ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТНОЙ И/ИЛИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТНОЙ И/ИЛИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2295980 (13) C1

(51) МПК
A61L 27/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 27.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.03.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005127972/15 
(22) Дата подачи заявки: 2005.09.08 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.09.08 
(45) Опубликовано: 2007.03.27 
(56) Аналоги изобретения: US 6596274 А, 22.07.2003. ЕР 0339607 A2, 02.11.1989. WO 0182773 А2, 08.11.2001. DE 3775363 D, 30.01.1992. RU 2001119843 А, 27.07.2003. RU 2000109319 А, 20.02.2003. RU 2214197 C2, 20.10.2003. RU 2242980 С1, 27.12.2004. 
(72) Имя изобретателя: Назаренко Григорий Федорович (RU); Земчихина Валентина Николаевна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Назаренко Григорий Федорович (RU) 
(98) Адрес для переписки: 141120, Московская обл., г. Фрязино, ул. Полевая, 2, кв.130, Г.Ф. Назаренко 

(54) ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТНОЙ И/ИЛИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к имплантату аутологичного происхождения, а также и способу его получения, и может быть использовано в ревматологии, травматологии, ортопедии, стоматологии и косметологии. Имплантат представляет собой остеоциты и/или хондроциты в питательной среде, при этом остеоциты и/или хондроциты получают из фибробластов аутологичного костного мозга путем культивирования на питательной среде, включающей сыворотку крови телят, коллаген и ростовые факторы, и, необязательно, мукополисахариды, при этом содержание остеоцитов и/или хондроцитов в имплантате составляет от 100000 до 100 млн клеток в 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов. Способ получения имплантата заключается в том, что костный мозг пациента гомогенизируют, центрифугируют, осадок, содержащий стромальные фибробласты, культивируют на специальной питательной среде, при этом для специализации фибробластов в сторону остеоцитов фибробласты преимущественно культивируют на питательной среде, содержащей сыворотку крови телят, коллаген типа I и типа II, фактор роста фибробластов; для специализации фибробластов преимущественно в сторону хондроцитов фибробласты культивируют на питательной среде, в которой содержится: сыворотка, коллаген типа I и типа II, а также мукополисахариды и инсулиноподобный фактор роста или гормон соматомедин, культивирование проводят до накопления в питательной среде от 100000 до 1000 млн клеток, затем добавляют по 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов. Имплантат обладает биологической совместимостью, обеспечивает повышение комфортности пациентов, противовоспалительный эффект, быстро и прочно срастается с аутогенной тканью, особенно с костью, проявляет высокую восприимчивость организмом пациента, имплантат обеспечивает минимальные сроки интеграции, оптимальное течение остеохондрогенеза в некротизированных костях и дегенеративно измененных хрящах. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к способу получения аутотрансплантата для восстановления костной и хрящевой ткани, и может быть использовано в ревматологии, травматологии, ортопедии, стоматологии и косметологии.

Только в США приблизительно 1,3 миллиона хирургических операций приходится на костную имплантацию, костное замещение или другие реконструктивные операции. Известно большое количество материалов, используемых в качестве имплантата или заменителя костного вещества. Имплантационным материалом служит костная мука (SU 1696818, RU 2189823), деминерализованная кость, коллаген и фибробласты (US 4485097), коллаген и неколлагеновые белки, полисахариды, аминокислоты (US 5866165, RU 97116345, RU 95117043), плацентарная, костная ткань плода, метилцеллюлоза и прополис (RU 21106781), эмбриональные хондроциты или клетки зародышевой соединительной ткани (DE 3410631), также гомополимеры и сополимеры полигликолевой и полимолочной кислот, сополимеры гликолида и лактида (WO 99/19005), глютаровый альдегид (FR 2582517) и другие материалы, включающие натуральные и синтетические полимеры. Другим классом приемлемых материалов, приемлемых в качестве имплантатов, являются керамические имплантаты, такие как гидроксиапатит или трикальций фосфат или тетракальций фосфат (RU 2062622 C1, DE 3727606, FR 2585576).

