СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ


RU (11) 2288729 (13) C2

(51) МПК
A61K 35/36 (2006.01)
A61K 35/32 (2006.01)
A61K 9/06 (2006.01)
A61K 38/39 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.12.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003134131/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.11.24 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.11.24 
(43) Дата публикации заявки: 2005.05.20 
(45) Опубликовано: 2006.12.10 
(56) Аналоги изобретения: 2076718 C1, 10.04.1997. RU 2090179 C1, 20.09.1997. RU 2059383 C1, 10.05.1996. SU 1417454 A1, 20.05.1996. RU 2195255 С2, 27.12.2002. WO 9405702 A1, 17.03.1994. GALLOP P.M. et al. Preparation and properties of soluble collagen, Method in Enzy-mology, A.P., N.Y., 1963, v.6, p.635-641.. 
(72) Имя изобретателя: Лунева Светлана Николаевна (RU); Ковинька Михаил Александрович (RU); Матвеева Елена Леонидовна (RU); Талашова Ирина Александровна (RU); Накоскин Александр Николаевич (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Федеральное государственное учреждение науки "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ФГУН "РНЦ "ВТО" имени академика Г.А. Илизарова Росздрава") (RU) 
(98) Адрес для переписки: 640014, г.Курган, ул. М. Ульяновой, 6, ФГУН "РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова Росздрава, научная патентно-лицензионная группа 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, и предназначено для использования в косметологии и медицине. Способ выделения коллагена включает предварительную обработку костной ткани сельскохозяйственных животных, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, при этом костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают. Изобретение обеспечивает разработку экономичного по расходу времени и реактивов способа выделения коллагена из различных видов минерализованной соединительной ткани и получение косметического средства из высокоочищенного целевого продукта - коллагена, выделенного из костной ткани сельскохозяйственных животных. 2 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к химической технологии, в частности к фармацевтическому производству, а именно к производству препаратов, действке которых направлено на улучшение состояния соединительной ткани и ее регенерацию, и предназначено для использования в косметологии, кроме того, возможно его использование в области медицины.

В настоящее время известно, что коллагеновые волокна матрикса соединительной ткани выполняют структурную, опорную и стабилизирующую роль в отношении протеогликанов и воды. Кроме того, коллагеновый каркас обладает большой упругостью при действии сил растяжения и сжатия, играя основную роль в ограничении степени гидратации матрикса соединительной ткани (Miller E.J. Biochemical characteristics and biological significance of the genetically distinct collagens // Molec. Cell. Biochem. - 1976. - Vol.13. - N.2. - P.165-192).

Известен способ получения коллагена из - неминерализованной соединительной ткани - дермы, которую подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации уксусной кислотой, с последующим замораживанием, лиофильной сушкой и измельчением, без последующей стерилизации (Патент РФ №2076718, опубл. 10.04.1997).

Однако известный способ подразумевает выделение коллагена из неминерализованной соединительной ткани, в случае использования минерализованного сырья выделение коллагена и по данной схеме затруднительно. 

Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного по расходу времени и реактивов способа получения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных.

Поставленная задача решается тем, что в способе выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающем предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н. HCl в течение 20 часов, нерастворившийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 часов при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6000g, осадок диализуют против дистиллированной воды и очищают хроматографиен на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием, примером лабораторного выполнения и иллюстрациями, на которых:

Фиг.1 - иллюстрирует схему выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани;

Фиг.2 - иллюстрирует хроматографический профиль коллагена костной ткани на катионообменнике.

Способ осуществляют следующим образом.

После предварительной обработки, заключающейся в удалении мягких тканей, минерализованную соединительную ткань измельчали до кусочков размерами около 5×5 мм. Затем ткань подвергали деминерализации 0,5 н. HCl в течение 20 ч, после этой процедуры деминерализованную ткань освобождали от раствора костного минерала, неколлагеновых белков и проводили пепсиновый протеолиз в присутствии фермента в 0.1 М HCl с рН 2. Пепсин брался из расчета 1 мг на 100 мг ткани. За 18 ч инкубации при температуре 37°С на магнитной мешалке ткань разрушалась полностью с образованием коллоидного раствора, из которого осаждали коллаген добавлением сульфата аммония до 25%-го насыщения. Осадок формировался в течение 1 ч, после чего его отделяли центрифугированием (10 мин, 40.000 gx). Для получения высокоочищенного коллагена используют хроматографическое разделение на СМ-сефадексе. После этого коллаген лиофильно высушивают.

Примеры лабораторного выполнения.

Кости крупного рогатого скота очищают от мягких тканей, обезжиривают спирт-эфирной смесью 1:1, измельчают до кусочков размерами 5×5 мм.

100 г измельченной обезжиренной костной ткани помещают в круглодонную колбу, в которую заливают 200 мл 0,5 н. HCl и оставляют на 20 ч при комнатной температуре. Полученный после удаления надосадка нерастворившийся костный матрикс заливают 0,1 М HCl и вносят 1 мг пепсина. Реакционную массу помещают на магнитную мешалку и проводят ферментативный гидролиз костной ткани в течение 18 ч до полного растворения костей и образования коллоидного раствора. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием (40.000 g × 30 минут)

После этого к раствору протеолизата приливали насыщенный раствор сульфата аммония до концентрации 25%. Осадок коллагена, образовавшийся за 24 часа, отделяли центрифугированием (6.000 g × 60 минут), суспендировали и диализовали против дистилированной воды в течении 2-х суток, затем лиофильно высушивали. Полученный коллаген растворяли в 0,02 М растворе CH3 COONa (pH 4,8) в 1,0 М мочевине, центрифугировали и наносили на колонку размерами 2,5×20 см с СМ-сефадексом (ионообменная емкость 4,5+0,5 meg/g, размер гранул 40-120 мкм). Для элюирования использовали линейный градиент NaCl (0,00-1,5 М) в ацетатном буфере (pH 4.8). Хроматографию проводили в денатурирующих условиях. Фракции денситометрировали при длине волны 226 нм, фракцию коллагена в пределах одного хроматографического пика собирали, диализовали против воды и лиофильно высушивали.

Предлагаемый способ прост в использовании, позволяет воспроизводить его в условиях лаборатории лечебного учреждения, для его осуществления не требуется применения дорогостоящих реактивов и он позволяет получать высокоочищенный продукт из дешевого доступного сырья.

Кроме этого, получение высокоочищеного коллагена может проводиться в комплексе с выделением других биологически-активных веществ (ГАГ - гликозаминогликаны, НКБ - не коллагеновые белки) костной ткани, снижая тем самым себестоимость целевого продукта.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


Способ выделения коллагена из костной ткани сельскохозяйственных животных, включающий предварительную обработку ткани, измельчение, осаждение целевого продукта и его лиофильную сушку, отличающийся тем, что костную ткань обезжиривают спирто-эфирной смесью, после измельчения проводят деминерализацию 0,5 н HCl в течение 20 ч, нерастворивщийся матрикс подвергают протеолизу в присутствии пепсина в HCl с рН 2,0 в течение 18 ч при 37°С, затем центрифугируют при 40000g, из супернатанта осаждают целевой продукт сульфатом аммония до 25% насыщения, центрифугируют при 6,000g, осадок диализируют против дистиллированной воды и очищают хроматографией на СМ-сефадексе при рН 4,8, лиофильно высушивают.