД-СВЯЗАННОГО ПОЛИСАХАРИДА С БЕЛКОМ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙСЯ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИНЫ

ИММУНОГЕННЫЙ КОНЪЮГАТ БЕТА-ПРОПИОНАМИД-СВЯЗАННОГО ПОЛИСАХАРИДА С БЕЛКОМ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙСЯ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИНЫ


RU (11) 2249463 (13) C2

(51) 7 A61K39/00, A61K39/095, A61K39/385, A61K39/09, A61K39/395 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.04.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001107132/13 
(22) Дата подачи заявки: 1999.08.18 
(30) Приоритетные данные: 60/097,120 1998.08.19 пп.1-49 US 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.08.18 
(43) Дата публикации заявки: 2004.08.20 
(45) Опубликовано: 2005.04.10 
(56) Аналоги изобретения: WO 9640239 A1, 19.12.1996. US 5576002 А, 19.11.1996. US 4727136 А, 23.02.1988. 
(72) Имя изобретателя: МИШОН Франсис (US); ХУАНГ Чун-Хсиен (US); УИТЗ Катрин (US) 
(73) Имя патентообладателя: БАКСТЕР ХЕЛФКЭА С.А. (CH) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2001.03.19 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 99/18982 (18.08.1999) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 00/10599 (02.03.2000) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной 

(54) ИММУНОГЕННЫЙ КОНЪЮГАТ БЕТА-ПРОПИОНАМИД-СВЯЗАННОГО ПОЛИСАХАРИДА С БЕЛКОМ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙСЯ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИНЫ
Изобретение относится к иммунологии. Предоставляются новые иммуногенные конъюгаты -пропионамидсвязанного полисахарида и N-пропионамидсвязанного олигосахарида с белком, а также способ получения этих конъюгатов. Конъюгаты используют для получения вакцин против инфекционных заболеваний и рака, что позволяет расширить арсенал медицинских препаратов, используемых для лечения этих заболеваний. 5 н. и 44 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл. 






ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Настоящее изобретение относится к иммуногенным конъюгатам -пропионамидсвязанного полисахарида с белком и к способам получения этих конъюгатов из бактерий, дрожжей или раковых клеток. Эти конъюгаты используются в качестве вакцин.

Бактериальные инфекции, вызываемые грамположительными бактериями, такими как Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix и Clostridium, и грамотрицательными бактериями, такими как Haemophilus, Shigella, Vibrio cholerae, Neisseria и некоторые типы Esherichia coli, вызывают значительную заболеваемость во всем мире. Этот факт вместе с возникающей устойчивостью, которую проявляют бактерии по отношению к антибиотикам, определяет необходимость разработки бактериальных вакцин. Например, streptococci представляют собой большой и разнообразный род грамположительных бактерий, который был подразделен на несколько групп на основе антигенности и структуры полисахаридов их клеточных стенок (26, 27). Две из этих групп связаны с серьезными инфекциями человека. Streptococci группы А вызывают ряд инфекционных нарушений, включая "стрептококковое горло", ревматическую лихорадку, стрептококковое импетиго и сепсис. Streptococci группы В являются важными перинатальными патогенами в США, а также в развивающихся странах (37).

Грамотрицательные бактерии также являются существенной причиной заболеваний. До разработки и применения в последнее время полисахарид-белковых вакцин, направленных против бактерии Haemophilus influenzae типа b (Hib), бактериальные инфекции Hib являлись причиной многочисленных случаев задержки умственного развития у детей. Инфекции N. menigitidis и Е.coli K1 ответственны за неонатальный менингит. Штаммы грамотрицательных бактерий, Е. coli, связаны с серьезными заболеваниями, включая гибель организма, наступающую в результате потребления мяса, зараженного штаммами Е. coli.

Конъюгаты полисахаридов с другой иммуногенной молекулой, такой как полипептид или белок, использовались для инициирования гуморальных иммунных ответов на ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий. Конъюгирование полисахарида или олигосахарида с полипептидом превращает иммунный ответ на полисахарид или олигосахарид, который обычно является Т-независимым, в Т-зависимый ответ.

В предыдущем уровне техники раскрывается как прямое, так и непрямое соединение полисахаридов с белками с образованием конъюгатов (итог подведен в ссылке (11) и патенте США №5 306 492). Методы конъюгирования включают в себя диазосочетание, тиоэфирное связывание, амидирование, восстановительное аминирование и тиокарбамоилирование для присоединения к белковому носителю.

Gever et al., Med. Microbiol. Immunol., 165: 171-288 (1979) описали получение конъюгатов некоторых капсульных полисахаридных фрагментов Klebsiella pneumoniae с нитрофенилэтиламиновым линкером путем восстановительного аминирования и присоединение производного сахара с помощью азосочетания.

В патенте США №4 057 685, McIntire, описан липополисахарид Escherichia coli с пониженной токсичностью, ковалентно связанный с белковым антигеном в результате взаимодействия с галогенангидридом.

В патенте США №4 356 170, Jennings et al., описывается получение полисахарид-белковых конъюгатов методом восстановительного аминирования.

В патенте США №4 673 574, 4 761 283 и 4 808 700, Anderson, описано получение иммуногенных конъюгатов, включающих в себя продукт восстановительного аминирования иммуногенного капсульного полисахаридного фрагмента, полученного из капсульного полимера Streptococcus pneumoniae или Н. influenzae, содержащего восстанавливающий конец, полученный с помощью таких методов, как окислительное расщепление периодатом или путем гидролиза гликозидной связи, и бактериальный токсин или токсоид в качестве белкового носителя.

В патенте США №4 459 286, Hillman et al., описано получение полисахарид-белкового конъюгата путем активации полисахарида Н. influenzae типа b цианбромидом, получения производного активированного полисахарида со спейсерной молекулой, 6-аминокапроновой кислотой и присоединения основного белка внешней мембраны Neisseria meningitidis с использованием водорастворимого карбодиимида с образованием связи амидного типа с белком через сложный ряд связующих звеньев от спейсера 6-аминокапроновой кислоты до полисахарида.

В патенте США №4 965 338, Gordon, описано получение водорастворимого ковалентного конъюгата полисахарида с дифтерийным токсоидом, где чистый полисахарид Н. influenzae типа b активируют цианбромидом и сразу смешивают с дифтерийным токсоидом, модифицированным ADH-спейсером.

В патенте США №4 663 160, Tsay et al., описан детоксифицированный полисахарид грамотрицательных бактерий, ковалентно связанный с детоксифицированным белком, полученным из тех же видов грамотрицательных бактерий, посредством фрагмента, имеющего 4-12 атомов углерода.

В патенте США №4 619 828, Gordon et al., описаны конъюгаты молекул полисахаридов патогенных бактерий, таких как Haemophilus influenzae типа В, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis и Escherichia coli, с Т-зависимыми антигенами, такими как дифтерийный и столбнячный токсоиды.

В патенте США №4 711 779, Porro et al., описаны вакцины на основе конъюгатов гликопротеинов, обладающие трехвалентной иммуногенной активностью, содержащие антигенные детерминанты капсульных полисахаридов грамположительных бактерий, а также либо CRM197, столбнячный токсоид, либо коклюшный токсин. 

В патенте США №5 306 492, Porro, описан конъюгат олигосахарида с белком-носителем, полученный путем взаимодействия олигосахарида, имеющего концевую восстанавливающую группу, с диаминометаном в присутствии пиридинборана, эта реакция представляет собой восстановительное аминирование, взаимодействия аминированного олигосахаридного продукта с молекулой, имеющей две функциональные группы, и затем взаимодействия активированного олигосахаридного продукта с белком-носителем. 

В патенте США №5 192 540, Kuo et al., описан конъюгат олигосахарида с белком, включающий в себя продукт восстановительного аминирования окисленного полирибозил-рибитолфосфат полисахаридного фрагмента, полученного из капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа В, и белка внешней мембраны Haemophilus influenzae типа В.

В публикации заявки на европейский патент №ЕР 0747063 А2 описан модифицированный капсульный полисахарид, содержащий различные производные сиаловой кислоты, и гетеробифункциональную линкерную молекулу, связанную с молекулой носителя. Линкеры используются для N-алкилирования приблизительно до 5 остатков сиаловой кислоты на полисахарид. Затем оставшиеся аминогруппы ацилируют пропионовым или уксусным ангидридом.

Существует потребность в более эффективных очищенных иммуногенных полисахарид-белковых конъюгатах, которые могут быть получены более простым способом и с более высоким выходом, для широкомасштабного получения вакцин на основе иммуногенных полисахарид-белковых конъюгатов.

Данное изобретение связано с иммуногенным конъюгатом -пропионамидсвязанного полисахарида и -пропионамидсвязанного олигосахарида с белком.

Целью данного изобретения является предоставление способа получения иммуногенных конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком, который имеет преимущества по сравнению с применяющимися в настоящее время методологиями. Дальнейшей целью данного изобретения является предоставление фармацевтических композиций, вакцин и других иммунологических реагентов, полученных на основе иммуногенных конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком.

Предоставляется способ получения иммуногенных полисахарид-белковых конъюгатов, который включает в себя де-N-ацетилирование полисахарида или олигосахарида путем основного или ферментативного гидролиза с последующим N-акрилоилированием N-деацетилированного полисахарида. N-акрилоилированный полисахарид непосредственно присоединяется к носителю-белку с образованием иммуногенного конъюгата -пропионамидсвязанного полисахарида с белком.

Полисахариды капсулы и клеточной поверхности можно экстрагировать в соответствии с данным изобретением либо из клеточных супернатантов бактерий, дрожжей или млекопитающих, или непосредственно из клеток бактерий, дрожжей или млекопитающих, путем гидролиза неустойчивой к действию основания связи, которая связывает полисахарид с другими клеточными компонентами, или путем ферментативного гидролиза. Часть N-ацетильных групп, удаленных в результате гидролиза с полисахарида, заменяют на N-акрилоильные группы, которые, в свою очередь, непосредственно связаны с белком, с образованием конъюгата согласно изобретению.

В одном аспекте данного изобретения предоставляются олигосахариды и полисахариды, которые непосредственно присоединены к белку (белкам) по нескольким положениям.

В другом аспекте данного изобретения предоставляется способ иммунизации млекопитающего против бактериальных или дрожжевых инфекций, или рака, который включает в себя введение млекопитающему эффективного количества вакцины согласно изобретению для предотвращения инфекции от болезнетворного организма или рака.

Аспектом настоящего изобретения является способ индуцирования продукции антител у млекопитающих с помощью конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком, которые защищают млекопитающее от инфекции или болезни.

Другим аспектом данного изобретения являются иммуноглобулин и выделенное антитело, продуцирующееся в ответ на иммунизацию конъюгатами -пропионамидсвязанного полисахарида с белком. Такие иммуноглобулин и выделенное антитело используются в качестве лекарственных препаратов и диагностических реагентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖА

Чертеж 1. Схематическое изображение способа получения иммуногенных конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении представлены новые полисахарид-белковый конъюгат и олигосахарид-белковые конъюгаты, применяющиеся в качестве иммуногенов и вакцин против бактериальных инфекций, дрожжевых инфекций, а также в качестве противораковых лекарственных препаратов. Полисахариды или олигосахариды, использующиеся для образования иммуногенных конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком, получают из источников полисахаридов или олигосахаридов, которые включают в себя, не ограничиваясь ими, грам(+) или грам(-) бактерии, дрожжи, раковые клетки или раковые ткани и т.п., в которых полисахарид или олигосахарид служит в качестве вирулентного фактора клеток при формировании защитных механизмов хозяина. Полисахарид-белковые конъюгаты настоящего изобретения образуются в результате непосредственного присоединения N-акрилоилированного полисахарида к белку путем присоединения нуклеофильных участков белков по Михаэлю.

Полисахариды или олигосахариды могут быть получены из ряда источников, включая грамотрицательные, грамположительные бактерии, дрожжи, раковые клетки или рекомбинантные формы каждого из них, путем основного или ферментативного гидролиза связи, которая соединяет полисахарид или олигосахарид с клеточными компонентами. Полисахарид или олигосахарид можно экстрагировать из организма или клетки путем приведения в контакт организма или клетки, или раствора, содержащего фрагменты организма или клетки, с основанием или ферментом. Затем, после основного или ферментативного гидролиза полисахарид или олигосахарид можно выделить с помощью ряда методов. Неограничивающими примерами грамположительных бактерий и их рекомбинантных штаммов, подходящих для применения в соответствии с данным изобретением, являются Streptococci, Staphylococci, Enterococci, Bacillus, Corynebacterium, Listeria, Erysipelothrix и Clostridium. В частности, применение Streptococci является более предпочтительным, и применение типов Ia, Ib, II, III, IV, V и VIII Streptococci группы В является наиболее предпочтительным. Неограничивающие примеры грамотрицательных бактерий и их рекомбинантных штаммов, подходящих для применения в соответствии с данным изобретением, включают в себя Haemophilus influenzae, Neisseria meningitides, Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa. В частности, применение Н. influenzae типа b, N. meningitides типов В, С, Y и W135, Е.coli K1 и Е.coli K92 является более предпочтительным. Примеры дрожжей, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, Cryptococcus neoformans. Примеры раковых клеток или раковых тканей, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают в себя, не ограничиваясь ими, мелкоклеточную карциному легких, нейробластому, рак молочной железы, карциному ободочной кишки и т.п.

Для гидролиза полисахарида или олигосахарида в водном или органическом растворителе в соответствии с данным изобретением с помощью способов, известных в данной области, может использоваться широкий ряд условий. Степень гидролиза N-ацетильных связей углеводов может контролироваться с помощью условий реакции. В одном воплощении по меньшей мере приблизительно 50% N-ацетильных групп удаляют в результате гидролиза, предпочтительно удаляют приблизительно от 50% до 100%, более предпочтительно удаляют приблизительно 90% или более нативных N-ацетильных групп. В особом воплощении приблизительно 95% или более N-ацетильных групп полисахарида подвергают гидролизу путем обработки гидролизующим реагентом.

Капсульные полисахариды, которые экстрагируются в присутствии основания, представляют собой такие полисахариды, у которых отсутствует какой-либо неустойчивый к действию основания заместитель, который не может быть замещен, такой как O-ацетильные группы, необходимые для проявления иммуногенности. Другие капсульные полисахариды, которые экстрагируются в присутствии основания, представляют собой полисахариды, у которых отсутствует фосфодиэфирная связь и остатки уроновой кислоты, присоединенные по 4 положению.

В предпочтительном воплощении основного гидролиза КПС (капсульные полисахариды) экстрагируют из группы В Streptococci (GBS). В наиболее предпочтительном воплощении КПС экстрагируют из GBS типов Ia, Ib, II, III, V и VIII.

В другом предпочтительном воплощении основного гидролиза КПС экстрагируют из S.pneumoniae. В более предпочтительном воплощении основного гидролиза КПС экстрагируют из S.pneumoniae типов III, IV и XIV.

В другом предпочтительном воплощении основного гидролиза КПС экстрагируют из бактерий Neisseria или Escherichia. В более предпочтительном воплощении основной экстракции КПС экстрагируют из Neisseria meningitidis типов В, С, Y или W135, Escherichia coli K1 или Escherichia coli K92.

Полисахариды, которые подвержены ферментативному деацетилированию, представляют собой такие полисахариды, у которых отсутствует какой-либо неустойчивый к ферменту заместитель, необходимый для проявления иммуногенности, в которых заместитель не может быть заменен или замещен иммуногенным фрагментом, эти полисахариды включают в себя, не ограничиваясь ими, GBS и т.п.

А. Получение N-акрилоилированных полисахаридов 

1. Деацетилирование полисахаридов

а) Исходные вещества 

Полисахарид или олигосахарид может быть получен с помощью щелочного или ферментативного гидролиза из концентрированных бактериальных клеток, дрожжевых клеток или клеток млекопитающих, или рекомбинантных форм этих клеток, или из супернатантов гомогенизированных клеток, или из кондиционированной среды, с помощью стандартных методов, известных в данной области. Полисахарид или олигосахарид может быть выделен и очищен с помощью стандартных методов, известных в данной области. В качестве исходного вещества также может быть использован полисахарид или олигосахарид из коммерческих источников. 

Методы выделения полисахарида зависят от конкретного использующегося полисахарида. Общим методом является использование ионного детергента для образования комплекса с заряженным полисахаридом. Этот комплекс осаждают и выделяют. Затем комплекс растворяют в растворе с высокой ионной силой, таком как раствор хлорида кальция, и затем полисахарид осаждают этанолом.

Выделенные и очищенные полисахариды и олигосахариды, полученные для использования в данном изобретении, предназначенные для применения для человека, предпочтительно содержат менее, чем 1% примесей нуклеиновых кислот и белка. Вследствие присутствия неорганических солей после очистки часто наблюдается чистота, степень которой составляет 80-100% углеводов.

b) Основной гидролиз

Для удаления N-ацетильных групп очищенные полисахариды или олигосахариды можно обработать основаниями. Неограничивающими примерами оснований, которые могут использоваться в соответствии с данным изобретением, являются NaOH, КОН, LiOH, NаНСО3, Na2CO3, К2 СО3, KCN, Еt3N, NH3, H2 N2H2, NaH, NaOMe, NaOEt или KOtBu. Такие основания, как NaOH, КОН, LiOH, NaH, NaOMe или KOtBu наиболее эффективно используются в интервале 0,5 N-5,0 N. Такие основания, как NaHCO3, Na2CO3, К2 СО3 и KCN могут использоваться в таких высоких концентрациях, какие только допускает их растворимость. Органические основания, такие как Et3N, могут использоваться в среде в высоких (50-100%) концентрациях, пока присутствует такой агент, как вода или спирт, для воздействия на гидролиз. Такие основания как NH 3 или H2N2H2 могут использоваться почти в любой концентрации, включая 100%. Можно использовать такие растворители, как вода, спирты (предпочтительно C1-C4), диметилсульфоксид, диметилформамид или смеси этих и других органических растворителей. Растворы оснований, включающие в себя воду, являются наиболее предпочтительными. 

Интервал рН, наиболее эффективный для удаления N-ацетильных групп с полисахарида или олигосахарида, составляет приблизительно от 9 до 14, причем оптимальное значением рН составляет приблизительно 12. Затем N-деацетилированный полисахарид очищают от оставшихся реагентов путем ультраочистки с использованием мембран или диализа с помощью стандартных методов, известных в данной области.

с) Ферментативный гидролиз

Для ферментативного удаления N-ацетильных групп с полисахарида или олигосахарида можно использовать фермент N-деацетилазу. В одном из воплощений фермент N-деацетилазу используют для удаления N-ацетильных остатков с полисахаридов или олигосахаридов, как описано в ссылках 47, 48 и 49. При ферментативном гидролизе полисахарид или олигосахарид и фермент деацетилазу смешивают с соответствующей ферментативной буферной системой при соответствующих рН и температуре и оставляют взаимодействовать на период, достаточный для удаления N-ацетильных групп. Для получения N-деацетилированного полисахарида в одном из воплощений полисахарид и фермент N-деацетилазу смешивают с соответствующей ферментативной буферной системой, например 50 мМ MES, 10 мМ MnCl2 , pH 6,3 при 37°С, в течение 60 минут. Реакцию останавливают с помощью соответствующего останавливающего раствора, например 1М монохлоруксусной кислоты, 0,5М NaOH, 2M NaCl, или путем разбавления соответствующим буферным раствором.

2. N-акрилоилирование полисахарида

Щелочной или ферментативный гидролиз полисахарида или олигосахарида приводит к удалению N-ацетильных групп с сиаловой кислоты и аминосахарных остатков полисахаридов или олигосахаридов. После гидролиза полисахарид или олигосахарид подвергают N-акрилоилированию до необходимой степени с помощью ряда акрилоилирующих агентов. 

В одном воплощении этот способ включает в себя добавление акрилоилирующего реагента для N-акрилоилирования N-деацетилированного полисахарида или олигосахарида. Примеры акрилоилирующих реагентов включают в себя, не ограничиваясь ими, акрилоилхлорид, акрилоилангидрид, акриловую кислоту и дегидратирующий агент, такой как DCC, CH 2CHCOCN и т.п., использующийся в избытке в концентрации, составляющей приблизительно 1М. В способе N-акрилоилирования N-деацетилированного полисахарида pH доводят до значения, находящегося в интервале приблизительно от 9 до 11, предпочтительно равного приблизительно 10, и поддерживают это значение в течение реакции. Температура в процессе реакции составляет приблизительно от 2°С до 8°С, предпочтительно приблизительно 4°С. Реакцию проводят в течение периода, составляющего приблизительно 1 час. Полученный N-акрилоилированный полисахарид или N-акрилоилированный олигосахарид является арилоилированным по меньшей мере на 95% или больше.

В. Получение конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком

Полисахарид или олигосахарид данного изобретения при образовании конъюгата с другой иммуногенной молекулой, такой как полипептид или белок, может использоваться для индуцирозания в организме гуморального ответа на ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и раковых образований. Конъюгирование полисахарида или олигосахарида с полипептидом превращает иммунный ответ на полисахарид или олигосахарид, который обычно является Т-независимым, в Т-зависимый ответ. Соответственно, предпочтительный размер полипептида - это такой размер, который является достаточным для обеспечения превращения ответа из Т-независимого в Т-зависимый. С целью предоставления вторичного иммуногена может быть полезным использование более маленьких полипептидов. Молекулярная масса белка-носителя обычно составляет приблизительно от 50 000 до 500 000.

Предпочтительные белки-носители включают в себя, не ограничиваясь ими, столбнячный токсоид, дифтерийный токсоид, субъединицу В холерного токсина, белки внешней мембраны Neisseria meningitidis, С- белок из Streptococcus группы В, С- белок из Streptococcus группы В, не связывающий IgA, токсоид Pseudomonas aeruginosa, коклюшный токсоид, синтетический белок, содержащий остатки лизина или цистеина, и т.п. Белком-носителем может быть нативный белок, химически модифицированный белок, детоксифицированный белок или рекомбинантный белок. Молекулы конъюгатов, полученные в соответствии с данным изобретением, что касается белкового компонента, могут представлять собой мономеры, димеры, тримеры и молекулы с более высокой степенью сшивки.

Данное изобретение предоставляет возможность получать молекулы конъюгатов, в которых белок связан с полисахаридом или олигосахаридом через одно или несколько положений на полисахариде или олигосахариде. Размер полисахарида или олигосахарида может широко варьировать. Один или несколько полисахаридов или олигосахаридов может быть перекрестно связанным с одним или несколькими белками. Конъюгаты настоящего изобретения предпочтительно представляют собой решетчатые структуры. Точки присоединения находятся между остатками лизина или цистеина белка и N-акрилоильными группами полисахарида или олигосахарида.

В одном из способов получения иммуногенного полисахарид-белкового конъюгата выделенный полисахарид (глюкозаминогликан), у которого остатки сахара, составляющие его повторяющиеся единицы, содержат свободные аминогруппы или N-ацильные группы (например, N-ацетильные группы), вначале подвергают гидролизу с использованием основания или фермента для удаления части или всех его N-ацильных групп. Свободные аминогруппы затем подвергают N-ацилированию с помощью N-акрилоирующего реагента с образованием N-акрилоилированного полисахарида, описанного выше. Затем N-акрилоилированный полисахарид непосредственно присоединяют к белку в условиях оптимальных рН, температуры и времени для образования иммуногенного конъюгата -пропионамидсвязанного полисахарида с белком.

В одном из воплощений для обеспечения оптимальной реакционной способности свободных -аминогрупп остатков лизина в белке конъюгирование проводят при рН выше 9,0, предпочтительно при рН, составляющем приблизительно от 9,0 до 10,0. В другом воплощении для обеспечения оптимальной реакционной способности тиоловых (SH) групп остатков цистеина в белке конъюгирование проводят при нейтральном рН, составляющем приблизительно 7,0. Выбор рН для осуществления способа конъюгирования может быть основан на количестве реакционноспособных групп в конкретном белке-носителе. Например, способ, в котором используют белок, составленный из более реакционноспособных остатков лизина по сравнению с остатками цистеина, предпочтительно проводят при основных значениях рН. Способ конъюгирования, в котором используют белок, составленный из более реакционноспособных остатков цистеина по сравнению с остатками лизина, предпочтительно проводят при нейтральных значениях рН.

Реакцию конъюгирования можно проводить в забуферивающих реагентах, включающих, но не ограничивающихся буферным реагентом, включающим карбонатный/бикарбонатный, боратный, фосфатный буфер и т.п. Температура реакции конъюгирования составляет по меньшей мере приблизительно 25°С, предпочтительно приблизительно 37°С, в течение периода, предпочтительно составляющего приблизительно 24 часа. Ключевая реакция включает 1,4-конъюгатное присоединение (по Михаэлю) нуклеофильных цистеиновых тиоловых групп или лизиновых -NH 2 групп белков с N-акрилоилированными остатками сахаров, как описано Romanowska et al. (46), которые присутствуют в повторяющихся единицах полисахарида, как показано на чертеже. В полученном конъюгате -пропионамидсвязанного полисахарида с белком соотношение полисахарида к белку составляет приблизительно от 0,1 до 0,6.

Гликозильные остатки полисахарида, имеющие N-ацильные группы, ответственные за непосредственное конъюгирование с остатками цистеина и/или лизина белка, включают в себя, не ограничиваясь ими, глюкозамин, галактозамин, маннозамин, фукозамин, сиаловые кислоты и т.п. Полисахарид может быть получен из таких природных источников, как бактериальные, дрожжевые или раковые клетки, или из синтетических источников. Синтетические источники включают в себя химический синтез, ферментативный синтез и хемоферментативный синтез. Синтез может представлять собой синтез de novo или модификацию природных углеводов. Выделенные природные углеводы могут быть модифицированы путем изменения функциональных групп углеводных остатков или путем добавления или удаления углеводных остатков.

Размер полисахарида или олигосахарида, предназначенного для применения в получении конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида и -пропионамидсвязанного олигосахарида с белком настоящего изобретения, может варьировать при конъюгирования с белком-носителем. Как определено в данном документе, олигосахарид, предназначенный для применения в настоящем изобретении, включает в себя по меньшей мере 10 остатков сахаров и предпочтительно от 10 до 50 остатков сахаров. Полисахарид, как определено в данном документе, включает в себя более 50 остатков сахаров и может включать в себя около 600 или более остатков. В некоторых случаях для усиления иммуногенности требуются конъюгаты больших размеров. Способы данного изобретения обеспечивают применение полисахаридов очень большого размера, так как в один полисахарид можно ввести много реакционноспособных участков. Другим преимуществом данного способа по сравнению с предшествующим уровнем техники является то, что не происходит изменений в заряженных функциональных группах полисахарида или олигосахарида, которые часто взаимодействуют с эпитопом, ответственным за иммунитет, или образуют часть такого эпитопа.

С. Вакцины

Данное изобретение также направлено на получение вакцин. В соответствии с данным изобретением выделенные конъюгаты -пропионамидсвязанного полисахарида с белком, описанные выше, могут быть использованы в качестве антигена, вызывающего образование антител, активных против полисахарида или олигосахарида и, следовательно, активных против организма или клетки, из которых был выделен этот полисахарид или олигосахарид. Вакцины настоящего изобретения могут представлять собой комбинационную или мультикомпонентную вакцину, дополнительно включающую в себя наряду с конъюгатом -пропионамидсвязанного полисахарида с белком, другие компоненты, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, дифтерийно-столбнячно-коклюшную (DTP), столбнячно-дифтерийную (Тd), DTaP, DTap-Hib вакцины, DTap-IPV-Hib вакцину и т.п., и их сочетания, для предоставления мультифункциональной вакцины, использующейся для иммунизации против ряда организмов или клеток, вызывающих заболевания.

Вакцины данного изобретения могут обеспечивать активный или пассивный иммунитет. Вакцины, предназначенные для обеспечения активного иммунитета, включают в себя выделенный и очищенный N-акрилоилированный полисахарид или олигосахарид, конъюгированный по меньшей мере с одним антигенным пептидом.

D. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции данного изобретения могут включать в себя по меньшей мере один полисахарид-белковый конъюгат и фармакологически приемлемые носители, такие как физиологический солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол или т.п. В другом воплощении фармацевтическая композиция включает в себя другой иммуногенный фрагмент, такой как пептид, или композиции, включающие в себя антитела, образование которых вызывается одним из КПС данного изобретения. Композиция может также включать в себя адъюванты для усиления иммунного ответа у реципиента. Такими адъювантами могут быть адъюванты на основе алюминия, такие как квасцы, или длинноцепочечные алкильные адъюванты, такие как стеарилтирозин (см. патент США с серийным №583 372, поданный 9/17/90; европейский патент, ЕР 0 549 617 B1; Moloney et al., патент США №4 258 029), мурамилдипептид (MDP) или его производное, монофосфориллипид A (MPL), сапонин (Quil-A) и т.п. См. также Jennings, et al., патент США №5 683 699 и Paoletti et al., J. Infectious Diseases 1997; 175:1237-9. Фармацевтическая композиция может также включать в себя один или несколько дополнительных иммуногенов, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, дифтерийно-столбнячно-коклюшный (DTP), столбнячно-дифтерийный (Td), DTaP, DTaP-Hib, DTaP-IPV-Hib и т.п., и их сочетания. Особенно эти фармацевтические композиции могут применяться в качестве вакцин.

Для индуцирования пассивного иммунитета фармацевтическая композиция может включать в себя поликлональные или моноклональные антитела, их производные или фрагменты и их рекомбинантные формы. Количество антитела, фрагмента или производного является терапевтически или профилактически эффективным количеством, которое определяется с помощью стандартных клинических методик.

Лекарственные препараты данного изобретения могут быть введены субъекту с помощью методов, которые, как известно в данной области, являются эффективными. К ним относятся интрадермальный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, внутримышечный, пероральный и интраназальный способы введения, но не только они. 

Композиции данного изобретения могут включать в себя подходящие для вакцин стандартные носители, буферы или консерванты, известные специалистам в данной области, включающие в себя, не ограничиваясь ими, любой подходящий фармацевтически приемлемый носитель, такой как физиологический солевой раствор, или другие подходящие для инъекции жидкости. В вакцинах могут также присутствовать обычные добавочные агенты, например стабилизаторы, такие как лактоза или сорбит, и адъюванты для усиления иммунного ответа, такие как фосфат или гидроксид алюминия, или сульфат- и стеарилтирозин. Вакцины, полученные

в соответствии с данным изобретением, могут также использоваться в качестве компонентов мультивалентных вакцин, которые вызывают образование иммунного ответа против множества инфекционных агентов.