Впрочем, использование различных натуральных и синтетических минералов, полимеров и композитов, не дает тех результатов, которые были достигнуты с использованием аутогенных материалов. Примерно 90% проводимых операций относятся к аутотрасплантации, поскольку аллопротезирование и ксенопротезирование влечет за собой риск патогенной контаминации и сопровождается длительным периодом подавления иммунитета. Понятно, что доступность и наличие аутотранспантатов ограничены. Основные ограничения такой технологии заключаются во взятии материала у самого пациента, сохранении его в физиологической среде, необходимость дополнительного процесса заживления в месте извлечения материала. В принципе, это относится и к гомологичным аллотрансплантатам, т.е. трансплантатам доноров того же биологического вида, в этих случаях возникает еще и проблема иммунологической совместимости и заражение вирусами. Последние достижения в области клеточной молекулярной биологии, биотехнологии биоматериалов привели к развитию тканевой инженерии, позволяющей конструировать ткани с использованием живых клеток, разрабатывать способы восстановления функционально активных тканей как in vitro, так и in vivo (US 6398816, WO 01/82773). В настоящее время известен ряд попыток, основанных на включении изолированных клеток биопсийного происхождения, используемых как основа для создания имплантата. Хрящевые клетки (хондроциты) и кость формирующие клетки (остеобласты) продолжают развиваться, объединяясь с существующей структурой кости или хряща пациента после введения, так что после определенного периода времени имплантируемая структура становится полностью неотличима от окружающей ткани.

Известно, что клетки хрящевой ткани и кости, сухожилий и связок и волокнистой соединительной ткани радикально отличаются по характеру. В статье Alberts et al., Molecullar Biology of the cell., 2 Ed, 1989, p.987-988 сообщается, что препараты из костного матрикса могут быть имплантированы в дермальный слой кожи, при этом они трансформируются в клетки хряща и другие клетки костной ткани. Патент US 57000289 описывает применение клеток надкостницы, которые индуцируют большее количество клеток кости, чем клетки мышечной ткани. Патент US 2003/0077825 A1 демонстрирует возможность использования в качестве костновостанавливающего устройства фибробластов дермального, гингивального или периодонтального происхождения, взятых у самого пациента, выращенные в условиях роста клеток, при которых посеянные клетки дифференцируются в клетки остеогенного типа и затем включаются в структуру природного или синтетического гироксиапатита или неорганического костного минерала. Патент ЕР 0339607 раскрывает композицию для регенерации суставного хряща и кости путем имплантации клеток хондроцитов или остеобластов, полученных из костного мозга аутологичного или гомологичного происхождения или гомологов, включающих хондроциты или аутологичные или гомологичные фибробласты, полученных хондроцитов или каких-либо других прогенитальных клеток мезенхимального происхождения, которые помещаются в биоразлагаемый, биосовместимый, иммобилизирующий носитель. Часть имплантата может включать сегмент кости или заменитель кости.

Патент США 6596274, который нами взят в качестве наиболее близкого аналога, описывает биологический материал, состоящий из двух компонентов: (1) культуры аутологичных или гомологичных стволовых клеток костного мозга частично или полностью дифференцированных в клеточные линии специфической соединительной ткани или (2) экстрацеллюларной матрицы, свободной от других клеточных компонентов, секретируемой специфической соединительной тканью и второй компонент - это самостоятельная биоприемлемая и биодеградируемая матрица, содержащая эфиры гиалуроновой кислоты. Специфическая клеточная линия выбрана из фибробластов, остеобластов, миобластов, адипоцитов, хондроцитов и эндотелиальных клеток. Этот материал был предварительно посеян в кератиноциты до формирования имплантата клеточных элементов. Клетки культивируются в подходящей среде и в дальнейшем эти клетки могут быть использованы немедленно либо сохранены в течение от 3 лет и более, в зависимости от степени криоконсервации, а затем уже вносятся в носитель. Гель помещается вместе с выращенными клетками в костный дефект. Имплантируемый материал подходит для использования при кожных повреждениях и для восстановления повреждений соединительной ткани. Однако описанный имплантационный материал не обладает достаточной высокой биологической активностью для восстановления опорно-двигательного аппарата, не может считаться благоприятным для процесса заживления, поскольку способы его получения являются унифицированными для аутогенных и гомологичных клеток костного мозга и не учитывают специфики их дифференцировки. К ограничивающим условиям относится и то, что в качестве матрицы используются эфиры гиалуроновой кислоты, предполагающие длительное в результате ее деградации высвобождение активных компонентов и необходимость моделирования различных форм имплантата.

