СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ YERSINIA PESTIS EV

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ YERSINIA PESTIS EV


RU (11) 2248217 (13) C2

(51) 7 A61K39/02, C12P21/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.03.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003115185/13 
(22) Дата подачи заявки: 2003.05.22 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.05.22 
(43) Дата публикации заявки: 2004.11.20 
(45) Опубликовано: 2005.03.20 
(56) Аналоги изобретения: БЕСПАЛОВА И.А. Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1996. - 23 с. RU 2197988 С2, 10.02.2003. RU 2190424 C1, 10.10.2002. RU 2111246 C1, 20.05.1998. WO 9518231 А, 07.06.1995. 
(72) Имя изобретателя: Николаев В.Б. (RU); Иванова Т.А. (RU); Половинкина В.С. (RU); Саппо С.Г. (RU); Попова Ю.О. (RU); Марков Е.Ю. (RU); Голубинский Е.П. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (НИПЧИ Сибири и ДВ) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 664047, г.Иркутск, ул. Трилиссера, 78, НИПЧИ Сибири и ДВ 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ YERSINIA PESTIS EV
Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в производстве химической вакцины. Для осуществления способа клетки Yersinia pestis EV, культивированные на плотной питательной среде, доводят до концентрации 100×109 м.к./мл физиологическим раствором и обрабатывают равным объемом 0,125% раствора цетавлона в течение двух суток. После контроля специфической стерильности суспензию центрифугируют при 6000-8000 об/мин при 4°С в течение 20-30 мин, супернатант центрифугируют при 16000 об/мин при 4°С 20-30 мин, осадок промывают дважды физиологическим раствором, дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки. Осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия и встряхивают в течение 10-20 минут при комнатной температуре, обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 секунд в ледяной бане и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин, затем осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Способ отличается простотой в исполнении и позволяет получить препарат, обладающий высокой иммуногенностью.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в производстве химической вакцины.

Несмотря на то что в практике используется ряд препаратов для профилактики чумы, все они не лишены тех или иных недостатков, поэтому усовершенствование существующих и разработка новых современных средств специфической профилактики, в том числе на основе протективных бактериальных антигенов, остается актуальной задачей.

Известен способ получения иммуногенного препарата из чумного микроба, используемого в качестве живой чумной вакцины, путем культивирования Yersinia pestis EV (линии НИИЭГ) на плотной питательной среде с последующим смывом микробной массы, замораживанием и высушиванием (Коробкова Е.И. Живая противочумная вакцина. - М.: Медгиз, 1956. - 206 с.).

Практика многолетнего применения живой вакцины для профилактики чумы, полученной таким способом, позволяет считать этот препарат одним из наиболее эффективных. Наряду с этим живая вакцина против чумы имеет ряд существенных недостатков, к которым относятся высокая реактогенность препарата, выраженное аллергизирующее действие, снижение защитных свойств при заражении атипичными штаммами возбудителя чумы и некоторые другие. Вакцина не способна создать длительный иммунитет, по реактогенности этот препарат занимает одно из первых мест среди существующих вакцин (Бунин К.В., Гапочко К.Г. Прививочные реакции при иммунизации живыми вакцинами. - М.: Медицина, 1970. - 296 с.).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения иммуногенного препарата из Y. pestis EV, включающий водно-солевую и последующую водно-фенольную экстракцию бактериальной массы чумного микроба при 68°С, дифференциальное центрифугирование (10000 g, 1 ч, затем 125000 g 4-6 ч), гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-100 в присутствии 2,5% дезоксихолата натрия, щелочную обработку (0,25 М NaOH, 56°C, 2 ч) и гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-75 (Беспалова И.А. Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба: Автореф. дис... канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1996. - 23 с.).

Однако полученный таким способом препарат обладает не достаточно высокой иммуногенностью (Беспалова И.А., 1996). При этом способ получения этого препарата многоэтапный, продолжительный по времени и трудоемкий. Кроме того, при его реализации используется токсичный для человека и вредный для окружающей среды фенол.

