СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ, ПОДАВЛЯЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТЫ НОВОРОЖДЕННЫХ

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ, ПОДАВЛЯЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТЫ НОВОРОЖДЕННЫХ


RU (11) 2246732 (13) C2

(51) 7 G01N33/53 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003111599/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.04.21 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.04.21 
(43) Дата публикации заявки: 2004.10.27 
(45) Опубликовано: 2005.02.20 
(56) Аналоги изобретения: ANNUNZIATO F et al “Phenotype, localization and mechamism of suppression of CD4(+) CD25(+) human thymocytes”, J Exp. Med 2002, Aug 5, 196(3), p.379-387. MATSUSHITA E et al “Biochemical characterization of antigen specific T-cell factor”, Int Arch Allergy Appi Immunol 1989, 88(3), p.323-331. ФОМИЧЕВА Е.Е. и др. “Глюкокортикоидные гормоны в иммуномодулирующем действии дефенсинов”, Российский Физиологический Журнал им. И.М.Сеченова, 2002, Апр. 88(4), с.496-502. 
(72) Имя изобретателя: Талаев В.Ю. (RU); Рубцова И.Е. (RU); Лебедева И.Е. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное учреждение "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Министерства здравоохранения Российской Федерации" (RU) 
(98) Адрес для переписки: 603950, г.Нижний Новгород, ул. Грузинская, 44, ННИИЭМ, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ, ПОДАВЛЯЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТЫ НОВОРОЖДЕННЫХ
Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы новорожденного ребенка. Сущность изобретения состоит в том, что проводят реакцию бласттрансформации, определяют пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных антителами к CD3 в присутствии интерлейкина-7 (АКТ ИЛ-7) и в присутствии интерлейкина-7 и дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д), вычисляют индекс действия дексаметазона как отношение АКТ ИЛ-7 к АКТ ИЛ-7 Д, при этом значение индекса действия дексаметазна более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определить функциональный дефект иммунной системы, характерный для периода новорожденности.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки состояния иммунной системы новорожденного ребенка.

Известно, что цитокины являются группой белков, секретируемых различными клетками и регулирующих кроветворение, развитие иммунной системы, иммунный ответ и процессы воспаления. Большинство цитокинов полифункциональны. Тем не менее, можно выделить несколько групп цитокинов по их основным биологическим свойствам - стимуляторы гемопоэза (интерлейкин-3 (ИЛ-3), эритропоэтин, колониестимулирующие факторы); стимуляторы клеточных форм иммунного ответа и воспаления (ИЛ-2, ИЛ-9, ИЛ-12, интерфероны, факторы некроза опухоли); стимуляторы гуморального иммунного ответа и аллергических реакций (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6) и цитокины, подавляющие иммунный ответ и воспаление (ИЛ-10, отчасти ИЛ-4, прогестерон-индуцируемый фактор, пептидные гуморальные факторы плаценты). Соотношение продуцируемых цитокинов во многом определяют характер и эффективность иммунного ответа.

Ранее нами было выявлено два функциональных дефекта Т-лимфоцитов новорожденных, наличие которых коррелировало с тяжелым клиническим состоянием детей в неонатальном периоде. Один из этих дефектов - повышенная чувствительность Т-клеток к апоптозу, другой обусловлен анергией Т-клеток - отсутствием ответа этих клеток на активацию, моделирующую взаимодействие иммунной системы с чужеродным антигеном (Talayev V.Yu., Lebedeva I.E., Rubtzova I.E., and all. The Cord Blood T-cell Proliferation and Apoptosis: Their Connection to Newborn Children Health; Influence of Interleukin-2, -4, -7 and Dexametasone Exerted upon the Data. / Russian Journal of Immunology. - 2001. - V.6. - №1. - Р.29-38). Проведенные исследования показали, что анергия Т-клеток обусловлена повышенным уровнем продукции факторов, подавляющих пролиферацию. Одним из этих факторов является ИЛ-10, другие факторы не идентифицированы. В то же время, показано, что продукция этих факторов как у экспериментальных животных (I.М.Dozmorov and R.A.Miller. Generation of Antigen-Specific Th2 Cells from Unprimed Mice In Vitro: Effects of Dexamethasone and Anti-IL-10 Antibody. // The Journal of Immunology. - 1998. - V.160. - P.2700-2705), так и у людей (Talayev V.Yu., Lebedeva I.E., Rubtzova I.E., and all. The Cord Blood T-cell Proliferation and Apoptosis: Their Connection to Newbom Children Health; Influence of Interleukin-2, -4, -7 and Dexametasone Exerted upon the Data. // Russian Journal of Immunology-2001. - V.6. - №1, - P.29-38) может быть заблокирована синтетическим аналогом глюкокортикоидов - дексаметазоном. Данное обстоятельство позволило нам разработать способ оценки суммарной биологической активности гуморальных факторов, подавляющих Т-лимфоциты. Метод служит для выявления характерного для периода новорожденности функционального дефекта клеток иммунной системы.

Аналогичных методов оценки биологической активности супрессорных цитокинов не описано. Количество продуцируемых в культурах цитокинов можно определить с помощью иммуноферментного анализа (Mossman, T.R. and Fong T.A.T. Specific assays for cytokine production by Т cells. // J. Immunol. Meth. - 1989. - V.116. - P.151-158), а количество клеток-продуцентов цитокинов - с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания внутриклеточных цитокинов с последующим анализом на проточном лазерном цитометре (Jung Т., Shauer U., Heusser С., Neumann С., Rieger С. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. // J. Immunol. - 1993. - V.159. - P.197-207). Данные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако существенным недостатком этих методов является высокая стоимость реагентов и оборудования, необходимых для осуществления этих методов. Отечественных тест-ситем для выявления цитокинов с супрессорными свойствами не существует. Кроме того, как уже указывалось выше, до сих пор не установлена молекулярная природа всех цитокинов, подавляющих активность Т-лимфоцитов новорожденных. Соответственно, ни в нашей стране, ни в других странах не существует тест систем и реагентов, позволяющих определить все эти гуморальные факторы.

Цель изобретения - определение функционального дефекта иммунной системы, характерного для периода новорожденности и обусловленного повышенной продукцией факторов с иммуносупрессорной активностью.

Способ основан на способности синтетического аналога гормонов коры надпочечников - дексаметазона - подавлять продукцию широкого спектра цитокинов лимфоцитами человека в культуре. В результате этого дексаметазон подавляет пролиферацию активированных Т-лимфоцитов. В то же время, рекомбинантный человеческий ИЛ-7 способен полностью компенсировать созданный дексаметазоном дефицит цитокинов, стимулирующих размножение Т-лимфоцитов. В результате, введение дексаметазона в культуру мононуклеарных клеток пуповинной крови с Т-лимфоцитами, активированными антителами к молекуле CD3 в присутствии ИЛ-7, не приводит к подавлению пролиферации в культурах с нормальной продукцией цитокинов или же существенно увеличивает пролиферацию клеток в культурах, в которых до действия дексаметазона наблюдалась усиленная продукция подавляющих пролиферацию факторов. Предлагаемый метод позволяет оценить суммарную биологическую активность гуморальных факторов, продуцируемых клетками крови новорожденных и подавляющих активность Т-лимфоцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

Забор пуповинной крови осуществляют после рассечения пуповины из плацентарного отрезка пуповины в стерильный флакон объемом 50 мл, содержащий 1 мл раствора гепарина на среде ДМЕМ или физиологическом растворе. Концентрация раствора гепарина 100 ед/мл. Объем отбираемой пробы крови 5-10 мл. Взятая проба крови может храниться до 8 часов при +4°С. 

Мононуклеарные клетки из пробы крови выделяют традиционным способом над слоем фиколл-верографина, фиколл-пака или гистопака с плотностью 1,077 г/мл в стерильных условиях. Выделенные мононуклеарные клетки дважды отмывают средой для культур клеток ДМЕМ осаждая клетки центрифугированием при 1500 об./мин в течение 10 мин. Перед вторым центрифугированием количество клеток подсчитывают в камере Горяева. После центрифугирования готовят суспензию клеток, содержащую 106 клеток в 1 мл среды для культур клеток ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки 584 мг/мл L-глутамина и 50 мг/мл гентамицина.

Суспензию клеток вносят в 15 лунок 96 луночных стерильных круглодонных планшетов для иммунологических реакций или 96-луночных плоскодонных планшетов для культур клеток. В первые 3 лунки не вносят дополнительных реагентов. Эти лунки служат негативным контролем (К).

В следующие 3 лунки микропипеткой вносят по 10 мкл раствора очищенных моноклональных антител ИКО-90 к молекуле CD3. Раствор моноклональных антител, как и растворы всех остальных реагентов, готовят на среде того же состава, что использовалась для приготовления суспензии клеток. Раствор не должен содержать консервантов (азида натрия, мертиолята и др.). Концентрация антител во вносимом растворе - 20 мкг/мл. Данные 3 лунки служат для оценки пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на активацию через молекулу CD3 (АКТ). Активация Т-клеток через молекулу CD3 моделирует в поликлональном варианте активацию клеток антигеном при иммунном ответе.

В следующие 3 лунки вместе с 10 мкл раствора антител ИКО-90 вносят 10 мкл раствора натриевой соли фостфата дексаметазона. Концентрация раствора дексаметазона - 8 мкг/мл. Эти 3 лунки служат контролем действия дексаметазона на активированные Т-клетки (АКТ Д).

