СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОСТНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОСТНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА


RU (11) 2147800 (13) C1

(51) 7 A01N1/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 27.09.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.04.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 99102801/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.02.17 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.02.17 
(45) Опубликовано: 2000.04.27 
(56) Аналоги изобретения: Савельев В.И. Деминерализованная кость как особая разновидность костно-пластического материала. Сб.н.тр. - Л.: НИИТО, 1983, с.3-12. SU 214021 А, 12.05.68. SU 1152556 А, 30.04.85. SU 1556614 А1, 15.04.90. SU 1709973 А1, 07.02.92. SU 640725 А, 10.01.79. SU 209481 А, 23.11.67. 
(71) Имя заявителя: Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.Н.Н.Приорова 
(72) Имя изобретателя: Лекишвили М.В.; Касымов Ильгар Абульфас оглы 
(73) Имя патентообладателя: Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им.Н.Н.Приорова; Лекишвили Михаил Васильевич; Касымов Ильгар Абульфас оглы 
(98) Адрес для переписки: 125299, Москва, ул.Приорова 10, ЦИТО им.Н.Н.Приорова, лаборатория "Костный банк", Лекишвили М.В. 

(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОСТНОГО АЛЛОТРАНСПЛАНТАТА 

Изобретение относится к медицине. Способ изготовления костного аллотрансплантата может быть использован в травматологии, ортопедии и других областях восстановительной хирургии для осуществления костной пластики. Способ включает проведение механической обработки и промывки заготовки из костного материала, выполнение в ней сквозных отверстий, деминерализацию в растворе соляной кислоты, консервацию деминерализованной заготовки с помощью лиофильной сушки, стерилизацию после окончания сушки, осуществляемую путем облучения заготовки, помещенной в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов дозой 15-18 кГр в течение 16-20 с. Способ обеспечивает повышение качества аллотрансплантата. 1 с. и 3 з.п. ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии, травматологии и другим областям восстановительной хирургии, и может быть использовано при заготовке костных трансплантатов, предназначенных для осуществления костной пластики.

Известен способ изготовления аллотрансплантата, который заключается в последовательно проводимых механической очистке полученной от донора заготовки из костной ткани, обработке ее раствором перекиси водорода, стерилизации парами формалина, размещении в герметизируемые стеклянные ампулы, замораживании в холодильной камере при температуре минус 70oC и хранении заготовленного трансплантата до его клинического использования при температуре минус 30oC (см. кн: Имамалиев А.С. Биологическая оценка трансплантируемых тканей. М.: Наука, 1975 г., с. 48-57 [1]).

Полученный по способу [1] замороженный кортикальный аллотрансплантат отличается высокой механической прочностью, но не обладает, однако, заметными остеоиндуктивными свойствами, не обеспечивая при клиническом использовании быстрой перестройки и высокой регенерации костной ткани в области пересадки.

Известен способ изготовления аллотрансплантата, включающий механическую обработку полученной от донора заготовки из костного материала, промывку ей холодной водой, деминерализацию в 1,2-3,6 н. растворе соляной кислоты, промывку деминерализованной заготовки в дистилляте и в физиологическом растворе, стерилизацию и консервацию заготовки путем размещения и выдерживания ее в соответствующей герметичной таре (упаковке), залитой раствором формалина с добавкой антибиотика, (см.: Савельев В.И. Деминерализованная кость как особая разновидность костно-пластического материала. Сборник научных трудов ЛНИИТО им Р.Р. Вредена. Заготовка и пересадка деминерализованной костной ткани в эксперименте и клинике. Л.:НИИТО, 1983, с. 3-12 [2]).

Известный из [2] способ позволяет за счет деминерализации костной ткани получать аллотрансплантаты с высокой остеоиндуктивностью (которой практически не обладают замороженные недеминерализованные трансплантаты, приготовленные по способу [1]) и низкой антигенностью.

По совокупности существенных признаков известный из [2] способ является наиболее близким аналогом заявленного изобретения.

Однако существенным недостатком полученных по способу-прототипу [2] аллотрансплантатов является легко возникающая их деформация и низкая механическая точность, что недопустимо при обширных, и, в особенности, при сегментарных резекциях, требующих дополнительно наличия металлических конструкций, в то время как при использовании кортикальных, замороженных трансплантатов по способу [1] имеется возможность использовать гипсовую иммобилизацию.

Использование в [2] формалина в качестве консерванта и стерилизатора влечет за собой ряд проблем, обусловленных ограничением времени хранения трансплантата (не более 6-й месяцев), необходимостью отмывки приготовленного трансплантата перед клиническим использованием, токсичностью формалина, а также неудобством хранения и транспортировки трансплантата, погруженного в раствор формалина.

Кроме того, используемая в [2] достаточно высокая концентрация соляной кислоты не позволяет надежно контролировать интенсивно протекающий процесс деминерализации, что может привести к снижению качества деминерализации, а следовательно, и к снижению остеоиндуктивного свойства полученного трансплантата.

Задачей заявленного изобретения является повышение качества аллотрансплантата и улучшение его эксплуатационных свойств за счет повышения механической прочности, улучшения остеоиндуктивных свойств, увеличения срока хранения, упрощения и сокращения времени подготовки аллотрансплантата к клиническому использованию.

Для решения поставленной задачи способ изготовления костного аллотрансплантата, включающий последовательно проводимые механическую обработку и промывку взятой от донора заготовки из костного материала, ее деминерализацию в растворе соляной кислоты, а также стерилизацию, консервацию и герметизацию заготовки, усовершенствован согласно данному изобретению тем, что перед деминерализацией в заготовке выполняют множественные сквозные отверстия, консервацию проводят посредством лиофильной сушки, а стерилизацию осуществляют после окончания лиофильной сушки с помощью облучения заготовки, помещенной перед ее стерилизацией в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов в течение 16-20 сек дозой облучения 15-18 кГр.

Кроме того, способ изготовления костного аллотрансплантата усовершенствован тем, что лиофильная сушка заготовки из костного материала включает замораживание ее в течение 22-26 часов до температуры в интервале от минус 60 до минус 80oС, выдерживание заготовки в течение 3-5 суток при температуре в интервале от минус 30 до минус 40oС и снижение влажности костного материала до 4-6% в течение 30-40 часов при постепенном увеличении температуры сушки в течение первых 6-8 часов сушки до 35-45oС и сохранении этой температуры до окончания процесса лиофильной сушки.

Кроме того, тем, что деминерализацию проводят в (0,7-1,1) н. растворе соляной кислоты при 18-20oС в течение 2-3 суток.

А также тем, что диаметр множественных отверстий в заготовке составляет 0,6-0,8 мм при плотности расположения отверстий 19-1,5 отверстия на кв.см поверхности заготовки.

Предложенные согласно заявленному изобретению усовершенствования способа изготовления аллотрансплантата являются результатом обобщения данных лабораторных исследований и практики клинического использования аллотрансплантатов, изготовленных с использованием вышеуказанных усовершенствований - новых, по отношению к способу-прототипу, действий, условий их выполнения и режимных параметров, при которых они выполняются. Полученные результаты лабораторных испытаний и клинического использования подтверждают возможность решения поставленной в заявленном изобретении задачи.

В частности, предложенная консервация заготовок из костного материала путем лиофильной (сублимационной) сушки позволяет повысить механическую прочность трансплантатов, увеличить срок их хранения без потери ими биологических свойств, упростить их подготовку к клиническому использованию, исключить необходимость использования формалина в процессе изготовления аллотрансплантатов и связанные с этим проблемы (в том числе и экологическую), а также обеспечить удобство транспортировки и хранения трансплантатов.

Вышеприведенные заявленные временные, влажностные и температурные режимные параметры лиофильной сушки в наибольшей мере позволяют реализовать все ей преимущества применительно к процессу изготовления аллотрансплантата. При этом предложенное замораживание заготовки в течение 22-26 часов при температуре в интервале от минус 60 до минус 80oС обеспечивает быстрое замораживание костного материала заготовки с переходом жидкости костной ткани непосредственно в аморфное состояние, минуя стадию кристаллизации, что позволяет сохранить целостность клеток костной ткани, сохранить костную ткань в биологически активном состоянии и снизить тем самым риск отторжения используемого трансплантата.

Выдерживание заготовки в процессе сушки при температуре в интервале от минус 30 до минус 40oС в течение 3-5 суток и последующее снижение влажности костной ткани вышеуказанным образом способствует в наибольшей степени разрушению антигенных структур и сохранению костного морфогенетического белка в состоянии готовности к взаимодействию с индуцибельными системами, т.е. обеспечивает высокие остеоиндуктивные свойства аллотрансплантата.

Для лиофильной сушки заготовки с реализацией вышеуказанных режимов температур может быть использована, например, сублимационная установка типа LZ-9.2 (изготовитель установки - фирма "ФРИГЕРА", г. Колин, ЧССР).

Выполнение множественных сквозных отверстий в заготовке, по ее толщине, в процессе изготовления аллотрансплантата дает возможность при клиническом применении интенсифицировать процесс его замещения новообразованной костной тканью, при котором эти отверстия быстро заполняются соединительной тканью, постепенно трансформируемой в хрящевую ткань, чья резорбция сопровождается заполнением отверстий трабекулярной костью, костным мозгом. Таким образом, отверстия в деминерализованном трансплантате дополнительно стимулируют остеогенез, являясь множественными локализованными его центрами.

Предложенный размер сквозных отверстий 0,6-0,8 мм является, как показали результаты исследований, оптимальным с точки зрения интенсивности замещения трансплантата новообразованной костной тканью, при этом плотность равномерно распределенных отверстий, составляющая 1-1,5 отверстия на кв.см поверхности заготовки, обеспечивает, при повышении активности остеогенеза, механическую прочность трансплантата.

Предложенная деминерализация заготовки в (0,7-1,1) н. растворе соляной кислоты в течение 2-3 суток при температуре 18-20oС позволяет, при наличии в заготовке множественных отверстий, обеспечить активность процесса деминерализации костной ткани, дает возможность более надежно контролировать этот процесс и снизить при этом расход кислоты на деминерализацию.

В отношении стерилизации заготовки в данном изобретении путем ее облучения пучком ускоренных электронов необходимо отметить, что такое решение позволяет надежно уничтожать бактерии, споры и вирусы, сохраняя костный морфогенетический белок в активном состоянии, причем процесс стерилизации ускоренными электронами по сравнению со стерилизацией формалином в способе-прототипе характеризуется быстротой (16-20 сек), простотой, низкой трудоемкостью, экологичностью. Для стерилизации могут быть использованы, например, отечественные промышленные ускорители электронов: типа ЛУЭ-8-5М (изготовитель - Ленинградский завод им. Ефремова) или типа У003МВ (изготовитель - московский завод "Торий"), позволяющие создавать пучок электронов с энергией 8-9 МэВ, обеспечивая предельную мощность дозы облучения порядка 1-1,2 кГр/сек.

Необходимая для наиболее эффективной стерилизации доза облучения составляет, как показали опыты, 15-18 кГр при оптимальном (с точки зрения сохранения активности костного морфогенетического белка) времени облучения помещенной в упаковку заготовки - 16-20 сек.

Пример осуществления способа. Из полученного от донора фрагмента бедренной кости (кортикальная кость диафиза бедра) выпиливают заготовку длиной 25 см, шириной 2 см и толщиной 0,5 мм. Проводят ее механическую обработку путем удаления мягких тканей и миелоидно-жирового костного мозга. Помещают заготовку в 3%-ный раствор перекиси водорода на 1 час для удаления компонентов крови из компактного слоя.

Далее в заготовке сверлят множественные сквозные отверстия диаметром 0,8 мм (при этом на кв. см поверхности заготовки общей площадью 25х2 кв.см приходится одно отверстие), после чего заготовку на 54 часа помещают в 1,1 н. раствор соляной кислоты при 18oС. Степень деминерализации, контролируемая рентгенологическим и морфометрическим методами, составляет по окончании процесса 50%. Соляную кислоту отмывают из заготовки раствором тиосульфата натрия, троекратно погружая ее в раствор на 35 мин.

Затем заготовку замораживают в течение 24 часов в холодильной камере при температуре минус 70oС. После этого заготовку помещают в сушильную камеру сублимационной установки типа LZ-9.2 (позволяющей, следует заметить, одновременно лиофилизировать 30-40 заготовок аллотрансплантата) на охлаждаемую полку-пластину, вакуумируют камеру (создают в ней разрежение), выдерживают заготовку 3-е суток при температуре минус 35oС. Затем в течение 7 часов, поддерживая в камере разрежение и нагревая полку с использованием регулируемого электронагрева, постепенно увеличивают температуру сушки до 40oС, сохраняя такую температуру в течение 28 часов до достижения конечной влажности костной ткани 5%.

После окончания сушки заготовку помещают в пластиковый герметичный пакет и облучают пучком ускоренных электронов в течение 18 сек результирующей дозой 16 кГр. Облучение проводится посредством двух ускорителей электронов типа ЛУЭ-8-5М. В таком виде аллотрансплантат готов к использованию в пластической операции и может храниться при температуре 18-20oС до 5 лет.

Перед клиническим использованием аллотрансплантат, после вскрытия упаковки, выдерживается в физиологическом растворе и/или растворе антибиотика в течение 15-20 мин, после чего приобретает необходимые для аллопластики упругие и пластические свойства.

Пример на клиническое использование.

Больная С. , 8 лет, и.б. N 439. Диагноз: неостеогенная фиброма верхней трети левой большой берцовой кости. Болеет около 10 месяцев, жалобы на периодические боли в верхней трети левой голени. На рентгенограмме обнаружен патологический очаг в верхней трети большой берцовой кости. Госпитализирована 24.02.98 в клинику ЦИТО. 03.03.98 под наркозом произведена операция: краевая резекция кости, удаление патологического очага, произведена аллопластика (с использованием трансплантатов, изготовленных в соответствии с заявленным изобретением) по типу "вязанки хворостом". Послеоперационный период протекал гладко. Рана зажила первичным натяжением. На 12-е сутки после операции сняты швы. Фиксация конечности осуществлялась 2 месяца гипсовой повязкой.

В динамическом наблюдении через 3 месяца была отмечена перестройка трансплантатов и регенерация в области дефекта. Через 9 месяцев на рентгенограммах отмечена полная органотипическая перестройка зоны дефекта, жалоб нет. В настоящее время С. живет обычной жизнью, без ограничений.

Аллотрансплантаты, изготовленные по предложенному способу, применены, в частности, в клинике детской костной патологии и подростковой ортопедии ЦИТО им. Н. Н. Приорова при оперировании 70 детей с опухолями, опухолеобразными поражениями и дисплазиями костей. При этом в зависимости от решаемой посредством костной пластики задачи были использованы трансплантаты из кортикальной кости длиной от 5 до 25 см, шириной от 1,5 до 2,5 см и толщиной от 0,4 до 0,6 мм. Ни в одном из случаев не было отмечено отторжение или нагноение трансплантатов, что свидетельствует о его высоких пластических свойствах.

Клиническая тактика подтверждает также и отмеченные выше качества аллотрансплантатов, изготовленных по заявленному способу: высокая остеоиндуктивная активность при пересадке и низкая антигенность.

Перечисленные выше качества, обеспечиваемые предложенным способом приготовления трансплантатов, позволяют в клинической практике сократить сроки лечения больных и резко снизить процент отторжения, что избавит пациентов от неоднократных оперативных вмешательств и психических травм. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ изготовления костного аллотрансплантата, включающий механическую обработку и промывку заготовки из костного материала, ее деминерализацию в растворе соляной кислоты, нейтрализацию остатков в ней соляной кислоты, стерилизацию, консервацию и герметизацию деминерализованной заготовки, отличающийся тем, что перед деминерализацией в заготовке выполняют множественные сквозные отверстия, консервацию деминерализованной заготовки проводят с помощью лиофильной сушки, а стерилизацию осуществляют после окончания лиофильной сушки путем облучения заготовки, помещенной в герметичную упаковку, пучком ускоренных электронов дозой 15 - 18 кГр в течение 16 - 20 с.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильная сушка заготовки включает замораживание ее в течение 22 - 26 ч до температуры в интервале от (-60) - (-80)oC, выдерживание заготовки в течение 3 - 5 сут при температуре в интервале от (-30) - (-40)oC и снижение влажности костного материала заготовки до 4 - 6% в течение 30 - 40 ч, при постепенном увеличении температуры сушки в течение первых 6 - 8 ч сушки до 35 - 40oC и сохранении этой температуры до окончания процесса сушки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что деминерализацию заготовки проводят в (0,7 - 1,1) н. растворе соляной кислоты при температуре 18 - 20oC в течение 2 - 3 сут.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в заготовке выполняют сквозные отверстия диаметром 0,6 - 0,8 мм при плотности их расположения на поверхности заготовки отверстия 1 - 1,5 см2.