Целью изобретения является уменьшение трудоемкости способа, получения препарата, обладающего более высокой иммуногенностью.

Поставленная цель достигается тем, что клетки Y. pestis EV культивируют на плотной питательной среде, отделяют микробную массу, доводят физиологическим раствором до концентрации 100×109 м.к./мл и инкубируют суспензию в течение двух суток, с равным объемом 0,125% раствора цетавлона. Затем суспензию центрифугируют при 6000-8000 об/мин при 4°С 20-30 мин. Полученный супернатант центрифугируют при 16000 об/мин 20-30 мин при 4°С и осадок промывают дважды физиологическим раствором, а затем дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки. Осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия при комнатной температуре и встряхивают в течение 10-20 мин. Далее суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 секунд в ледяной бане и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин при 4°С. Полученный осадок вторично ресуспендируют в дистиллированной воде, центрифугируют и лиофильно высушивают.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемое техническое решение отличается от известного тем, что микробную массу доводят до концентрации 100×10 9 м.к./мл физиологическим раствором, экстрагирование осуществляют равным объемом 0,125% раствора цетавлона в течение двух суток, центрифугирование проводят при 6000 об/мин при 4°С в течение 20-30 мин. Полученный супернатант центрифугируют при 16000 об/мин 20-30 мин при 4°С, а очистку осадка проводят следующим образом: промывают дважды физиологическим раствором, затем дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки, полученный осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия и встряхивают суспензию в течение 10-20 минут, затем суспензию обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 секунд, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин при 4°С, супернатант сливают, полученный осадок промывают центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30-40 мин в дистиллированной воде.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна". 

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ получения иммуногенного препарата из Y. pestis EV, который включал бы обработку выращенной бакмассы чумного микроба цетавлоном с последующей обработкой препарата раствором дезоксихолата натрия, ультразвуковой обработкой. А именно, предлагаемые режимы получения иммуногенного препарата позволяют достичь поставленной цели - получить препарат с более высокой иммуногенной активностью менее трудоемким способом, без использования токсичных для человека и вредных для окружающей среды химических реактивов.

Данный способ получения иммуногенного препарата из Y. pestis EV может быть использован при производстве химической вакцины.

Таким образом, предлагаемый способ получения иммуногенного препарата из Y. pestis EV соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ получения иммуногенного препарата осуществляется следующим образом. Культивируют клетки К. pestis EV (линии НИИЭГ) на плотной питательной среде при 37°С в течение двух суток, отделяют микробную массу, доводят до концентрации 100×109 м.к./мл физиологическим раствором и обрабатывают суспензию равным объемом 0,125% раствора цетавлона в течение двух суток. После 6 суток хранения при 4°С, на время контроля специфической стерильности, суспензию центрифугируют при 6000-8000 об/мин при 4°С 20-30 мин, освобождаясь от неразрушенных микробных клеток. Полученный супернатант центрифугируют при 16000 об/мин 20-30 мин при 4°С и осадок промывают дважды физиологическим раствором, а затем дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки. Осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия при комнатной температуре и встряхивают в течение 10-20 мин. Далее суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе "MSE-150 Watt" (Англия) при 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 секунд в ледяной бане и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин, осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофильно высушивают. 

Пример 1.

Иммуногенный препарат получают, как описано выше: культивируют клетки Y. pestis EV на плотной питательной среде при 37°С в течение двух суток, отделяют микробную массу и обрабатывают суспензию (концентрацией 100×10 9 м.к./мл) равным объемом 0,125% раствора цетавлона при перемешивании в течение двух суток. После контроля специфической стерильности суспензию центрифугируют при 6000 об/мин при 4°С 20 мин, освобождаясь от неразрушенных микробных клеток. Полученный супернатант центрифугируют при 16000 об/мин 20 мин при 4°С и осадок промывают дважды физиологическим раствором, а затем дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин, после каждой промывки. Осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия при комнатной температуре и встряхивают в течение 10 мин. Далее суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе "MSE-150 Watt" (Англия) при 20 кГц 3 цикла по 5 секунд в ледяной бане и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30 мин, осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофильно высушивают.