В следующие 3 лунки вносят по 10 мкл/мл раствора антител ИКО-90 и раствора рекомбинантного человеческого ИЛ-7. Концентрация раствора ИЛ-7 составляет 200 нг/мл. Эти лунки служат контролем пролиферации активированных Т-клеток в присутствии ИЛ-7 (АКТ ИЛ-7). По данным литературы и данным исследований авторов ИЛ-7 является оптимальным фактором роста и выживания Т-лимфоцитов новорожденных детей, способным полностью восполнять дефицит ростовых факторов в культуре (Webb LM, Foxwell BM, Feldmann M. Putative role for interieukin-7 in the maintenance of the recirculating naive CD4+T-cell pool. // Immunology. - 1999. - V. - 98(3). - P.400-405).

В следующие 3 лунки вносят по 10 мкл раствора антител ИКО-90, раствора ИЛ-7 и раствора натриевой соли фостфата дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д). Концентрация раствора дексаметазона - 8 мкг/мл.

На одном 96-луночном планшете можно засеять культуры из 6 образцов крови. Засеянные планшеты инкубируют при 37° С в атмосфере с 5% СО2 (в СO2-инкубаторе или в эксикаторе со свечой) в течение 72 часов. На последние 24 часа инкубации в засеянные лунки планшета вносят раствор меченного тритием метилтимидина по 0,5 мкКи на лунку. По окончании инкубации планшеты замораживают, оттаивают и переносят содержимое лунок на стекловолокнистве фильтры с помощью харвестера. Фильтры после тщательного высушивания переносят в сцинцилляционные флаконы с 5 мл сцинцилляционной жидкости. В качестве сцинцилляционной жидкости можно использовать ЖС-8 или раствор дефинилоксазола и дефинилоксазолил бензола на толуоле для спектроскопии. Радиоактивность фильтров определяют на сцинцилляционном счетчике (бета-1, СБС-2, Beckman). В результате получают значения пролиферации клеток в каждой лунке, выраженные в импульсах в мин. Значения, соответствующие лункам К, АКТ, АКТ Д, АКТ ИЛ-7 и АКТ ИЛ-7 Д усредняют.

Анализ результатов проводят следующим образом.

Результат реакции бласттрансформации в ответ на активацию Т-клеток через молекулу CD3 оценивают, вычисляя индекс стимуляции пролиферации - отношение средних значений пролиферации в лунках с антителами к CD3 к значению пролиферации в контрольных лунках (АКТ/К). Значение индекса стимуляции пролиферации менее 2 свидетельствует о низком пролиферативном ответе Т-клеток на активацию.

Продукцию подавляющих пролиферацию факторов оценивают, вычисляя индекс действия дексаметазона - отношение средних значений пролиферации в лунках с активированными клетками в присутствии ИЛ-7 к значению пролиферации в лунках с активированными клетками в присутствии ИЛ-7 и дексаметазона по формуле:

Индекс действия дексаметазона = АКТ ИЛ-7: АКТ ИЛ-7 Д.

Значение индекса действия дексаметазона более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции в культуре цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов. 

Пример 1. Пациент М. Новорожденный с нормальным сроком внутриутробного развития (40 нед.), практически здоров. Мононуклеарные клетки пуповинной крови новорожденного разводили в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамином и гентамиционом до концентрации 106 клеток в мл и по 200 мкл засевали в 15 лунок 96-луночного планшета для культур клеток без дополнительных реагентов (3 лунки - К), с моноклональными антителами ИКО-90 (3 лунки -АКТ), с моноклональными антителами и дексаметазоном (3 лунки - АКТ Д), с моноклональными антителами и ИЛ-7 (3 лунки - АКТ ИЛ-7) и с моноклональными антителами, ИЛ-7 и дексаметазоном (3 лунки - АКТ ИЛ-7 Д). Засеянные культуры клеток инкубировали 72 часа в СО2-инкубаторе, меченный тритием метилтимидин вносили на последние 24 часа инкубации. Включение метки оценивали с помощью счетчика Beckman LS-230. Результаты оценки пролиферации: 

К - 1004 импульса в мин

АКТ - 5347 импульсов в мин 

АКТ Д - 480 импульсов в мин

АКТ ИЛ-7 - 5531 импульс в мин

АКТ ИЛ-7 Д - 4961 импульс в мин

Расчитываем индекс стимуляции пролиферации 5347/1004=5,33. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию удовлетворительный.

Расчитываем индекс действия дексаметазона на продукцию подавляющих пролиферацию факторов 4961/5531=0,9. Усиленной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-клеток, не обнаружено.

Пример 2. Пациент В. Ребенок доношенный, в тяжелом клиническом состоянии. Клинический диагноз: “Респираторный дистресс-синдром, синдром аспирации мекония, осложненный двусторонней пневмонией, Перинатальная энцефалопатия гипоксического генеза, ПВК-1, гипохромная анемия средней степени, гемангиома грудной клетки справа”.

Мононуклеарные клетки пуповинной крови новорожденного разводили в среде ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамином и гентамиционом до концентрации 106 клеток в мл и по 200 мкл засевали в 15 лунок 96-луночного планшета для культур клеток без дополнительных реагентов (3 лунки - К), с моноклональными антителами ИКО-90 (3 лунки - АКТ), с моноклональными антителами и дексаметазоном (3 лунки - АКТ Д), с моноклональными антителами и ИЛ-7 (3 лунки - АКТ ИЛ-7) и с моноклональными антителами, ИЛ-7 и дексаметазоном (3 лунки - АКТ ИЛ-7 Д). Засеянные культуры клеток инкубировали 72 часа в СO2-инкубаторе, меченный тритием метилтимидин вносили на последние 24 часа инкубации. Включение метки оценивали с помощью счетчика Beckman LS-230. Результаты оценки пролиферации: 

К - 383 импульса в мин

АКТ - 362 импульсов в мин 

АКТ Д - 468 импульсов в мин

АКТ ИЛ-7 - 1044 импульса в мин

АКТ ИЛ-7 Д - 3804 импульса в мин

Индекс стимуляции пролиферации 362/383=0,95. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию отсутствует.

Индекс действия дексаметазона на продукцию подавляющих пролиферацию факторов 3804/1044=3,64. Обнаружена усиленная продукция цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-клеток. Делается заключение о подавленном ответе Т-лимфоцитов на активацию, причем, по крайней мере, одна из причин неудовлетворительного ответа Т-лимфоцитов - усиленная продукция лимфоцитами гуморальных факторов, угнетающих размножение лимфоцитов.

Таким образом, предложенный метод позволяет оценить как известный функциональный параметр иммунной системы - ответ Т-лимфоцитов новорожденного на активацию, так новый иммунологический показатель - суммарную биологическую активность гуморальных факторов, продуцируемых клетками крови новорожденных и подавляющих активность Т-лимфоцитов. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на активацию антителами к CD3 (реакция бласттрансформации с антителами к CD3) является известным методом оценки функционального состояния иммунной системы человека. Информативность данного метода в отношении новорожденных показана рядом авторов, в том числе и авторами данного изобретения (Талаев В.Ю., Лебедева И.Е. Метод определения функционального состояния иммунной системы детей раннего возраста. // Методические рекомендации. Министерство Здравоохранения РФ. - 1999. - 12 с.). Оригинальный метод определения суммарной биологической активности гуморальных факторов с иммуносупрессорной активностью позволяет выявить характерный для периода новорожденности дефект клеток иммунной системы. Наличие корреляции степени тяжести клинического состояния с выявляемым данным методом дефектом иммунной системы (Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Рубцова И.Е., Никонова М.Ф., Грачева Е.А., Бабайкина О.Н., Талаева Е.Б., Лукьянова Н.В. Пролиферация и апоптоз Т-лимфоцитов пуповинной крови: связь с клиническим состоянием новорожденных, влияние интерлейкинов-2, -4, -7 и дексаметазона на эти параметры. // Иммунология. - 2001. - №3. - С.29-35) свидетельствует о значимости данного параметра. Выявление у новорожденных слабости пролиферативного ответа (ИС пролиферации менее 2) и повышенной продукции супрессорных факторов (индекс действия дексаметазона более 1,2) требует от врачей неонатологов большей тщательности в проведении мероприятий, направленных на предотвращение инфицирования ребенка патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, а при обнаружении инфекции - введение в комплекс мер по лечению инфекции заместительной иммунокоррекции с помощью препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения (при отсутствии противопоказаний). 

Метод применим в условиях специализированных иммунологических лабораторий НИИ и диагностических центров. Учитывая незначительный расход дорогостоящих препаратов (рекомбинантный человеческий интерлейкин-7), метод не является дорогостоящим.

Метод разработан и апробирован в лаборатории клеточной иммунологии Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Акад. И.Н. Блохиной и применяется в этом институте для оценки состояния иммунной системы новорожденных, родившихся в роддомах №1 и 3 г.Нижнего Новгорода.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ определения продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных, заключающийся в том, что проводят реакцию бласттрансформации, определяют пролиферацию Т-лимфоцитов, активированных антителами к CD3 в присутствии интерлейкина-7 (АКТ ИЛ-7) и в присутствии интерлейкина-7 и дексаметазона (АКТ ИЛ-7 Д), вычисляют индекс действия дексаметазона как отношение АКТ ИЛ-7 к АКТ ИЛ-7 Д и значение индекса действия дексаметазона более 1,2 свидетельствует о повышенной продукции цитокинов, подавляющих пролиферацию Т-лимфоцитов новорожденных.