Анализ предшествующего уровня техники показал, что ни одно из известных технических решений не обеспечивает достаточного восстановления ткани кости, мышцы, хряща и сухожилий пациента с использованием только аутологичных клеток костного мозга самого пациента, позволяющего полностью исключить риск антигенности пересаживаемой ткани и патогенной трансформации.

Таким образом, целью изобретения явилась разработка способа получения имплантата для восстановления костной и хрящевой ткани, включающего исследование и выбор специальных условий и режимов культивирования, продиктованных спецификой клеток костного мозга, особенно пожилых больных, для формирования в сторону остеоцитов и хондроцитов при сохранении высокой активности и абсолютной иммунной инертности.

Другой целью изобретения является создание имплантата, обладающего более высокой восприимчивостью организмом пациента, минимальными сроками интеграции по сравнению с известным уровнем техники. Иными словами целью изобретения явилось создание такого имплантата, который обеспечивает оптимальное течение остеохондрогенеза в некротизированных костях и дегенеративно измененных хрящах, обеспечивая противовоспалительный эффект, биологическую совместимость и повышение комфортности пациентов. Применительно к имплантату это означает, что он быстро и прочно должен срастаться с аутогенной тканью, особенно с костью.

В результате большого объема экспериментальных работ, посвященных культивированию стромальных фибробластов костного мозга пациента, нуждающегося в лечении, нами удивительным образом обнаружено, что стромальные фибробласты костного мозга, и особенно пожилых людей, требуют специфических условий их культивирования, предполагающих особенности состава и концентраций питательного раствора, режимов культивирования, и определенную последовательность их этапов. Проведенные исследования позволили подобрать оптимальные условия для выращивания клеток фибробластов, установить те комбинации биологически активных веществ, которые позволяют клеткам пациентов, в том числе и пожилого возраста, активно размножаться до нужного количества. Установлено, что достижение лечебного эффекта возможно уже начиная с 100000 и до 100 млн клеток. Решающим моментом для соблюдения настоящих условий является то, что имплантат согласно изобретению после специализации фибробластов в сторону остеоцитов или хондроцитов сохраняется и вводится в место поражения вместе со специальной питательной средой, соответствующей условиям культивирования фиброобластов для получения остеоцитов или хондроцитов. Впервые выявлено, что полученная комбинация специализированных фибробластов в сочетании со специальной питательной средой обеспечивает при введении пациенту рост и дальнейшую дифференцировку необходимых клеток и тканей, в том числе, в пожилом, ишемизированном органе.

Таким образом, одним аспектом изобретения является имплантат для восстановления костной и/или хрящевой ткани, который представляет собой остеоциты и/или хондроциты в питательной среде, при этом остеоциты и/или хондроциты получают из фибробластов аутологичного костного мозга путем культивирования на питательной среде, включающей сыворотку крови телят, коллаген и ростовые факторы, и, необязательно, мукополисахариды, при этом содержание остеоцитов и/или хондроцитов в имплантате составляет от 100000 до 100 млн клеток в 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов.

При этом имплантат предназначен для введения в полость сустава кость, сухожилие, мышцу или фасцию.

Другим аспектом изобретения является способ получения имплантата для восстановления костной и/или хрящевой ткани, который заключается в том, что костный мозг пациента гомогенизируют, затем центрифугируют, осадок, содержащий стромальные фибробласты, культивируют на питательной среде, при этом для специализации фибробластов в сторону остеоцитов фибробласты преимущественно культивируют на питательной среде, содержащей в 1 мл сыворотку крови телят в количестве от 42,5 до 85 мг, коллаген типа I в концентрации 100-350 мкг/мл, коллаген типа II в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл, фактор роста фибробластов (FGF) в концентрации от 0,1 до 0,9 мкг/мл; для специализации фибробластов преимущественно в сторону хондроцитов фибробласты культивируют на питательной среде, в 1 мл которой содержится от 42,5 мг до 85 мг сыворотки, коллаген типа I и типа II в концентрации от 1 до 10 мкг/мл каждого, а также мукополисахариды в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл каждого и инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) или гормон соматомедин в концентрации от 1,0 до 10,0 мкг/мл, культивирование проводят до накопления в питательной среде от 100000 до 100 млн остеоцитов и/или хондроцитов, затем добавляют по 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов.

При этом способ может обеспечивать накопление остеоцитов до 50 млн в 2 мл питательной среды, а хондроцитов до 50 млн в 5 мл питательной среды.

При этом сыворотка представляет собой сухой стандартный депротеинизированный гомогенат из крови телят.

В исследование было включено 40 пациентов, страдающих различными ревматологическим заболеваниями, осложнившимися аваскуляторным (асептическим некрозом) головок тазобедренных костей и коленных суставов. В контрольную группу входило 20 человек, 8 из которых с ревматоидным артритом, 2 - с системной красной волчанкой и 10 с остеоартрозом. Вторая группа больных, прошедших лечение согласно данному изобретению, состояла также из 20 человек: 8 пациентов, страдающих ревматоидным артритом, двое - системной красной волчанкой и 10 человек остеоартрозом в возрасте от 16 до 78 лет. Продолжительность заболевания составляла от 2 до 15 лет. Общепринятое лечение - стероиды, сосудистая терапия, лазерное поражение суставов, ЛФК больным контрольной группы проводилось в условиях хирургического отделения института ревматологии РАМН. У больных, прошедших курс лечения согласно заявленному изобретению, после установления диагноза в амбулаторных условиях была произведена пункция крыла левой подвздошной кости и взято от 2 до 6 мл костного мозга. Затем стромальные фибробласты костного мозга пациента культивировали так, как это изложено в способе предложенного изобретения, получали имплантант для восстановления костной и/или хрящевой ткани, который содержит от 100000 до 100 млн клеток в 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов. Последний помещали в стерильные одноразовые шприцы, или их объединяли и помещали в стерильный одноразовый шприц для введения в полость сустава, кость, сухожилие, мышцу или фасцию. Состояние больных оценивалось до и после лечения и спустя 6 месяцев. По визуальной аналоговой шкале определяли интенсивность боли в покое, амплитуду движений определяли с помощью гониометра. После проведенного лечения состояние больных улучшилось как в контрольной группе, так и в группе, прошедших имплантацию заявленным средством. В группе больных, подвергнутых клеточной терапии имплантатом болевой синдром снизился на 73%, тогда как в контрольной группе на 61%, и достоверно улучшились показатели гониометрии на 49% в группе, подвергнутых клеточной терапии и на 19,7% - в контрольной. Однако спустя 6 месяцев после лечения у 18 больных контрольной группы все симптомы асептического некроза вернулись к исходным показателям. Двое больных сделали операцию по эндопротезированию суставов. В группе больных, прошедших терапию заявленным имплантатом, спустя 6 месяцев после лечения у 19 больных болевой синдром продолжал уменьшаться, и продолжала увеличиваться амплитуда движений в пораженных суставах. У 1 больного ревматоидным артритом возникли симптомы коксита, после обследования была обнаружена инфекция мочеполовых путей. После назначения антибиотиков состояние улучшилось.

Проведенные исследования показали, что созданный согласно изобретению имплантат обеспечивает эффективность лечения за счет оптимального течения репаративного остеохондрогенеза в некротизированных костных структурах, дегенеративно-измененных хрящах, поврежденных сухожилиях и мышцах.

Эффективность лечения, предопределенная биологической совместимостью имплантата, обеспечивалась также простотой его введения при сохранении высокой активности и абсолютной иммунной инертности.

Имплантат у всех 20 пациентов разных возрастных групп проявил минимальные сроки интеграции, высокую восприимчивость организмом пациентов, противовоспалительный эффект, быстро и прочно срастался с аутогенной тканью, особенно с костью, и тем самым способствовал повышению комфортности пациентов.

Изобретение далее поясняется в предпочтительных вариантах конкретного выполнения, при этом приводимые примеры культивирования стромальных фибробластов пациентов для последующей их аутотрансплантации в пораженные кости, суставы, мышцы, сухожилия, и способа получения имплантатов не должны стать основанием для ограничения притязаний, а предназначены исключительно лишь для демонстрации осуществимости изобретения и реализации указанных назначений.

