СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОСИФИЛИСА

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОСИФИЛИСА


RU (11) 2230323 (13) C1

(51) 7 G01N33/50, G01N30/90 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.06.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003120839/15 
(22) Дата подачи заявки: 2003.07.07 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.07.07 
(45) Опубликовано: 2004.06.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2205409 C2, 27.05.2003.
RU 2141660 C1, 20.11.1999.
RU 2157536 C1, 10.11.2000.
RU 2200327 C2, 10.03.2003.
RU 2021613 C1, 15.10.1994.
RU 2021209 C1, 15.10.1994.
RU 2210771 C1, 20.08.2003. 
(72) Имя изобретателя: Яковлев Н.А. (RU); Дубенский В.В. (RU); Слюсарь Т.А. (RU); Редько Р.В. (RU); Гутянский О.Г. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тверская государственная медицинская академия"(RU) 
(98) Адрес для переписки: 170642, г.Тверь, ул. Советская, 4, ТГМА, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОСИФИЛИСА 

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и дерматологии. Определяют количество сфингомиелина в ликворе больных с помощью проточной тонкослойной хроматографии. При уровне сфингомиелина в количестве от 3,0 до 3,7 мг% диагностируют не осложненный сифилис. При уровне сфингомиелина в количестве от 8,7 до 11,1 мг% - нейросифилис. Данный способ обладает качественно новым подходом и высокой эффективностью. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии и дерматовенерологии.

Нейросифилис - общее название разнообразных клинических форм поражения нервной системы сифилитической этиологии, характеризующихся склонностью к прогрессированию при отсутствии адекватного лечения. Термин "нейросифилис" включает широкий спектр поражений ЦНС, которые по мере прогрессирования заболевания постепенно трансформируются один в другой. Изменения нервной системы встречаются у 25-90% больных сифилисом. Диагностика нейросифилиса нередко представляет сложную задачу, установление правильного диагноза возможно лишь в 30-70% случаев. Это связано с тем, что выявление характерных для нейросифилиса неврологических симптомов и синдромов в настоящее время затруднено тем, что структура сифилитических поражений нервной системы изменилась в сторону преобладания стертых и скрытых форм с незначительно выраженной или отсутствующей неврологической симптоматикой. С другой стороны, обнаружение у больных сифилисом тех или иных неврологических нарушений не может служить основанием для диагностики нейросифилиса, поскольку эти нарушения нередко являются следствием различных заболеваний и поражений нервной системы несифилитической природы. Поэтому основную роль в диагностике нейросифилиса играет лабораторное исследование сыворотки крови и спинномозговой жидкости. Исследование сыворотки крови больных (серологическое исследование) проводится с использованием нетрепонемных (реакция Вассермана, микрореакции преципитации с кардиолипиновым антигеном) и более чувствительных и специфических трепонемных тестов (реакция иммунофлуоресценции - РИФ, реакция иммобилизации трепонем - РИТ). Однако при диагностике нейросифилиса следует учитывать, что серологические реакции на сифилис могут быть ложноположительными при наличии многих других заболеваний несифилитической природы. Так, ложноположительные нетрепонемные и трепонемные тесты могут отмечаться у больных ВИЧ-инфекцией/СПИДом, а ложноположительная реакция Вассермана выявляется при исследовании сыворотки крови у 10% лиц пожилого возраста. Поэтому основным подтверждающим методом диагностики нейросифилиса в настоящее время является лабораторное исследование спинномозговой жидкости больных с помощью нетрепонемных и трепонемных тестов.

Аналогом заявленного способа авторы предлагают способ диагностики нейросифилиса с помощью лабораторного исследования ликвора реакцией связывания комплемента с трепонемным и кардиолипиновыми антигенами (реакция Вассермана) (Овчинников Н.М., Беднова В.Н., Делекторский В.В. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем. - М.: Медицина, 1987, с. 39-166). Однако реакция Вассермана у трети больных бывает отрицательной и поэтому не исключает нейросифилис. Кроме того, при исследовании ликвора с примесью крови возможна ложноположительная реакция Вассермана.

По мнению авторов, прототипом заявляемого способа диагностики нейросифилиса является способ ликвородиагностики с помощью иммуноферментного анализа - ИФА (Дмитриев Г.А., Беднова В.Н., Тимченко Г.Ф. и др. Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис. Методические указания. - М., 2001, 41 с.). Способ основан на том, что на твердофазном носителе (лунки полистеролового планшета) фиксируется антиген возбудителя сифилиса, который инкубируется со спинномозговой жидкостью. При наличии в исследуемом ликворе противотрепонемных антител происходит их связывание в комплекс “антиген-антитело” (фаза I реакции). После удаления не связавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с меченными ферментом антителами и к активированным иммуноглобулинам (конъюгат), в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам “антиген-антитело” антител, меченных ферментом (фаза II). После удаления не связавшегося конъюгата в ходе инкубации происходит взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных сывороточных антител (фаза III). Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых данных или визуально.

Однако иммуноферментный способ ликвородиагностики технически сложен, дорогостоящ и поэтому доступен немногим лабораториям. Для применения этого способа необходимы специальные тест-системы, большинство из которых не адаптированы к исследованию спинномозговой жидкости.

Авторы предлагают собственный способ диагностики нейросифилиса с помощью исследования содержания сфингомиелина в ликворе больных методом проточной тонкослойной хроматографии на слоях силикагеля в системе хлороформ-метанол-аммиак.