Вакцины настоящего изобретения вводят в количествах, достаточных для индуцирования продукции антител как составной части иммунного ответа. Для индуцирования продукции антител IgG и IgM вакцина может быть введена парентерально или может быть доставлена к мембранам слизистых оболочек для индуцирования продукции антител IgA на поверхности тканей. Дозировка может быть установлена на основании размера, веса или возраста субъекта, получающего вакцину. Гуморальный ответ у субъекта можно отслеживать путем анализа титра антител или бактерицидной активности и увеличивать его в случае необходимости усиления ответа. Обычно разовая доза для ребенка составляет приблизительно 10 мкг вакцины, включающей в себя конъюгат, на дозу или приблизительно 0,5 мкг-20 мкг/килограмм. Взрослые получают дозу, составляющую приблизительно 0,5-20 мкг/килограмм вакцины, включающей в себя конъюгат. Для вакцины, включающей в себя конъюгат КПС с белком, обычная доза составляет приблизительно 25 мкг каждого индивидуального КПС на дозу. То есть вакцина против streptococcus группы В может включать в себя 25 мкг каждого из КПС из каждого из девяти серотипов. 

Е. Антитела

Образование антител против полисахарида может индуцироваться с помощью любого хорошо известного в данной области метода. В соответствии с одним из подходов образование антител может индуцироваться путем введения выделенного иммуногенного конъюгата -пропионамидсвязанного полисахарида с белком животному-хозяину. Животным-хозяином могут быть крыса, мышь, отличные от человека приматы или человек, но этот список не является ограничивающим. Предпочтительно хозяином является человек. В одном из воплощений иммунологические ответы могут быть усилены путем применения известных в данной области адъювантов.

С помощью любого из хорошо известных в данной области методов могут быть также получены моноклональные антитела против полисахарида. В соответствии с одним из методов используют культуры гибридомных клеточных линий (Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497). Моноклональными антителами против полисахарида могут быть человеческие моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела или гуманизированные моноклональные антитела, полученные с помощью любого из хорошо известных в данной области методов. В соответствии с одним из подходов могут быть получены химерные моноклональные антитела, которые содержат нечеловеческий (напр., мышиный) антигенсвязывающий домен, соединенный с человеческой константной областью (Takeda et al. (1985) Nature 314: 452). Гуманизированные антитела могут быть получены в соответствии с методиками Queen et al., патент США №5 585 089 и патент США №5 530 101. С помощью известных в данной области методов могут быть сконструированы одноцепочечные антитела (патент США №4 946 778; Davis, G.Т. et al., 1991 Biotechnology 9: 165-169; Pluckthun, A. 1990 Nature 347: 497-498). Домены константных областей антител могут быть модифицированы с помощью известных в данной области методов (WO 89/07142).

Антитела против полисахарида или олигосахарида могут быть очищены с помощью любой из хорошо известных в данной области методик, включающих в себя, не ограниваясь ими, иммуноабсорбционную или иммуноаффинную хроматографию или другие хроматографические методы (напр., ВЭЖХ). Антитела могут быть также выделены в виде иммуноглобулиновых фракций из сыворотки, плазмы или клеточной культуральной среды.

Молекулами антител данного изобретения могут являться интактные молекулы иммуноглобулинов, по существу интактные молекулы иммуноглобулинов или те фрагменты молекул иммуноглобулинов, например фрагменты Fab, которые содержат антигенсвязывающий участок. Молекулы антител могут принадлежать к любому классу, включая IgG, IgM и IgA.

Фрагменты антител против КПС могут быть получены с помощью любого из известных в данной области методов (Campbell (1985) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может использоваться в качестве терапевтического агента для обеспечения пассивной защиты от заболеваний, вызываемых грам(+), грам(-) бактериями или дрожжами. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также может использоваться в качестве диагностического реагента в стандартном иммунологическом анализе для регистракции и/или идентификации бактерий, дрожжей или раковых клеток. Антитело может поставляться в виде только набора или вместе со стандартными реагентами для иммунологического анализа.

В другом воплощении данного изобретении антитела против полисахарида или олигосахарида данного изобретения могут использоваться в качестве лекарственного препарата в терапевтическом или профилактическом применении для передачи пассивного иммунитета субъекта-хозяина другому субъекту (т.е. для усиления иммунного ответа субъекта против грамположительных или грамотрицательных бактерий или дрожжей, или для обеспечения ответа у пациентов, имеющих риск иммунных заболеваний, или у пациентов с иммунодефицитом, включая пациентов, страдающих СПИДом). Пассивный перенос антител является известным в данной области и может проводиться с помощью любого из известных методов. В соответствии с одним методом антитела против конъюгатов данного изобретения образуются в иммунокомпетентном животном-хозяине ("доноре"), их собирают от животного-хозяина и вводят субъекту-реципиенту. Например, для получения антител, активных против полисахарид-белкового конъюгата данного изобретения, можно использовать человека-донора. Затем антитела могут быть введены в терапевтически или профилактически эффективных количествах человеку-реципиенту, нуждающемуся в лечении, посредством чего реципиенту передается устойчивость к бактериям, которые связываются антителами, образование которых индуцировано с помощью полисахаридного компонента (см. Grossman, M. and Cohen, S.N., in "Basic and Clinical Immunology", 7th Ed., (Stites, D.P. and Terr, A.T. eds., Appleton & Lange 1991) Chapter 58 "Immunization"). 

В некоторых случаях полисахарид, использующийся в связи с данным изобретением, может вызывать образование антител, которые перекрестно реагируют с другими патогенными организмами и, таким образом, обладают способностью защищать организм от заражения этими другими бактериями.

F. Диагностические наборы

В другом воплощении КПС данного изобретения, или их производные, или фрагменты могут предоставляться в диагностических наборах, предназначенных для определения присутствия антител против бактерий, дрожжей или раковых клеток. Присутствие таких антител может быть определено до воздействия патогена и таким образом можно прогнозировать, какие из субъектов будут устойчивыми к инфекции. Диагностический набор может включать в себя по меньшей мере один из КПС данного изобретения, или его производные, или фрагменты, отдельно или в конъюгате с белком, и подходящие реагенты для определения реакции антител, когда модифицированные КПС, или их производные, или фрагменты смешивают с образцом, содержащим антитела против грамотрицательных, грамположительных бактерий, дрожжей или раковых клеток, или раковой ткани. Реакция антител может быть определена с помощью любого из методов, описанных в данной области, включая, но не ограничиваясь им, анализ ELISA. Знание этого является важным и может помочь избежать вакцинации, которая не является необходимой.

Альтернативно диагностический набор может дополнительно включать в себя твердую подложку, или магнитные шарики, или пластиковую матрицу и по меньшей мере один из КПС данного изобретения, или его производные, или фрагменты.

В некоторых случаях может быть предпочтительным, что КПС или их производные, или фрагменты являются мечеными. Метящие агенты являются хорошо известными в данной области. Например, метящие агенты включают в себя, не ограничиваясь ими, радиоактивные, хемилюминесцентные, биолюминесцентные, люминесцентные или другие идентификационные "маркеры" для подходящего анализа. Жидкости организма или образцы тканей (напр., кровь, сыворотка, слюна) могут быть собраны, очищены и подвергнуты анализу с помощью диагностического набора. КПС, производные или фрагменты могут быть очищены или не очищены и могут состоять из смеси молекул. 

Твердые матрицы известны в данной области и являются доступными, они включают в себя, не ограничиваясь ими, полистирол, полиэтилен, полипропилен, поликарбонат или любой твердый пластиковый материал в форме пробирок, шариков, микрочастиц, палочек для погружения, планшетов или т.п. Дополнительно матрицы включают в себя, не ограничиваясь ими, мембраны, 96-луночные микротитровальные планшеты, пробирки и пробирки Эппендорфа. В основном такие матрицы включают в себя любую поверхность, к которой может быть присоединен лигандсвязывающий агент, или поверхность, которая сама предоставляет участок присоединения лиганда.

Все упоминающиеся здесь публикации, патенты и статьи специально включены в данный документ полностью в виде ссылки. Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения, но они ни в коем случае не должны истолковываться как ограничивающие сферу данного изобретения. Специалистам в данной области должно быть понятно, что многочисленные изменения и замены могут быть сделаны без отклонения от духа и сферы данного изобретения.

ПРИМЕР 1

Получение конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком-носителем

Следующие не ограничивающие примеры описывают получение ряда клинически значимых полисахарид-белковых конъюгатов для вакцин против Streptococcus pneumoniae (тип 14), Streptococcus группы В (GBS), типа III и типа II, и Е. coli K1. Все из вышеупомянутых полисахаридов, использующихся в этом примере, представляют собой гликозаминогликаны, которые содержат N-ацетильные группы в одном или нескольких из гликозильных остатков, представляющих собой составные части их повторяющихся структурных единиц.

А. Деполимеризация пневмококкового полисахарида типа 14

Для увеличения растворимости полисахарид вначале подвергают частичной деполимеризации с помощью обработки ультразвуком. 200 мг пневмококкового полисахарида типа 14 (лот №2020510, Американская коллекция типовых культур) растворяют в 20 мл PBS и обрабатывают ультразвуком в течение 4 часов при 0°С с помощью ультразвукового генератора Branson, модель 450. Полученный полисахарид диализуют, лиофилизируют и затем фракционируют на колонке с супердексом 200, уравновешенной физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS). Пиковые фракции объединяют и затем диализуют против д.и. воды с использованием Spectra/Por® Membrane MWCO:3500. Выход после лиофилизации составляет 157,5 мг твердого вещества. Обработанный ультразвуком полисахарид имеет средний молекулярный вес, составляющий приблизительно 50 000, как определено с помощью SEC-MALLS с miniDAWN (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA).

В. Де-N-ацетилирование пневмококкового полисахарида типа 14

100 мг фракционированного пневмококкового полисахарида типа 14 растворяют в 10 мл 2N NaOH и затем к реакционной смеси добавляют 10 мг NaBH4. Эту смесь нагревают при 100°С в течение одного часа и затем охлаждают до комнатной температуры. N-деацетилированный компонент диализуют против д.и. (деионизированной) воды с использованием Spectra/Por® Membrane MWCO:3500 и лиофилизируют, получая 84 мг твердого вещества белого цвета. Как обнаружено посредством анализа N-деацетилированного полисахарида с помощью Н1 -ЯМР при 500 МГц, он содержит менее 5% остаточных N-ацетильных групп.

С. N-акрилоилирование N-деацетилированного пневмококкового полисахарида типа 14

84 мг N-деацетилированного пневмококкового полисахарида типа 14 растворяют в 4,2 мл д. и. воды. На водяной бане рН раствора доводят до 10 с помощью 2N NaOH. Затем добавляют 420 мкл смеси акрилоилхлорид:диоксан 1:1 об./об. и доводят рН до 11 с помощью 2N NaOH. Реакционную смесь оставляют стоять еще на час при рН 11, чтобы гарантировать завершение гидролиза сложных эфиров, которые могут образоваться в результате O-ацилирования. Этот раствор диализуют и лиофилизируют, получая 42 мг сухого порошка. После анализа с помощью Н1-ЯМР при 500 МГц было обнаружено, что полисахарид является N-акрилоилированным более, чем на 95%.

D. Присоединение N-акрилоилированного пневмококкового полисахарида типа 14 к мономеру столбнячного токсоида

22 мг N-акрилоилированного пневмококкового полисахарида типа 14 растворяют в 1,1 мл карбонат/бикарбонатного буфера, рН 9,5. К реакционной смеси добавляют 22 мг мономера столбнячного токсоида. Реакционную смесь инкубируют в течение ночи при 37°С. Протекание конъюгирования анализируют с помощью Biologic system (Bio-Rad), оборудованной колонкой с суперозой 12. Конъюгирование полисахарида со столбнячным токсином отслеживают по прогрессирующему увеличению пика, что регистрируют с помощью измерения УФ поглощения при 280 нм, элюирование происходит в свободном объеме. После завершения конъюгирования раствор нейтрализуют до рН 7 с помощью 0,1N HCl и затем диализуют против PBS. Конъюгат очищают, пропуская через колонку 1,6×60 см с супердексом 200 PG (Pharmacia) и элюируя с помощью PBS, содержащего 0,01% тимерозаля. Фракции, соответствующие пику свободного объема, объединяют. Содержание углеводов и белка в конъюгате оценивают с помощью окрашивания фенилсульфоновой кислотой по Dubois et al. (51) и окрашивания Кумасси по Брэдфорду (9).

Сходные методы используются для полисахаридов GBS типа II, типа III, а также Е.coli K1 и менингококка С. Условия реакций для каждого из этих полисахаридов приведены в таблицах ниже.

ТАБЛИЦА 1 
Е. Де-N-ацетилирование полисахарида GBS типа II и типа III 
Размер* ПС (кДа) ПС (мг) NaOH NaBH4 Температура Время реакции Выход 
GBSP II 250 63 мг 6 мл 12 мг 110°С 6 ч 63 мг 
GBSP III 110 50 мг 5 мл 10 мг 110°с 6 ч 55 мг 
*Определяют с помощью SEC-MALLS 
ТАБЛИЦА 2 
Е. N-акрилоилирование полисахарида GBS типа II и типа III 
Количество ПС (мг) Д.и. вода Акрилоилхлорид:диоксан 1:1 об./об. Выход 
GBSP II 60 3 мл 300 мл 60 мг 
GBSP III 55 2,75 мл 275 мл 55 мг 
ТАБЛИЦА 3 
Е. Присоединение полисахарида GBS II и GBS III к мономеру столбнячного токсоида 
ПС (мг) СТ* (мг) Карб./бикарб. буфер рН9,5 Температура Время инкубации 
GBSP II 10 10 0,5 мл 37°С в течение ночи 
GBSP III 10,52 9,52 0,5 мл 37°С в течение ночи 
*СТ - столбнячный токсоид 


F. Де-N-ацетилирование полисахарида К1

300 мг ПС К1 растворяют в 15 мл 2, ON раствора NaOH и добавляют 150 мг боргидрида натрия. Раствор нагревают при 110°С в течение 6 часов, охлаждают до комнатной температуры и разбавляют 20-кратным объемом деионизированной воды. После диафильтрации через мембрану Amicon YM3 в потоке деионизированной воды, раствор лиофилизируют, получая 255 мг N-деацетилированного ПС К1. H1-ЯМР при 500 МГц подтверждает, что М-деацетилирование полностью завершилось. 

G. М-акрилоилирование полисахарида К1

К 10 мл раствора 250 мг де-N-ацетилированного ПС К1 в деионизированной воде, охлажденного в бане со льдом, добавляют по каплям раствор акрилоилхлорида (Aldrich, Milwaukee, WI), полученный путем объединения 1 мл акрилоилхлорида с 1 мл диоксана. рН раствора поддерживают в интервале от 7,0 до 10,5 путем добавления 2N раствора гидроксида натрия. После завершения добавления рН увеличивают до 13 и поддерживают в интервале от 12,9 до 13,1 в течение одного часа при комнатной температуре. рН раствора доводят до 9,5 путем добавления по каплям IN HCl. Раствор подвергают диафильтрации с использованием мембраны Amicon YM3 в ячейке при перемешивании в потоке деионизированной воды. Удержанный остаток лиофилизируют досуха и полученное вещество (N-акрилоил-ПС К1) хранят в эксикаторе в морозильной камере при -20°С. Н1-ЯМР при 500 МГц показывает, что в процессе реакции происходит полное N-акрилоилирование.

Н. -Пропионамидсвязанный K1-rPorB конъюгат (K1-rPorB I)

Раствор, содержащий 8,4 мг N-акрилоил-ПС К1 и 4,0 мг рекомбинантного PorB Neisseria meningitidis в 0,3 мл 0,2М бората, 0,05% Zwittergen 3,14 (Boehringer Mannhein) pH 9,5, инкубируют при 37°С в течение 3 дней. Конъюгат очищают с помощью хроматографии с исключением по размеру на препаративной колонке с супердексом 200, элюируя PBS, содержащим 0,01% тимерозаля. Фракции с активным УФ-сигналом при 280 нм, элюирующиеся в свободном объеме колонки, или близко к нему, объединяют и хранят в холодильнике. Конъюгат анализируют на содержание сиаловой кислоты и белка с помощью окрашивания резорцином и Кумасси соответственно.

I. Получение тиолированного rPorB

К одному мл раствора rPorB порина с концентрацией 10 мг/мл в 0,25М буфере HEPES pH 8,5, содержащем 0,25М хлорида натрия и 0,05 цвиттергента 3-14, добавляют 0,2 мл 0,05М раствора N-сукцинимидил 3-[2-пиридилдитио]пропионата. Раствор тщательно перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение одного часа. К этому раствору добавляют 0,06 мл 1М раствора дитиотреитола в том же буфере. Раствор снова тщательно перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре еще на два часа. Раствор разбавляют с помощью 1,3 мл 0,25М буфера HEPES pH 7,0, содержащего 0,25М хлорида натрия и 0,05 цвиттергента 3-14, и загружают на колонку для обессоливания Pharmacia PD-10, которая была предварительно уравновешена тем же буфером. Элюирование проводят тем же буфером, элюат собирают и концентрируют с помощью концентратора Amicon Centricon 30 при 5 000 об/мин в течение одного часа. Остаток собирают, и определяют концентрацию белка.

Н. Получение N-акрилоилированного K1-S-rPorB конъюгата (К1-S-rPorB)

К 0,17 мл раствора полученного ранее тиолированного гРогВ с концентрацией 25 мг/мл добавляют 9 мг N-акрилоилированного полисахарида К1. Раствор тщательно перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 18 часов. Раствор очищают, пропуская через колонку с супердексом 200 (Pharmacia), используя PBS в качестве элюента. УФ-активные при 280 нм фракции, элюирующиеся в свободном объеме колонки или близко к нему, объединяют. Анализы показывают, что конъюгат содержит 25 мкг/мл полисахарида и 188 мкг/мл белка. 

I. Получение N-акрилоилированного GCMP-S-rPorB конъюгата (GCMP-S-rPorB)

Подобным образом N-акрилоилированный GCMP-S-rPorB получают по способу, сравнимому с описанным выше, для получения N-акрилоилированного K1-S-rPorB конъюгата, при этом обнаружено, что полученный конъюгат содержит 43 мкг/мл полисахарида и 200 мкг/мл белка.

ТАБЛИЦА 4 
Аналитические данные для описанных выше конъюгатов 
Концентрация белка, мкг/мл Концентрация ПС, мкг/мл Процент ПС в конъюгате 
Pn14-СТ (3) 547 293 (1) 35 
GBSII-CT (3) 377 160 (2) 30 
GBSIII-CT (3) 365 115 (2) 24 
K1-rPorB I (3) 147 17 (2) 10 
K1-rPorB II (4) 406 41 (2) 9 
K1-S-rPorB (3) 188 25 (2) 12 
GCMP-S-rPorB (3) 200 43 (2) 18 
(1) Общий углеводный анализ по Дюбуа

(2) Резорциновый анализ сиаловых кислот

(3) Получают путем непосредственного присоединения N-акрилоилированного полисахарида к соответствующему белку-носителю. (4) Контрольный конъюгат полученного путем восстановительного аминирования периодат-окисленного N-акрилоилированного ПС К1 с rPorB 


ПРИМЕР 2

Иммуногенность и эффективность конъюгатов -пропионамидсвязанного полисахарида с белком-носителем

Доклиническая оценка конъюгатов на мышах

Иммунологические анализы: Сывороточные антитела к каждому полисахаридному конъюгату измеряют с помощью ELISA. Конъюгаты человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) (Sigma, St Louis, МО), использующиеся для анализов ELISA, получают путем восстановительного аминирования. Окисленные полисахариды добавляют к ЧСА и затем подвергают восстановительному аминированию с помощью NaCNBH3. Конъюгаты выделяют с помощью гель-фильтрационной хроматографии и хранят высушенными из замороженного состояния при -70°С. Титры ПС-специфических антител определяют с помощью ELISA следующим образом. Полистирольные 96-луночные плоскодонные микротитровальные планшеты (NUNC Polysorb) (Nunc, Naperville, IL) покрывают конъюгатами ПС-ЧСА в PBS (0,01М фосфат натрия, 0,15М NaCl, pH 7,5) в количестве 0,25 мкг/лунку (100 мкл/лунку) путем инкубирования в течение 1 часа при 37°С, после чего 5 раз промывают PBS-Tween (0,05% об./об. Tween 20 в PBS). Все последующие инкубации проводят при комнатной температуре. Для всех необходимых промывок используют PBS-Tween. Покрытые планшеты затем блокируют с помощью PBS-БСА (0,5% мас./об. бычий сывороточный альбумин в PBS) для IgG ELISA, или 0,1% масс/об, обезжиренного сухого молока Carnation для IgM ELISA, в количестве 0,15 мл/лунку в течение 1 часа, после чего промывают. Разбавленную в 2 раза сыворотку, в повторах, вносят в планшет в количестве 100 мкл/лунку и инкубируют в течение 1 часа, после чего промывают. Добавляют конъюгат антитела (антимышиное козье антитело, меченное пероксидазой) (Kirkegaard & Perry Lab, Gaithersburg, MD) в количестве 100 мкл/лунку и инкубируют в течение 30 минут, после чего промывают. Добавляют краситель и раствор субстрата (Kirkegaard & Perry TMB) 1:1 и пероксид при 0,05 мл/лунку и инкубируют в течение 10 минут. Пероксидазную реакцию останавливают с помощью 1М Н 3РO4, 0,05 мл/лунку, и планшет считывают на считывающем устройстве для микропланшет Molecular Devices Emax (Molecular Devices, Menio Park, CA) при длине волны 450 нм, используя 650 нм в качестве длины волны сравнения. Фоновое поглощение определяют в нескольких не содержащих сыворотку контрольных лунках и усредняют для каждого планшета. Для каждого разведения сыворотки вычитают среднее значение фонового поглощения, и затем получают среднее значение поглощения сывороточных повторов. Для последующего анализа данных использовали модифицированный график Скэтчарда, где поглощение (ось Y) откладывали против соответствующего поглощению обратного разведения (ось X). В условиях, обеспечивающих равновесие и избыток антитела, для каждой серии разведений сыворотки получают прямую линию; эту линию экстраполируют к оси Х для определения титра антител. Положительный сывороточный контроль с предварительно определенным титром антител используют на каждом планшете для обеспечения отнесения, по отношению к которому стандартизуют все сыворотки, сводя к минимуму разброс данных, существующий для разных планшетов и разных дней. Результаты этих данных приведены в таблицах 5, 6 и 7.