Пример 1

После пункции пораженной асептическим некрозом кости, у пациента производят забор его костного мозга в количестве от 2 до 6 мл. Затем к костному мозгу добавляют 15 мл охлажденного (+4°С) стерильного физиологического раствора. Одновременно шприцом через иглу 0,8×38 производят гомогенизацию. Полученный гомогенат переносят в стерильные центрифужные пробирки, содержащие примерно 5-кратный объем охлажденного (+4°С) стерильного физиологического раствора. Суспензию клеток центрифугируют в течение 5 мин при 1000 оборотах в мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок, содержащий стромальные фибробласты, ресуспендируют питательной средой Игла с обычными добавками по 1 мл в каждой пробирке. Клетки в количестве 2500-10000 делят на части для дальнейшей их специализации.

Одну часть клеток в количестве примерно от 1250 до 5000 сеют в чашки Петри для специализации фибробластов преимущественно в сторону остеоцитов. При этом фибробласты культивируют на питательной среде, содержащей в 1 мл сыворотку крови телят в количестве от 42,5 до 85 мг, коллаген типа I массой 25000-50000 дальтон в концентрации 100-350 мкг/мл, коллаген типа II мол массой 25000-50000 дальтон в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл, фактор роста фибробластов (FGF) в концентрации от 0,1 до 0,9 мкг/мл.

Часть клеток в количестве примерно от 1250 до 5000 сеют в чашки Петри для специализации фибробластов преимущественно в сторону хондроцитов. Для этого фибробласты культивируют на питательной среде, в 1 мл которой содержится от 42,5 мг до 85 мг сыворотки, коллаген типа I и типа II мол мол. массой 25000-50000 дальтон в концентрации от 1 до 10 мкг/мл каждого, а также мукополисахариды, предпочтительно хондроитин-4 сульфат и хондроитин-6 сульфат, в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл каждого и ростовой фактор, предпочтительно, инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) или гормон соматомедин в концентрации от 1,0 до 10,0 мкг/мл.

Культивирование проводят до накопления в питательной среде от 100000 до 100 млн специализированных клеток в обычных условиях, т.е. ламинарных шкафах, примерно при температуре 37°С в атмосфере 5% CO2 . Приблизительно на 21 и 35 день культивирования клетки в каждой части монослойной культуры фибробластов промывают буферным раствором с нейтральным рН, предпочтительно фосфатным. После последней диссоциации клеток их суспензируют в питательной среде и помещают в стерильные центрифужные пробирки, затем отделяют надосадочную жидкость (возможно центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин). Надосадочную жидкость сливают, а к осадку, содержащему клетки, добавляют по 2-5 мл специальной питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов. Приготовленные имплантаты помещают в стерильные одноразовые шприцы, или их объединяют и помещают в стерильный одноразовый шприц.

Пример 2

Больная Шмидт Т.М. 65 лет, с 2000 г. страдает болями в области правого тазобедренного сустава. В январе 2004 г. была госпитализирована в хирургическое отделение института ревматологии РАМН, где ей был выставлен диагноз: артроз тазобедренных суставов ст.III-IV, асептический некроз головки правой бедренной кости. Рекомендована операция - эндопротезирование сустава.

В амбулаторных условиях ей была произведена под новокаиновым обезболиванием чрезвертельная пункция правой бедренной кости. Игла была введена по направлению к центру головки, на глубину до 5 см. Затем был взят костный мозг в количестве 4 мл, в течение 32 дней производилось культивирование ее стромальных фибробластов по вышеуказанной методике до 100 млн. Затем 50 млн фибробластов, прошедших специализацию в сторону остеоцитов, вместе с 2 мл специального питательного раствора были введены черзвертельно в шейку правой бедренной кости. 50 млн фибробластов, прошедших специализацию в сторону хондроцитов, вместе с 5 мл специальной питательной среды введено в под контролем УЗИ в центр суставной полости правого тазобедренного сустава, с последующими пассивно-активными движениями в этом суставе.

В результате проведенной клеточной терапии специализированными фибробластами пораженного сустава и кости у больной спустя 14 дней после аутотрансплантации стали значительно улучшаться функциональные тесты и снижаться болевой синдром. Так, боль при движении с 10 см (по ВАШ) уменьшилась до 5 см, а спустя один месяц, полностью исчезла. Функция правого тазобедренного сустава (по Харрису) до лечения составляла 41 балл, через 14 дней - 64, спустя месяц 73 балла. И что самое примечательное, в суставе появилась наружная ротация (0-10-25 градусов), чего в принципе не бывает при такой патологии.