Способ осуществляется следующим образом. Спинномозговую жидкость больных в количестве 0,4 мл смешивают с хлороформ-метанолом в соотношении 1:2, фильтруют в пробирки, осадок на фильтре трижды промывают смесью "хлороформ-метанол" (2:1), содержащей 0,5% НСl по объему. К фильтрату добавляют 2-3 мл 0,02% раствора хлористого кальция до образования двух фаз: хлороформной и водно-метаноловой, затем 1-2 минуты встряхивают и добавляют 2 мл хлороформа. После четкого расслоения верхнюю фазу отсасывают, оставшиеся в ней липиды экстрагируют 2 мл хлороформа, экстракт промывают смесью хлороформ-метанол-0,02% хлорида кальция (3:48:47), выпаривают досуха в токе азота и растворяют в 20-25 мкл смеси хлороформ-метанол (2:1). Нанесенный методом осаждения слой адсорбента высушивают на воздухе, 15 минут активизируют в сушильном шкафу при температуре 120С и разделяют на 12-15 полос шириной 4-5 мм каждая. При таких условиях распределение анализируемого вещества происходит только по ходу растворителя, исключая возможность продольной сорбции. Исследуемый липидный материал в количестве 10-14 мкг наносят на пластинку, помещенную в плоскую стеклянную камеру для проточной хроматографии. Время хроматографирования фосфолипидов в системе хлороформ-метанол-аммиак (13:7:1) составляет 60 минут. В результате хроматографирования исследуемая фракция сфингомиелина четко отделяется от расположенных рядом фосфатидилсерина и фосфатидилхолина. После хроматографирования пластинку в течение 30 минут проявляют над раствором хромовой смеси при 200°С, затем денситометрируют (сканирующий денситометр CS-9000 “Shimadzu”). По данным денситометрии строится калибровочная кривая с использованием стандартного препарата фосфатидилинозитов фирмы "Sigma" (США), который наносится на отдельные полосы силикагеля так, чтобы концентрация липидного фосфора составляла 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 мкг соответственно. Идентификацию фосфолипидных фракций проводят с помощью стандартных цветных тестов фирмы" Sigma" в диапазоне концентраций от 0,2 до 8,0 мкг. При этом возможно в стандартных условиях анализировать на каждой пластинке одновременно до 15 проб.

Нами обследовано 50 больных с различными формами сифилиса (сифилис вторичный кожи и слизистых оболочек, сифилис ранний скрытый, серорезистентный сифилис), которым после консультации невролога было рекомендовано проведение люмбальной пункции. При исследовании спинномозговой жидкости методом горизонтальной тонкослойной проточной хроматографии установлено, что содержание сфингомиелина в ликворе у 30 больных (23 мужчины и 7 женщин в возрасте 24-40 лет) находится в пределах 8,7-11,1 мг%, а у 20 больных - в пределах 3,0-3,7 мг%. Больным первой группы был выставлен диагноз нейросифилиса (менинговаскулярная форма - у 16 человек, асимптомный нейросифилис - у 11, базальный сифилитический менингит - у 3), который подтвержден другими лабораторными исследованиями ликвора: положительная реакция Вассермана и реакция иммунофлюоресценции (РИФ). У больных второй группы исследование ликвора указали на отрицательные реакции Вассермана и иммунофлюоресценции (РИФ).

Таким образом, данный способ обладает качественно новым подходом и высокой эффективностью, так как повышение уровня сфингомиелина в ликворе больных в 2,5-3,5 раза может служить лабораторным диагностическим критерием развития сифилитического поражения нервной системы у больных с сифилисом.

Клинический пример

Больной М., 38 лет, поступил в неврологическое отделение для обследования с диагнозом: Дисциркуляторная энцефалопатия неясной этиологии. При поступлении жалобы на головные боли, усиливающиеся при умственном напряжении, частые головокружения при ходьбе, легкую слабость в правой руке, плохой сон. Год назад отмечался эпизод слабости в правых конечностях, больше в руке при нормальном артериальном давлении.

При осмотре состояние удовлетворительное. Патологии внутренних органов не выявлено. АД 120/75 мм рт.ст. Пульс 72 в минуту. В неврологическом статусе: сознание ясное, менингеальные симптомы не выражены. Зрачки округлой формы, неравномерны (Д>S), реакция на свет вялая, на аккомодацию резко снижена, на конвергенцию сохранена. Отмечаются легкая амимия и асимметрия носогубных складок. Движения конечностей в полном объеме, легкое повышение мышечного тонуса в правой верхней конечности. При исследовании болевой чувствительности отмечается гемигипестезия в правых конечностях, больше в руке. Суставно-мышечное, вибрационное и стереогностическое чувства не расстроены. Рефлексы со слизистых оболочек сохранены; периостальные - нижнечелюстной повышен, с верхних и нижних конечностей понижены, неравномерные (Д>S), брюшные также неравномерны (S>Д). Отмечаются патологические рефлексы: хоботковый, Маринеско-Радовичи, непостоянный симптом Россолимо справа. Статическая и кинетическая координация не нарушена. Шкала MMSE - легкие когнитивные нарушения.

Учитывая жалобы больного и выявленную неврологическую симптоматику, включая патологию зрачков и зрачковых реакций, больному рекомендовано проведение люмбальной пункции.

Спинномозговая жидкость: увеличение белка (0,66 г/л), лимфоцитарный плеоцитоз 28 клеток в 1 мм. Содержание сфингомиелина 9,6 мг%. Больному был диагностирован менинговаскулярный сифилис. В последующем получены результаты подтверждающих тестов: реакция Вассермана и иммунофлюоресценции (РИФ) в ликворе положительные (4+). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Способ диагностики нейросифилиса, включающий исследование ликвора, отличающийся тем, что определяют количество сфингомиелина в ликворе больных с помощью проточной тонкослойной хроматографии и при уровне сфингомиелина в количестве 3,0-3,7 мг% диагностируют неосложненный сифилис, а при уровне сфингомиелина в количестве 8,7-11,1 мг% - нейросифилис.