Испытание иммунногенных свойств препарата, полученного указанным способом, проводили на белых мышах обоих полов весом 18-20 г в дозах от 3,9 мкг до 125 мкг (по сухому весу). Препарат обладал выраженной протективной активностью, подкожное введение указанного препарата в дозах от 31,25 мкг до 125 мкг защищало 100% взятых в опыт белых мышей от последующего заражения вирулентным штаммом Y. pestis в дозе 100 Dcl на 21 сутки после иммунизации.

Пример 2.

Иммуногенный препарат получают следующим образом: культивируют клетки Y. pestis EV на плотной питательной среде при 37°С в течение двух суток, отделяют микробную массу и обрабатывают суспензию (концентрацией 100×109 м.к./мл) равным объемом 0,125% раствора цетавлона при перемешивании в течение двух суток. После контроля специфической стерильности суспензию центрифугируют при 8000 об/мин при 4°С 30 мин, освобождаясь от неразрушенных микробных клеток. Полученный супернатант центрифугируют при 16000 об/мин 30 мин при 4°С и осадок промывают дважды физиологическим раствором, а затем дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30 мин, после каждой промывки. Осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия при комнатной температуре и встряхивают в течение 20 мин. Далее суспензию обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе "MSE-150 Watt" (Англия) при 20 кГц 4 цикла по 7 секунд в ледяной бане и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 40 мин. Полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центрифугируют при 16000 об/мин в течение 40 мин, осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Для вакцинирования препарат ресуспендируют в физиологическом растворе.

Испытание иммуногенных свойств препарата, полученного указанным способом, проводили на белых мышах обоих полов весом 18-20 г в дозах от 3,9 мкг до 125 мкг (по сухому весу). Препарат обладал выраженной протективной активностью, подкожное введение указанного препарата в дозах от 31,25 мкг до 125 мкг защищало 100% взятых в опыт белых мышей от последующего заражения вирулентным штаммом Y. pestis в дозе 100 Dcl на 21 сутки после иммунизации.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат, обладающий высокой иммуногенностью по сравнению с препаратом, полученным по способу-прототипу, который в дозах 10 и 100 мкг защищает 50% мышей от заражения 5 Dcl вирулентного штамма чумного микроба. Препарат, полученный предложенным способом, защищает 50% взятых в опыт животных в дозах от 11,0 и 21,4 мкг от последующего заражения 100 Dcl вирулентного штамма, при этом он менее трудоемок, более экономичен, доступен в исполнении, экологичен.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ получения иммуногенного препарата из Yersinia pestis EV, включающий культивирование Y. pestis EV на плотной питательной среде, смыв микробной массы, ее экстракцию, центрифугирование, многократную очистку осадка с последующим центрифугированием и лиофильную сушку, отличающийся тем, что перед экстракцией микробную массу доводят до концентрации 100×109 м.к./мл физиологическим раствором, экстрагирование осуществляют равным объемом 0,125% раствора цетавлона в течение двух суток, центрифугирование проводят дважды: первый раз при 6000 об/мин при 4°С в течение 20-30 мин, и затем полученный супернатант центрифугируют второй раз - при 16000 об/мин 20-30 мин при 4°С, а очистку осадка проводят промыванием дважды физиологическим раствором, дистиллированной водой с центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20-30 мин после каждой промывки, полученный осадок ресуспендируют в 0,1% растворе дезоксихолата натрия и встряхивают суспензию в течение 10-20 мин, затем суспензию обрабатывают ультразвуком при частоте 20 кГц 3-4 циклами по 5-7 с в ледяной бане, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин при 4°С, полученный осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, центрифугируют при 16000 об/мин в течение 30-40 мин, затем осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды.