СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ИММУНОКОРРЕКТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ПЕРИТОНИТОМ

СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ИММУНОКОРРЕКТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ПЕРИТОНИТОМ


RU (11) 2243563 (13) C2

(51) 7 G01N33/573 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.12.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002131345/15 
(22) Дата подачи заявки: 2002.11.21 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.11.21 
(43) Дата публикации заявки: 2004.05.27 
(45) Опубликовано: 2004.12.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2132062 С1, 20.06.1999. RU 2052192 С1, 10.01.1996. САВЧЕНКО А.А. и др. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом. Лабораторное дело. 1989, № 11, с.23-25. 
(72) Имя изобретателя: Булыгин Г.В. (RU); Сарап П.В. (RU); Камзалакова Н.И. (RU); Андрейчиков А.В. (RU); Эйдемиллер Н.С. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Красноярская государственная медицинская академия (RU); Красноярская краевая клиническая больница (RU) 
(98) Адрес для переписки: 660022, г.Красноярск, ул. П. Железняка, 1, Красноярская государственная медицинская академия, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ПОДБОРА ИММУНОКОРРЕКТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ПЕРИТОНИТОМ
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано в хирургии для лечения больных перитонитом. Сущность изобретения состоит в том, что активность дегидрогенозлимфоцитов выражают в процентах по отношению к контролю, производят подсчет интегрального показателя соотношения пластических и энергетических процессов (ИП) и для метаболической иммунокоррекции выбирают препарат с максимальным значением ИП. Техническим результатом является разработка способа индивидуального подбора наиболее эффективного препарата для проведения иммунокоррекции у больных перитонитом. 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в хирургии для лечения больных перитонитом. 

Иммунодефицитные состояния при перитоните в целом характеризуют наличие нарушений пластических процессов, ограничивающих развитие адекватного иммунного ответа. Последний основан на пролиферации лимфоцитов, которая невозможна в условиях недостаточно интенсивных синтетических внутриклеточных реакций [1], обеспечивающих производство функционального резерва коферментов, мембранных структур, регуляторных веществ [6]. На уровне макроорганизма соотношение пластических и энегретических процессов контролируется влиянием симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы [11]. 

В настоящее время в арсенале практической медицины находится значительное число лекарственных средств для коррекции иммунного статуса больных с гнойной хирургической инфекцией. Широкие показания для их применения ставят перед практическим врачом проблему выбора наиболее оптимального препарата. Известно, что индивидуальные особенности метаболических реакций организма пациента в ходе лечения тем или иным препаратом часто служат причиной неэффективности назначенной терапии [4, 7].

Известны способы подбора лекарственных препаратов, основанные на оценке их влияния на состояние иммунокомпетентных клеток (ИКК), - так называемые нагрузочные пробы второго типа [5]. Сутью этих проб является регистрация изменений параметров ИКК после инкубации in vitro с препаратами. За основу нагрузочных проб различными авторами предложены реакции розеткообразования, иммунофлуоресценции, фагоцитоза, бласттрансформации Т-лимфоцитов и другие, характеризующие процессы пролиферации и дифференцировки, переход клеток в состояние функциональной активации [5].

Например, для выбора иммунокорректора предложено определять влияние препаратов на экспрессию комплекса дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD8, CD38, HLA I класса; преимущество при назначении имеет препарат, оптимально корректирующий соотношение CD4 +/CD8+, способ предусматривает также балльную оценку действия препаратов на экспрессию всех указанных антигенов [9].

Предложен способ подбора антибактериальных препаратов для лечения гнойно-воспалительных процессов, который осуществляют путем смешивания периферической крови больного с антибактериальными препаратами, отобранными по результатам антибиотикограммы, и нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Для лечения выбирают препарат с максимальным числом гранул формазана в нейтрофильных гранулоцитах. Это соответствует наименьшему иммунодепрессивному воздействию антибиотика [10].

Основной недостаток описанных выше способов - достаточно частое несовпадение прогнозируемых изменений иммунного статуса и отсутствие ожидаемых клинических эффектов при применении выбранных препаратов, что послужило причиной ограниченного их использования [5].

Задачей предлагаемого метода является индивидуальный подбор наиболее эффективного препарата для проведения иммунокоррекции у больных перитонитом.

Поставленную задачу решают за счет того, что выражают активность дегидрогеназлимфоцитов в процентах по отношению к контролю, после чего производят подсчет интегрального показателя (ИП) по предложенной формуле; для метаболической иммунокоррекции из ряда исследованных препаратов назначают препарат с максимальным значением ИП; препараты, для которых ИП<1, не назначают.