Опсонофагоцитарный анализ (ОР): Способность к опсонизации мышиной антисыворотки против стрептококковых В (GBS) и пневмококковых конъюгатов определяли в опсонофагоцитарном лизирующем тесте in vitro с использованием человеческой промиелоцитарной лейкемической клеточной линии HL-60 (АТСС (американская коллекция типовых культур) №CCL 240). А именно 200 колониеобразующих единиц (КОЕ) клеточного штамма М781 GBS типа III, или пневмококкового штамма типа 14, смешивали в равных объемах с сывороточными антителами и инкубировали при встряхивании в течение 15 минут при 35°С в инкубаторе при 5% СО2. К этой смеси добавляют комплемент от крольчат и клетки HL-60 (5×105), культивированные в течение 5 дней в присутствии 90 мМ ДМФ, и инкубируют 1 час при 37°С при встряхивании. Для количественного определения роста культуры отбирают аликвоты. Титры определяют путем экстраполирования разведения антител, соответствующего пятидесяти процентам выживающих бактерий. Результаты этих анализов приведены в таблице 5 для пневмококковых конъюгатов типа 14 и в таблице 6 для конъюгатов GBS типа III.

Сывороточный бактерицидный анализ (SBA): Антителозависимую комплементопосредованную бактерицидную активность измеряют в единицах бактерицидного титра, или обратного разведения, который обеспечивает 50% гибель бактерий-мишеней. Комплемент во всех сыворотках вначале инкубировали при 56°С в течение 30 мин. Затем серии 2-кратных разведений готовили для каждой сыворотки с GBSS в стерильных 96-луночных планшетах с U-образным дном (Sigma), получая конечный объем 50 мкл/лунку. Сывороточный комплемент крольчат (Pel-Freez, Brown Deer, WI) разбавляют 1:1 рабочей концентрацией бактерий GBM (серотип 15 штамм 44/76) или менингококкового С11 группы С штамма сравнения и 50 мкл добавляют к каждой лунке, содержащей разбавленную сыворотку, получая реакционную смесь с конечным объемом 100 мкл/лунку. Эту реакционную смесь, содержащую 50% сыворотки (инактивированной нагреванием и разбавленной), 25% кроличьего сывороточного комплемента и 25% бактерий (в рабочей концентрации), инкубируют 60 минут во влажном инкубаторе при 37°С и 5% СО2 на шейкере для микротитровальных планшетов (LKB-Wallac; Pharmacia Biotech) при высокой скорости. 

Содержимое всех лунок затем помещают на шоколадный агар путем разбрызгивания 30 мкл/плашку. Также помещают исходные (нулевая точка времени инкубации) бактериальные образцы. Все плашки инкубируют в течение ночи, как и раньше. Затем считают колониеобразующие единицы (КОЕ) с помощью автоматического счетчика колоний от Imaging Products International (Chantilly, VA), беря среднее значение из трех считываний плашки. Обратное разведение, или титр, которое соответствует 50% гибели, непосредственно считывают из построенного графика, где на оси Х представлены значения log10 соответствующего обратного разведения, а на оси Y представлен процент выживания. Результаты этого анализа приведены в таблице 7.



Контрольной вакциной является конъюгат полисахарид типа 14-столбнячный токсоид, полученный путем восстановительного аминирования. Конъюгат Pn14-СТ является продуктом непосредственного присоединения N-акрилоилированного пневмококкового полисахарида типа 14 к столбнячному токсоиду.

Для этого исследования группам, состоящим из 10 мышей CD1 (Charles River Laboratory) возраста 6-8 недель, подкожно вводили на 0, 28 и 38 день 2,0 мкг конъюгированного полисахарида. У животных брали кровь на 0, 28 и 38 день, и на 59 день их обескровливали. ELISA проводят, используя конъюгат Pn14 полисахарид-ЧСА, полученный путем восстановительного аминирования. Титры, определенные с помощью ELISA, приведенные в таблице 5, представляют общие IgGs. Приведенные титры антител против пневмококкового штамма типа 14 определяли с помощью ОР.



Контрольной конъюгатной вакциной является конъюгат полисахарид GBS типа III-столбнячный токсоид, полученный путем восстановительного аминирования периодатокисленного полисахарида GBS типа III и столбнячного токсоида. Конъюгат GBS III-CT является продуктом непосредственного присоединения N-акрилоилированного полисахарида типа III к столбнячному токсоиду.

Для этого исследования группам, состоящим из 10 мышей CD1 (Charles River Laboratory) возраста 6-8 недель, подкожно вводили на 0, 21 и 42 день 2 мкг конъюгированного полисахарида. У мышей брали кровь на 0, 21 и 42 день, и на 52 день их обескровливали. Титры измеряли с помощью ELISA, используя полисахарид GBS типа III, присоединенный к человеческому сывороточному альбумину. Титры, приведенные в таблице 6, представляют общие IgGs против полисахарида типа III.



Контрольной вакциной (K1-rPorB II) является продукт восстановительного аминирования периодатокисленного N-акрилоилированного полисахарида К1 и столбнячного токсоида. Вакцина K1-rPorB I является продуктом непосредственного присоединения N-акрилоилированного полисахарида К1 к столбнячному токсоиду. K1-S-rPorB является продуктом непосредственного присоединения тиолированного rPorВ порина к N-акрилоилированному полисахариду К1.

Для этого исследования группы, состоящие из 10 мышей CD1 (возраст 4-6 недель), полученных от Charles River Laboratory, иммунизировали интраперитонеально на 0, 28 и 42 день. У мышей брали кровь на 0, 28 и 42 день, и затем их обескровливали на 52 день. Титры измеряли с помощью ELISA, используя N-пропионилированный полисахарид К1, присоединенный к человеческому сывороточному альбумину. Титры, приведенные в таблице 7, представляют общие IgGs против модифицированного N-пропионилированного полисахарида K1. В таблице 7 также приведены титры антител против штамма Н44/76 N. meningitidis группы В, серотип 15, определенные по сывороточному бактерицидному тесту (SBA) для крови, взятой на 52 день.

ТАБЛИЦА 8 
Иммуногенность конъюгатов GCMP 
Вакцина/адъювант ELISA 38 день SBA 38 день 
GCMP-S-rPorВ/квасцы лот1 44000 2100 
GCMP-S-rPorB/квасцы лот2 43000 2800 
РВS/квасцы <50 <50 


GCMP-S-rPorB является продуктом непосредственного присоединения N-акрилоилированного полисахарида менингококков группы С (GCMP) и тиолированного rPorВ. Для этих исследований на животных группам, состоящим из 10 аутбридинговых самок мышей Swiss Webster (возраст 6-8 недель) от HSD, подкожно вводили на 0 и 28 день 2 мкг конъюгированного полисахарида на дозу. Животных обескровливали на 38 день. Титры антител против полисахарида группы С измеряли с помощью ELISA, используя GCMP, присоединенный к человеческому сывороточному альбумину. Сывороточные бактерицидные титры получали, используя в качестве штамма сравнения менингококковый штамм С11.

Литература

1. Anderson, P., G.Peter, R.B.Johnson, L.H.Wetterlow and D.H.Smith. 1972. Immunization of humans with polyribosylphosphate, the capsular antigen of Haemophilus intluenzae type b. J.Clin. Invest. 51: 39-44.

2. Avery, O.T. and W.F.Goebel. 1931. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins V. The immunological specificity of an antigen prepared by combining the capsular polysaccharide of type 3 pneumococcus with foreign protein. J. Exp. Med. 54:437-447.

3. Baker, C.J. and D.L.Kasper. 1985. Group В streptococcal vaccines. Rev. Inf. Dis. 7:458-467. 

4. Baker, C.J., M.A.Rench, M.S.Edwards, R.J.Carpenter, B.M.Hays and D.L.Kasper. 1988. Immunization of pregnant women with a polysaccharide vaccine of group В Streptococcus. N. Engl. J. Med. 319: 1180-1185.

5. Baker, C.J., M.A.Rench and D.L.Kasper. 1990. Response to Type III polysaccharide in women whose infants have had invasive Group В streptococcal infection. New Engl. J. Med. 322: 1857-1860.

6. Baltimore, R.S., D.L.Kasper and J.Vecchitto. 1979. Mouse protection test for group В Streptococcus type III. J. Infect. Dis. 140:81-86.

7. Bednar, В. and J.P.Hennessey. 1993. Molecular size analysis of capsular polysaccharide preparations from Streptococcus pneumoniae. Carbohyd. Res. 243: 115-130.

8. Beri, R.G., J.Walker, E.T.Reese and J.E.Rollings. 1993. Characterization of chitosans via coupled size-exclusion chromatography and multiple-angle laser light-scattering technique. Carbohyd. Res. 238: 11-26.

9. Bradford, M.M., 1976. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72: 248-254.

10. D'Ambra, A.J., J.E.Baugher, P.E.Concannon, R.A.Pon and F.Michon. 1997. Direct and indirect methods for molar-mass analysis of fragments of the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type b. Anal. Biochem. 250 (2): 228-236.