Пример 3

Больная Можаева В.В. 35 лет, предъявляла жалобы на сильные боли и хромоту в области правого тазобедренного сустава. Считает себя больной с 1998 г., когда без видимых причин появились боли в правой паховой области. В феврале 2004 г. была госпитализирована в институт ревматологии РАМН, где ее был выставлен диагноз: диспластический артроз тазобедренных суставов ст.III-IV, асептический некроз головки правой бедренной кости. Правосторонний трохантерит. После чего ее была рекомендована операция по замене сустава на эндопротез.

В амбулаторных условиях ей была произведена, под новокаиновым обезболиванием чрезвертельная пункция правой бедренной кости. Игла была введена по направлению к центру головки, на глубину до 5 см. Затем был взят костный мозг в количестве 3 мл в течение 17 дней производилось культивирование ее стромальных фибробластов по вышеуказанной методике до 100 млн. Затем 50 млн клеток прошедших специализацию в сторону остеоцитов, вместе с 2 мл специальной питательной среды были введены черзвертельно в шейку правой бедренной кости. 50 млн клеток прошедших специализацию в сторону хондроцитов, вместе с 5 мл специальной питательной среды введено в под контролем УЗИ в центр суставной полости правого тазобедренного сустава, с последующими пассивно-активными движениями в этом суставе. А 500000 клеток, прошедших специализацию в сторону хондроцитов, были вместе с 5 мл питательной среды введены в область прикрепления сухожилия широчайшей фасции правого бедра к большому вертелу.

В результате проведенной клеточной терапии специализированными фибробластами пораженного сустава и кости у больной спустя 14 дней после аутотрансплантации стали значительно улучшаться функциональные тесты и снижаться болевой синдром. Так боль при движении с 9 см (по ВАШ) уменьшилась до 3 см, а спустя один месяц периодически возникала с силой 2-3 см. Функция правого тазобедренного сустава (по Харрису) до лечения составляла 26 баллов, спустя 14 дней - 65, через месяц 75 баллов. Наружная ротация увеличилась с 15 до 20 градусов. Исчезли признаки правостороннего трохантерита и симптомы воспаления сухожилия широчайшей фасции бедра.

Пример 4

Больная Дубровина М.М. 66 лет, предъявляла жалобы на сильные боли в коленных суставах, больше слева, невозможность ходьбы на длительное расстояние. В феврале 2004 г. была госпитализирована в институт ревматологии РАМН, где ей был выставлен диагноз: артроз коленных суставов ст. III-IV, асептический некроз левого коленного сустава, тендинит и миозит дистального отдела портняжной мышцы слева, по деструктивному типу. Была рекомендована операция по замене сустава на эндопротез.

В амбулаторных условиях ей была произведена, под новокаиновым обезболиванием, пункция метафиза левой большеберцовой кости на глубину до 4 см и взят костный мозг в объеме 4 мл. В течение 26 дней производилось культивирование ее стромальных фибробластов по вышеуказанной методике до 100 млн. Затем 50 млн клеток прошедших специализацию в сторону остеоцитов, вместе с 4 мл специальной питательной среды были поочередно введены (по 2 мл+50 млн) в медиальные мыщелки левой бедренной и левой большеберцовой костей, где по данным ЯМР были обнаружены самые большие деструктивные изменения. 40 млн клеток прошедших, специализацию в сторону хондроцитов, вместе с 5 мл специальной питательной среды введено в полость левого коленного сустава, между медиальными и латеральными мыщелками бедренной и большеберцовой костей. 10 млн клеток, прошедших специализацию в сторону хондроцитов были введены по 5 мл в сухожилие и дистальный отдел портняжной мышцы слева соответственно.

Спустя 14 дней после аутотрансплантации у больной, страдающей избыточным весом (106 кг), стали значительно улучшаться функциональные тесты и снижаться болевой синдром. Боль при движении уменьшилась с 7 см (по ВАШ) до 4 см а через один месяц составляла 3 см. Функция в левом коленном суставе увеличилась с 25 до 43 баллов.

Пример 5.