Способ осуществляют следующим образом. Лимфоциты выделяют из периферической венозной крови с антикоагулянтом (3% раствор ЭДТА на 0,85% забуференном растворе NaCl, pH 7,4) по методу A. Boyum (1974) [12] на градиенте плотности фиколл-верографина (р=1,077 г/см3). Ресуспендируют выделенные лимфоциты в количестве 300-500 тыс. клеток в 1 мл 0,85% забуференного раствора NaCl, рН 7,4, содержащего терапевтическую концентрацию лекарственного препарата. В качестве контрольной пробы используется та же дозировка лимфоцитарной взвеси в 1 мл 0,85% забуференного раствора NaCl с рН 7,4. Затем инкубируют опытные и контрольную пробирки при 37°С в течение 60 минут.

Биолюминесцентным методом с бактериальной люциферазой [8] определяют активность: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ); глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (НАДФМДГ); НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ). Расчитывают процентные изменения активности дегидрогеназ опытных проб по отношению к контрольной.

,

где DE - процентное изменение активности дегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной, ЕП и Е К - активность дегидрогеназы в опытной и контрольной пробах соответственно.

После этого производят подсчет интегрального показателя соотношения пластических и энегретических процессов в лимфоцитах (ИП) по следующей формуле:

ИП=1,3884+0,0163*DE Г3ФДГ+0,0002*DЕНАДГДГ-0,0089*DЕГ6ФДГ -0,0020*DЕНАДфМДГ

где DEГ3ФДГ - процентное изменение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

DEНАДГДГ - процентное изменение активности НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

DEГ6ФДГ - процентное изменение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

DEНАДФМДГ - процентное изменение активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

При сравнении действия нескольких препаратов максимальному значению ИП соответствует препарат, оказывающий максимальный пластический эффект, минимальному значению ИП соответствует препарат, оказывающий максимальный энергетический эффект. Для метаболической иммунокоррекции из ряда исследованных препаратов назначают препарат с максимальным значением ИП.

Предлагаемый способ основан на результатах лечения больных перитонитом с применением метаболических иммунокорректоров: пирацетама, реамберина, глутоксима, имунофана, полиоксидония. Их применение смещает метаболическое равновесие в инкубируемых с ними лимфоцитах в сторону преобладания пластических или энергетических реакций. Величина И11>1 отражает интенсификацию в клетках пластических реакций, а ИП<1 - энергетических реакций.

В качестве критерия соотношения интенсивности пластических и энергетических процессов использован показатель, предложенный Л.Х. Гаркави, именуемый “индексом стресса” (ИС), который отражает соотношение тонуса симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы. ИС расчитывается как отношение процентного содержания лимфоцитов к процентному содержанию сегментоядерных нейтрофилов в мазке периферической крови [2, 3]. Усиление пластических процессов проявляется возрастанием показателя ИС, активация энергетического обмена - снижением показателя ИС.

Формула подсчета ИП получена методом пошаговой множественной регрессии, что позволило выделить из ряда метаболических характеристик лимфоцитов наиболее значимые показатели. В качестве зависимой переменной использовано отношение ИС после курса иммунокоррекции к исходному значению.

Для оценки информативности метода обследованы лимфоциты 53 больных перитонитом. Проведена оценка влияния in vitro на внутриклеточный метаболизм лимфоцитов препаратов с преобладанием метаболического компонента иммунотропного действия. Суспензию выделенных лимфоцитов инкубировали в физиологическом растворе (1,0 мл) при 37°С с терапевтическими концентрациями пирацетама (5·10-2 г/л), глутоксима (2·10-3 г/л), реамберина (1,2 г/л) в течение 60 минут. Все больные получали один из перечисленных метаболических иммунокорректоров. У первой группы больных, состоявшей из 32 человек, подбор препаратов осуществлялся по клиническим показаниям с учетом значений ИП, у второй группы больных, включавшей 21 человека, - только по клиническим показаниям.

До и после проведения курса иммунокоррекции оценивались: лейкоцитоз (L, мкл-1), абсолютное количество лимфоцитов (АКЛ) в мкл периферической крови и значения ИС. Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2.

После курса иммунокоррекции в первой группе больных достоверно снизился ЛИИ, повысилось значение показателя ИС, что свидетельствует о снижении тяжести состояния. Изменения ИС свидетельствуют о снижении симпатикотонии. На этом фоне возрастание АКЛ (без повышения лейкоцитоза) - признак усиления пролиферативных и репаративных возможностей организма. Назначение препаратов по той же схеме без учета индивидуальных изменений метаболизма лимфоцитов не привело к значимым отличиям исследованных показателей. 

Согласно полученным данным индивидуальный подбор метаболических иммунокорректоров по предложенному методу повлиял на результаты лечения больных перитонитом. Показатель летальности в первой группе составил 9,4% (3 случая), во второй - 57,1% (12 случаев) (р<0,001).

Пример 1. Больная Ш., 31 год, № и/б 15344 (в таблице 2 данные № 21), находилась в Красноярской краевой клинической больнице с диагнозом: Острая спаечная кишечная непроходимость. Некроз тонкой кишки. Разлитой каловый перитонит. Несостоятельность швов энтеро-энтероанастомоза. Стрессовые перфорации тонкой кишки. Синдром полиорганной недостаточности.

14.07.01 экстренная операция: Лапаротомия, рассечение спаек.

17.07.01 появились симптомы раздражения брюшины, экстренно произведена операция: Релапаротомия, рассечение спаек, резекция участка тонкой кишки, трансназальная интубация тонкого кишечника, санация, дренирование брюшной полости. 20.07.01 плановая операция: Санация, ревизия брюшной полости, ушивание стрессовой перфорации тонкой кишки, лапаростомия.

Состояние больной продолжало оставаться тяжелым. 21.07.01 L - 5,0·109/л, СOЭ - 45 мм/ч, ИС - 0,40, абсолютное количество лимфоцитов (АКЛ) - 1250 мкл-1 , абсолютное количество Т-лимфоцитов (АКТЛ) - 700 мкл-1 , CD4/CD8 - 1,57. Индивидуальный подбор препаратов по предложенному методу не проводился. С целью иммунокоррекции назначен реамберин, предшествующее применение которого у ряда больных показало его высокую эффективность.

23.07.01 плановая операция: Ревизия брюшной полости, резекция анастомоза, ушивание несостоятельности швов тонкой кишки, лапаростомия. 26.07.01 плановая операция: Ревизия, санация брюшной полости, ушивание лапаростомы.

01.08.02 L - 7,2·109/л, СОЭ - 64 мм/ч, ИС - 0,07, АКЛ - 432 мкл-1, АКТЛ - 199 мкл-1, CD4/CD8-0,93. 

Несмотря на проводимую интенсивную терапию, 02.08.01 вновь появились симптомы перитонита, произведена экстренная операция: Релапаротомия, ушивание несостоятельности энтеро-энтероанастомоза и стрессовой перфорации тонкой кишки, лапаростомия. В послеоперационном периоде - состояние больной с отрицательной динамикой, отмечалось нарастание явлений полиорганной недостаточности. 10.08.01 летальный исход.

Пример 2. Больной К., 39 лет, и/б №10168 (в таблице 1 данные №29), находился в Красноярской краевой клинической больнице с диагнозом: Проникающее колото-резаное ранение брюшной полости с повреждением тонкой и толстой кишки. Стрессовые префорации тонкой кишки. Разлитой каловый перитонит.

06.05.02 криминальная травма: проникающее ножевое ранение брюшной полости. Произведена экстренная операция: Лапаротомия, ушивание ран тонкой и толстой кишки. В послеоперационном периоде 11.05.02 появились признаки перфорации полого органа брюшной полости, в связи с чем проведена экстренная операция: Релапаротомия, ушивание стрессовой перфорации тонкой кишки, трансназальная интубация тонкого кишечника, санация, дренирование брюшной полости. Состояние больного продолжало оставаться тяжелым, 18.05.02 вновь появились симптомы перитонита, произведена экстренная операция: Реапаротомия, ушивание дефекта тонкой кишки, санация, дренирование брюшной полости, лапаростомия.

19.05.02 L - 20,6·109/л, СОЭ - 25 мм/ч, ИС - 0,20, АКЛ - 1236 мкл-1, АКТЛ -692 мкл-1, CD4/CD8 - 0,80, что послужило показанием к проведению иммунокоррекции. По результатам тестов in vitro назначен пирацетам (ИП=2,276). ИП с глутоксимом и реамберином равны -0,034 и -1,926 соответственно. 

20.05.02 плановая операция: Санация, дренирование брюшной полости, ушивание стрессовой перфорации тонкой кишки, лапаростомия. 22.05.02 плановая операция: Санация, дренирование брюшной полости, ушивание лапростомы.

28.05.02 L - 11,3·109 /л, СОЭ - 15 мм/ч, ИС - 0,61, АКЛ - 3955 мкл-1, АКТЛ-2492 мкл-1, CD4/CD8 - 1,03.

На фоне проводимой интенсивной терапии послеоперационный период без осложнений. Выздоровление. 

Таким образом, клинические результаты подтверждают эффективность метода индивидуального подбора иммунокорректоров для лечения больных перитонитом.

Преимуществами предлагаемого метода являются:

1) возможность оценки изменений интенсивности пластических и энегретических процессов в лимфоцитах в ответ на действие иммунокоррегирующих препаратов in vitro;

2) совпадение результатов тестов in vitro с получаемыми клиническими результатами действия препарата;

3) уменьшение летальности у больных перитонитом с 57,1% до 9,4% (в 6 раз).

Предлагаемый метод может быть рекомендован для индивидуального подбора препаратов у больных перитонитом в клинической практике.

Используемые источники

1. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчиков А.В. Метаболические основы регуляции иммунного ответа. - Новосибирск: СО РАМН, 1999. - 346 с.

2. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. - Ростов-на-Дону, 1977.- 100 с.

3. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. и др. О некоторых принципах адаптационной деятельности организма. //15 Съезд Всесоюзн. физиологич. общества: Тез. докл. - Л.: Наука, 1987. - С.60.

4. Иммунопрофилактика и иммунотерапия инфекционных осложнений у больных с проникающими ранениями./ Г.В. Булава, Н.В. Горячева, В.П. Никулина и др. // VIII Всеросс. съезд хирургов, Краснодар, 21-23 сентября 1995 г.: Тез. докл. - Краснодар, 1995. - С.452-453.

5. Лебедев К.А., Понякина И. Д. Иммунограмма в клинической практике. - М.: Наука, 1990. - 224 с.

6. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. - Новосибирск: Наука, 1983. - 215с.

7. Решетников Е.А., Шипилов Г.Ф., Чуванов М.В. Нерешенные вопросы диагностики и лечение хирургического сепсиса. //Раны и раневая инфекция: Матер. междунар. конф. - М., 1998. - С.229-231.

8. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом.//Лаб.дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

9. Способ выбора препарата для иммунокоррекции: а.с. №2052192, МПК G 01 N 33/48 / Прилуцкий А.С., Линчевский Г.Л., Журило И.П., Майлян Э.А. (UA) - 6 с.

10. Способ подбора антибактериальных препаратов для лечения гнойно-воспалительных процессов: а.с. №2132062, МПК G 01 N 33/48 /Черкасов В.А., Буренкова Л.К., Палатова Л.Ф., Болотова М.Ф., Котельникова Л.П., Маслов Ю.Н., Дремин Д.И., Попов А.В. (RU) - 6 с.

11. Чумаков В.И. Как найти дорогу в “метаболическом хаосе”? - Ставрополь: СГМА. 2000. - 130 с.

12. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol.21 (Suppl. 77) - P.77-79. 






ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ индивидуального подбора иммунокорректоров для лечения больных перитонитом, включающий выделение лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографина с последующей инкубацией 300-500 тыс. лимфоцитов в 1 мл 0,85% забуференного раствора NaCl, рН 7,4, содержащего терапевтическую концентрацию лекарственного препарата при 37°С в течение 60 мин, определением активности в клетках глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы, НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы, отличающийся тем, что выражают активность дегидрогеназ лимфоцитов в процентах по отношению к контролю по формуле



где DE - процентное изменение активности дегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной;

ЕП и ЕК - активность дегидрогеназы в опытной и контрольной пробах соответственно,

производят подсчет интегрального показателя соотношения пластических и энергетических процессов (ИП) по формуле

ИП=1,3884+0,0163·DEГЗФДГ +0,0002·DEНАДГДГ-0,0089·DEГ6ФДГ -0,0020·DEНАДФМДГ,

где DEГЗФДГ - процентное изменение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной;

DEНАДГДГ - процентное изменение активности НАД-зависимой глутаматдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной;

DEГ6ФДГ - процентное изменение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

DEНАДФМДГ - процентное изменение активности НАД-зависимой малатдегидрогеназы опытной пробы по отношению к контрольной,

и для метаболической иммунокоррекции из ряда исследованных препаратов назначают препарат с максимальным значением ИП.