11. Dick. W.E., Jr. and M.Beurret. 1989. Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens, p.48-114. In: Conjugate Vaccines Contributions to Microbiology and Immunology. J.M.Cruse and R.E.Lewis, Jr., (eds) S.Karger, Basel.

12. Dillon, H.C., Jr., S.Khare and B.M.Gray. 1987. Group В streptococcal carriage and discase: A 6-year prospective study. J.Pediat 110:31-36. 

13. Goebel, W.F. and O.T.Avery. 1931. Chemoimmunological studies on conjugated carbohydrate-proteins IV. The synthesis of the p-aminobenzyl ether of the soluble specific substance of type 3 pneumococcus and its coupling with protein. J. Exp. Med. 54: 431-436.

14. Gold. R., M.L.Lepow, I.Goldschneider, T.L.Draper and E.C.Gotschlich. 1975. Clinical evaluation of group A and group С meningococcal polysaccharide vaccines, in infants. J.Clin. Invest. 56: 1536-1547.

15. Gold, R., M.L.Lepow, I.Goldschneider and E.C.Gotschlich. 1977. Immune response of human infants to polysaccharide vaccines of Groups A and С Neisseria meningitides. J.Infect. Dis. 136S: S31-S35.

16. Gold, R.M., M.L.Lepow, I.Goldschneider, T.F.Draper and E.C.Gotschlich. 1978. Antibody responses of human infants to three doses of group A Neisseria meningitides vaccine administered at two, four and six months of age. J.Infect. Dis. 138: 731-735.

17. Hennessey, J.P., B.Bednar and V.Manam. 1993. Molecular size analysis of Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide. J. Liq. Chromat. 16: 1715-1729.

18. Howard, J.G., G.H.Christie, B.M.Courtenay, E.Leuchars and A.J.S. Davies. 1971. Studies on immunological paralysis. VI. Thymic-independence of tolerance and immunity to type III pneumococcal polysaccharide. Cell. Immunol. 2: 614-626.

19. Jennings, H.J., E.Katzenellenbogen, C.Lugowski and D.L.Kasper. 1983. Structure of the native polysaccharide antigens of type Ia and type Ib Group В Streptococcus. Biochemistry 22: 1258-1263.

20. Jennings, H.J., K.-.G.Rosell and D.L.Kasper. 1980. Structural determination and serology of the native polysaccharide antigen of type III group В Streptococcus. Can.J. Biochem. 58: 112-120.

21. Jennings, H.J., K.-.G.Rosell and D.L.Kasper. 1980. Structure and serology of the native polysaccharide antigen of type la group В Streptococcus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77: 2931-2935.

22. Jennings, H.J., K.-.G.Rosell, E.Katzenellenbogen and D.L.Kasper. 1983. Structural determination of the capsular polysaccharide antigen of type II Group В Streptococcus. J.Biol. Chem. 258: 1793-1798.

23. Jennings, H.J. and R.K.Sood. 1994. Synthetic glycoconjugates as human vaccines, p.325-371, In: Y.C.Lee and R.T.Lee, Neoglycoconjugates: Preparation and applications. Academic Press, New York.

24. Kasper, D.L., C.J.Baker, R.S.Baltimore, J.H.Crabb, G.Schiffman and H.J.Jennings. 1979. Immunodeterminant specificity of human immunity to type III group В Streptococcus. J. Exp. Med. 149: 327-339.

25. Knobloch, J.E. and P.N.Shaklee. 1997. Absolute molecular weight of low-molecular-weight heparins by size-exclusion chromatography with multiangle laser light scattering detection. Anal. Biochem. 245: 231-241.

26. Lancefield, R.C., 1933. A serological differentiation of human and other groups of haemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57: 571-595.

27. Lancefield, R.C., 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 38: 473-478.

28. Lancefield, R.C., M.McCarty and W.N.Everly. 1975. Multiple mouse-protective antibodies directed against group В streptococci: Special reference to antibodies effective against protein antigens. J.Exp. Med. 142: 165-179. 

29. Madoff, L.C., L.C.Paoletti, J.Y.Tai and D.L.Kasper. 1994. Maternal immunization of mice with Group В streptococcal type III polysaccharide-beta С protein conjugate elicits protective antibody to multiple serotypes. J.Clin. Invest. 94: 286-292.

30. Marques, M.B., D.L.Kasper, A.Shroff, F.Michon, H.J.Jennings and M.R.Wessels. 1994. Functional activity of antibodies to the group В polysaccharide of group В streptococci elicited by a polysaccharide-protein conjugate vaccine. Infect. Immun. 62: 1593-1599.

31. Mäkelä, P.R.H., H.Peltola, H.Kayhty, et al. 1977. Polysaccharide vaccines of group A Neisseria meningitides and Haemophilus influenzae type b: A field trial in Finland. J.Infect. Dis. 136: S43-50.

32. Michon, F., J.R.Brisson, A.Dell, D.L.Kasper and H.J.Jennings. 1988. Multiantennary group-specific polysaccharide of group В Streptococcus. Biochem. 27: 5341-5351. 

33. Peltola, A., H.Käyhty, A.Sivonen and P.R.H.Makela. 1977. Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide vaccine in children: A double blind field study of 100,000 vaccines 3 months to 5 years of age in Finland. Pediatrics 60: 730-737.

34. Peltola, H., P.R.H.Mäkelä, H.Jousimies, et al. 1977. Clinical efficacy of meningococcal group A vaccine in children three months to five years of age. N.Engl. J.Med. 297: 686-691. 

35. Reuter, G. and R.Schauer. 1994. Determination of sialic acids, p. 168-199. In: W.J.Lennarz and G.W.Hart, Methods in Enzymology Vol. 230 Techniques in Glycobiology. Academic Press, New York. 

36. Robbins, J.B. and R.Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J.Infect. Dis. 161: 821-832.

37. Smith, A.L. and J.Haas. 1991. Neonatal Bacterial Meningitis, p.313-333. In: W.M.Scheld. R.J.Whitley and D.T.Durack, Infections of the Central Nervous System. Raven Press, Ltd., New York.

38. Tsunashima. Т., К.Moro, В.Chu and T.-Y.Liu. 1978. Characterization of group С meningococcal polysaccharide by light-scattering spectroscopy. III. Determination of molecular weight, radius of gyration, and translational diffusional coefficient., Biopolymers 17: 251 -265.

39. von Hunolstein, С., L.Nicolini, S.D'Ascenzi, C.Voipe, G.Alfarone and G.Orefici. 1993. Sialic acid and biomass production by Streptococcus agalactiae under different growth conditions. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 458-462.

40. Wesseis, M.R., W.J.Benedi, H.J.Jennings, F.Michon, J.L.DiFabio and D.L.Kasper. 1989. Isolation and characterization of type IV group В Streptococcus capsular polysaccharide. Infect.Immun. 57: 1089-1094.

41. Wessels. M.R., J.L.DiFabio, V.J.Benedi, et al. 1991. Structural determination and immunochemical characterization of the type V group В Streptococcus capsular polysaccharide. J. Biol. Chem. 266: 6714-6719.

42. Wessels, M.R., L.C.Paoletti, D.L.Kasper, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group В Streptococcus. J.Clin. Invest. 86: 1428-1433.

43. Wessels, M.R., L.C.Paoletti, A.K.Rodewald, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type la and Ib group В streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61: 4760-4766.

44. Wessels, M.R., V.Pozsgay, D.L.Kasper and H.J.Jennings. 1987. Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsule polysaccharide of Type III Group В Streptococcus: A revised structure for the Type III Group В streptococcal polysaccharide antigen. J.Biol. Chem. 262:8262-8267.

45. Wyle, S.A., M.S.Artenstein, B.L.Brandt, et al. 1972. Immunologic response of man to group В meningococcal polysaccharide vaccines. J. Infect. Dis. 126: 514-522.

46. Romanowska, A., S.J.Meunier, F.D.Tropper, C.A.LaFerriere, and R.Roy. 1994. Michael Additions for Synthesis of Neoglycoproteins. Methods in Enzymology. Vol. 242: 90-101. 

47. Orellana. A. and C.B.Hirshberg. 1994. Molecular Cloning and Expression of a Glycosaminoglycan N-Acetylglucosaminyl N-Deacetylase/N-Sulfotransferase from a Heparin-producing Cell Line. J.Biol. Chem. Vol 269, No. 3 pp.2270-2276.

48. Cheung, W-F., I.Eriksson, M.Kusche-Gullberg, U.Lindahl, and L.Kjéllén, 1996. Expression of the Mouse Mastocytoma Glucosaminyl N-Deacetylase/N-sulfotransferase in Human Kidney 293 Cells Results in Increased N-Sulfation of Heparan Sulfate. Biochem 35: 5250-5256.

49. Kusche-Gullberg, M., I.Eriksson, D.Sandback Pikas, and L.Kjellen 1998. Identification and Expression in Mouse of Two Heparan Sulfate Glucosaminyl N-Deacetylase/N-Sulfotransferase Genes. J. Biol. Chem. Vol 273, No. 19: 11902-11907.

50. Finke, A., D.Bronner, A.V.Nikolaev, В.Jaim and К. Jann. 1991. Biosynthesis of the Escherichia coli K5 Polysaccharide, a Representative of Group II Capsular Polysaccharides: Polymerization In Vitro and Characterization of the Product. J. Bacteriology 173, No. 13: 4088-4094.

51. Dubois, M. et al 1965. Colormetric Method for the Determination of Sugars and Related Substance. Analytic. Chem. Vol. 28: 350-366.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Иммуногенный полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат, содержащий N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид, непосредственно соединенный с белком через сайты -положений одного или более пропионатных фрагментов N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида; где N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид, непосредственно соединенный с белком, вызывает выработку защитных антител, реактивных против N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида; где N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид получен из полисахарида или олигосахарида, содержащего N-ацетильные группы, и где по меньшей мере, 50% N-ацетильных групп замещено N-акрилоильными группами, полученными в N-пропионированном полисахариде или N-пропионированном олигосахариде, который подлежит соединению с указанным белком.

2. Конъюгат по п.1, где полисахарид или олигосахарид получен из полисахарида, происходящего из бактерий, дрожжей, раковых клеток, или синтезированного химическим путем.

3. Конъюгат по п.1, где полисахарид или олигосахарид получен из полисахарида, происходящего из Escherichia coli, Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella или Pseudomonas.