Выписной эпикриз из истории болезни №3004C/2003 г. Больная Криштофова Инесса Сергеевна 74 года, находилась на обследовании и лечении в ортопедо-хирургическом отделении клиники института ревматологии РАМН c 06.10.03 по 24.10.2003 г. (18 койкодней) с диагнозом: Полиостеартроз, артроз плечевых суставов ст.1-2. Левосторонний плечелопаточный периартрит (тендинит подлопаточной и 2-главой мышц слева).

Поступила с жалобами на сильные боли в шейном, поясничном отделах позвоночника, плечевых суставах. Ограничена функция в левом плечевом суставе. Считает себя больной с 1986 г., когда впервые появились боли в шейном отделе позвоночника и левом плечевом суставе. Постепенно заболевание прогрессировало. Местно: при пальпации определяются болезненные точки в области остистых отростков позвоночника, плечевых суставов, длинной головки сухожилия 2-главой, подлопаточной и дельтовидной мышц слева.

Объем движений в них ограничен, больше в левом плечевом суставе.

УЗИ плечевых суставов: сужение суставных щелей в акромиально-ключичных суставах. Уменьшение толщины сухожилий 2-главой и подлопаточной мышцы слева. УЗИ - картина левостороннего тединита подостной и 2-главой мышц, дегенративно-дистрофические изменения в сухожилиях подлопаточной и 2-главой мышц.

Проводимая консервативная терапия эффекта не принесла. После выписки из стационара больной проводилась клеточная терапия собственными стволовыми клетками, по вышепредложенной схеме. Так, 50 млн клеток, специализированных в сторону хондроцитов, были использованы следующим образом. В область истонченного сухожилия подлопаточной мышцы слева было введено 25 млн клеток; в область сухожилия длинной головки 2-главой мышцы 25 млн клеток.

Спустя 6 месяцев после клеточной терапии больная отметила значительное улучшение самочувствия, на 75% уменьшился болевой синдром в левом плечевом суставе, на 80 градусов увеличилась амплитуда движения (сгибание) в нем.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Имплантат для восстановления костной и/или хрящевой ткани, характеризующийся тем, что он представляет собой остеоциты и/или хондроциты в питательной среде, при этом остеоциты и/или хондроциты получают из фибробластов аутологичного костного мозга путем культивирования на питательной среде, включающей сыворотку крови телят, коллаген и ростовые факторы, и, необязательно, мукополисахариды, при этом содержание остеоцитов и/или хондроцитов в имплантате составляет от 100000 до 100 млн клеток в 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов.

2. Имплантат по п.1 который предназначен для введения в полость сустава, кость, сухожилие, мышцу или фасцию.

3. Способ получения имплантата для восстановления костной и/или хрящевой ткани, характеризующийся тем, что костный мозг пациента гомогенизируют, затем центрифугируют, осадок, содержащий стромальные фибробласты, культивируют на питательной среде, при этом для специализации фибробластов в сторону остеоцитов фибробласты преимущественно культивируют на питательной среде, содержащей в 1 мл сыворотку крови телят в количестве от 42,5 до 85 мг, коллаген типа I в концентрации 100-350 мкг/мл, коллаген типа II в концентрации от 10 до 100 мкг/мл, фактор роста фибробластов (FGF) в концентрации от 0,1 до 0,9 мкг/мл, для специализации фибробластов преимущественно в сторону хондроцитов фибробласты культивируют на питательной среде, в 1 мл которой содержится от 42,5 до 85 мг сыворотки, коллаген типа I и типа II в концентрации от 1 до 10 мкг/мл каждого, а также мукополисахариды в концентрации от 10 до 100 мкг/мл каждого и инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) или гормон соматомедин в концентрации от 1,0 до 10,0 мкг/мл, культивирование проводят до накопления в питательной среде от 100000 до 100 млн клеток, затем добавляют по 2-5 мл питательной среды, соответствующей условиям культивирования фибробластов для получения остеоцитов или хондроцитов.

4. Способ по п.3, который обеспечивает накопление остеоцитов до 50 млн в 2 мл питательной среды.

5. Способ по п.3, который обеспечивает накопление хондроцитов до 50 млн в 5 мл питательной среды.

6. Способ по п.3, в котором сыворотка представляет собой сухой стандартный депротеинизированный гомогенат из крови телят.