4. Конъюгат по п.1, где полисахарид или олигосахарид получен из полисахарида, происходящего из Streptococcus группы В, выбранных из группы, состоящей из типа Iа, типа Ib, типа II, типа III, типа V, типа VIII и их сочетаний.

5. Конъюгат по пункту 3, где полисахарид или олигосахарид получен из полисахарида, происходящего из группы Meningococcus, выбранной из группы, состоящей из группы В, группы С, группы Y, группы W135 и их сочетаний.

6. Конъюгат по п.3, где полисахарид или олигосахарид получен из полисахарида, происходящего из Е.coli K1, Е. coli K92, Pneumococcus типа 4, Pneumococcus типа 14, Streptococcus группы A, Streptococcus группы С или их сочетаний.

7. Конъюгат по п.1, где белок выбран из группы, состоящей из столбнячного токсоида, дифтерийного токсоида, белка внешней мембраны Neisseria meningitidis, пневмолизоида, С--белка из стрептококка группы В, и не связывающего IgA C- белка из Streptococcus группы В.

8. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.7, где белок получен с помощью рекомбинантных методов.

9. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.8, где белок является рекомбинантным белком внешней мембраны N. meningitidis. 

10. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.1, где полисахарид или олигосахарид содержит глюкозаминогликан. 

11. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.1, где полисахарид или олигосахарид содержит гликозильные остатки структурной повторяющейся единицы, имеющей, по меньшей мере, одну свободную аминогруппу или N-ацильную группу.

12. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.11, где гликозильный остаток выбран из группы, состоящей из глюкозамина, галактозамина, маннозамина, фукозамина и сиаловой кислоты.

13. Полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат по п.1, где N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид непосредственно связан со свободной -аминогруппой лизинового остатка или тиоловой группой цистеинового остатка белка.

14. Конъюгат по п.1, где конъюгат выбран из группы, состоящей из конъюгата полисахарида пропионамидо-группы Streptococcus pneumoniae типа 14 со столбнячным токсоидом, конъюгата полисахарида пропионамидо-группы В Streptococcus типа III со столбнячным токсоидом, конъюгата полисахарида пропионамидо-группы В Streptococcus типа II со столбнячным токсоидом, конъюгата полисахарида пропионамидо-группы Е.coli K1 со столбнячным токсоидом и конъюгата полисахарида менингококковой пропионамидо-группы С со столбнячным токсоидом, где указанный конъюгат используется в качестве вакцины.

15. Конъюгат по п.1 для использования в способе, отличающемся тем, что вызывает у млекопитающего выработку антительного ответа на полисахаридный или олигосахаридный компонент полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата, включающий в себя введение указанного конъюгата в количестве, достаточном для обеспечения защитного иммунитета.

16. Конъюгат, содержащий N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид, непосредственно связанный с белком через сайты -положений одного или более пропионатных фрагментов N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида; где конъюгат вызывает выработку защитных антител, реактивных против N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида; где указанный конъюгат получен способом, включающим в себя

A) де-N-ацетилирование выделенного полисахарида или олигосахарида с помощью де-N-ацетилирующего реагента с образованием де-N-ацетилированного полисахарида или де-N-ацетилированного олигосахарида, где по меньшей мере 50% N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида является де-N-ацетилированным;

B) N-акрилоилирование де-N-ацетилированного полисахарида или де-N-ацетилированного олигосахарида с помощью акрилоилирующего реагента с образованием N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида, и

C) непосредственное присоединение через сайты -положений одного или более пропионатных фрагментов N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида к бактериальному белку или искусственному белку, содержащему лизиновые или цистеиновые остатки, с образованием полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата, где указанный полисахарид-белковый конъюгат или олигосахарид-белковый конъюгат применяется в качестве иммуногена или вакцины.

17. Конъюгат по п.16, где полисахарид или олигосахарид получен из бактерий, дрожжей или раковых клеток, или же синтезирован химическим путем.

18. Конъюгаты по п.16, где связывание проводят при значении рН, приблизительно равном 7,0.

19. Конъюгат по п.16, где связывание проводят при значении рН выше 9.

20. Конъюгат по п.16, где связывание проводят в реагенте, выбранном из группы, состоящей из фосфатного буфера, бикарбонатного буфера и боратного буфера.

21. Конъюгат по п.16, где де-N-ацетилирующий реагент представляет собой основание или фермент и акрилоилирующий реагент выбран из группы, состоящей из N-акрилоилхлорида, акрилоилангидрида, акриловой кислоты и дегидратирующего агента.

22. Конъюгат по п.16 для использования в способе, отличающемся тем, что вызывает у млекопитающего выработку антительного ответа на полисахаридный или олигосахаридный компонент полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата, включающем в себя введение указанного конъюгата в количестве, достаточном для обеспечения защитного иммунитета.

23. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из п.1 или 16 и фармацевтически приемлемый носитель, причем фармацевтическая композиция обеспечивает защитный иммунитет против, по меньшей мере, одного из членов вида организма, из которого происходит полисахаридный или олигосахаридный компонент полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата.

24. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно включающая в себя адъювант.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, где адъютант выбран из группы, состоящей из квасцов и стеарилтирозина.

26. Фармацевтическая композиция по п.23, дополнительно включающая в себя второй компонент, причем упомянутый второй компонент выбран из группы иммуногенов, состоящей из дифтерийно-столбнячно-коклюшной (DTP), дифтерийно-столбнячно-бесклеточной коклюшной (DTaP), столбнячно-дифтерийной (Td), дифтерийно-столбнячно-бесклеточной коклюшной-Haemophilus influenzae типа В (DTaP-Hib), дифтерийно-столбнячно-бесклеточной коклюшной-инактивированной полиовирусной-Haemophilus influenzae типа В (DTaP-IPV-Hib) вакцин и их сочетаний.

27. Способ получения конъюгата -пропионамид-связанного полисахарид-белкового конъюгата или -пропионамид-связанного олигосахарид-белкового конъюгата, где указанные конъюгаты вызывают выработку защитных антител, реактивных против полисахарида или олигосахарида, где указанный конъюгат продуцируется способом, включающим в себя

А) де-N-ацетилирование полисахарида или олигосахарида с помощью де-N-ацетилирующего реагента с образованием де-N-ацетилированного полисахарида или де-N-ацетилированного олигосахарида, где по меньшей мере 50% де-N-ацетилированного полисахарида или N-ацетилированного олигосахарида является де-N-ацетилированным; 

B) N-акрилоилирование де-N-ацетилированного полисахарида или де-N-ацетилированного олигосахарида с помощью акрилоилирующего реагента, с образованием N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида, и

C) непосредственное присоединение через один или более сайтов -положений пропионатных фрагментов N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида к бактериальному белку или искусственному белку, содержащему лизиновые или цистеиновые остатки, с образованием -пропионамид-связанного полисахарид-белкового конъюгата или -пропионамид-связанного олигосахарид-белкового конъюгата.

28. Способ по п.27, где полисахарид или олигосахарид получают из полисахарида, происходящего из бактерий, дрожжей или раковых клеток, или же синтезируют химическим путем.

29. Способ по п.27, где полисахарид или олигосахарид получают из полисахарида или олигосахарида, происходящего из Escherichia coli, Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella или Pseudomonas.

30. Вакцина, включающая в себя конъюгат по п.1 или 16 и фармацевтически приемлемый носитель, где указанная вакцина обеспечивает защитный иммунитет против, по меньшей мере одного из членов вида организма, из которого происходит полисахаридный или олигосахаридный компонент полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата. 

31. Вакцина по п.30, где организм выбран из группы, состоящей из бактерий и дрожжей.

32. Вакцина по п.31, где бактерия выбрана из группы, состоящей из Escherichia coli, Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella и Pseudomonas.

33. Вакцина по п.30, дополнительно включающая в себя второй иммуноген в сочетании с полисахарид-белковым конъюгатом или олигосахарид-белковым конъюгатом, причем указанный второй иммуноген выбран из группы, состоящей из DTP, DTaP, Td, DtaP, Hib, DTaP-IPV-Hib и их сочетаний.

34. Вакцина по п.30 для применения в способе иммунизации млекопитающего, по меньшей мере, против одного заболевания, вызванного организмом, из которого был получен белковый компонент полисахарид-белкового конъюгата или олигосахарид-белкового конъюгата, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета.

35. Вакцина по п.30 для применения в способе иммунизации млекопитающего против Streptococcus pneumoniae, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета.

36. Вакцина по п.30, для применения в способе иммунизации млекопитающего против Streptococcus группы В, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета. 

37. Вакцина по п.30, для применения в способе иммунизации млекопитающего против Neisseria meningitidis группы В, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета.

38. Вакцина по п.30 для применения в способе иммунизации млекопитающего против Neisseria meningitidis группы С, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета. 

39. Вакцина по п.30 для применения в способе иммунизации млекопитающего против Haemophilus influenzae типа В, включающем в себя введение млекопитающему количества вакцины, достаточного для обеспечения защитного иммунитета.

40. Выделенный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, продуцирующийся в ответ на конъюгат по любому из п.1 или 16, причем указанный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент является специфически иммунореактивным в отношении N-пропионированного полисахарида или N-пропионированного олигосахарида и иммунореактивным в отношении нативного N-ацетилированного полисахарида, из которого был получен N-пропионированный полисахарид или N-пропионированный олигосахарид.

41. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где иммуноглобулин представляет собой выделенное антитело IgG.

42. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, выбранный из группы, состоящей из антитела IgG, антитела IgM, антитела IgA и их сочетаний. 

43. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где нативным N-ацетилированным полисахаридом является компонент бактерий, дрожжей или раковых клеток.

44. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.43, где полисахарид получен из Escherichia coli, Meningococcus, Pneumococcus, Streptococcus, Neisseria, Salmonella, Klebsiella или Pseudomonas.

45. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где антитело получают с помощью рекомбинантных методов.

46. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40 для использования в способе пассивной иммунизации млекопитающего против заболевания, вызванного организмом, или заболевания, вызванного клетками, где указанный способ включает в себя введение количества иммуноглобулина или его антиген-связывающего фрагмента, где указанное количество является достаточным для того, чтобы вызвать ингибирование или гибель организма, вызывающего заболевание, или клеток, вызывающих заболевание.

47. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.46, где иммуноглобулином является выделенное антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент.

48. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.46, где иммуноглобулином является выделенное антитело IgM или его антигенсвязывающий фрагмент. 

49. Иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент по п.46, где иммуноглобулином является выделенное антитело IgA или его антигенсвязывающий фрагмент.