СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ (ВАРИАНТЫ)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ (ВАРИАНТЫ)


RU (11) 2302427 (13) C2

(51) МПК
C07K 16/06 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
A61P 37/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2005115752/13 
(22) Дата подачи заявки: 2005.05.24 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2005.05.24 
(43) Дата публикации заявки: 2006.11.20 
(45) Опубликовано: 2007.07.10 
(56) Аналоги изобретения: ДОНЮШ Е.К. и др. Использование Габриглобина (внутривенный гаммаглобулин) в лечении детей с аутоиммунной тромбоцито-пенической пурпурой, Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2003, т.2, №1, с.87-90. RU 2122864 C1, 10.12.1998. 
(72) Имя изобретателя: Лютов Андрей Германович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Лютов Андрей Германович (RU); Решетник Вячеслав Викторович (RU) 
(98) Адрес для переписки: 107078, Москва, а/я 265, ООО "Прозоровский и партнеры" 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ И ПРЕПАРАТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ (ВАРИАНТЫ)
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к очистке иммуноглобулинов, и может быть использовано в производстве лекарственных препаратов иммуноглобулинов, пригодных для внутривенного введения. Препарат иммуноглобулина получают путем концентрирования фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывки от этанола, заключительного концентрирования раствора. Последующее восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина проводят методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации за счет введения в раствор иммуноглобулина низкомолекулярного вещества в концентрации 0,1-2,5 мас.%, с использованием воды с величиной рН от 3,8 до 4,5, очищенной для диализирующего раствора, затем добавляют стабилизатор и устанавливают величину рН 3,5-5,0. В конце очистки проводят стерилизующую фильтрацию и при необходимости полученный препарат сублимационно высушивают. Полученный препарат иммуноглобулина для внутривенного введения имеет показатель прозрачности раствора менее 0,01 и содержит мономерный иммуноглобулин G более 97% при полном отсутствии полимерных форм, белок от 4,5 до 11% и хлорид натрия - не более 0,3%. Изобретение позволяет уменьшить риск возникновения побочных реакций при терапии иммуноглобулинами, обеспечить возможность механизации и автоматизации процесса получения препарата иммуноглобулина, а также увеличить срок хранения этих препаратов. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к производству лекарственного препарата иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения.

Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения широко и успешно используются для терапии целого спектра различных заболеваний. Для лечебного применения предлагается большой набор препаратов, различающихся по своему качеству, частоте возникновения побочных реакций, форме, физическим параметрам, длительностью циркуляции в организме и эффективностью /1, 2/.

Отечественный препарат иммуноглобулина для внутривенного введения выпускается с использованием ферментативной обработки, что приводит к повреждению Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина G (IgG - иммуноглобулины класса G, составляют 80% всех антител сыворотки крови) и быстрому, в течение нескольких суток, выведению его из организма /3/. Это связано с тем, что в процессе производства к полуфабрикату иммуноглобулина добавляют пепсин - фермент, расщепляющий упомянутый Fc-фрагмент, что обеспечивает отличную толерантность при внутривенном введении, но приводит к нарушению большинства функций молекулы иммуноглобулина /4, 5/.

Одним из основных показателей качества препаратов внутривенного иммуноглобулина является антикомплементарная активность - способность после внутривенного введения самопроизвольно связывать и активировать комплемент. (Комплемент представляет собой систему сывороточных белков, один из важнейших факторов естественного иммунитета, который функционирует в крови человека, содержится в лимфе и тканевых жидкостях).

Низкая антикомплементарная активность обуславливает отсутствие побочных реакций при внутривенном введении препарата, поэтому препараты, имеющие антикомплементарную активность ниже 10 мг белка, не активирующих две 50% единицы комплемента (2 CH50), не могут применяться в клинической практике /6/. Способность препарата иммуноглобулина после внутривенного введения самопроизвольно связывать и активировать комплемент (антикомплементарная активность) объясняется повреждением молекул IgG при фракционировании с последующим образованием агрегатов. Клинически это проявляется одышкой, дрожью, тошнотой, а в некоторых случаях и коллапсом /7/.

В связи с этим одной из наиболее важных стадий технологического процесса получения препарата иммуноглобулина является уменьшение антикомплементарной активности.

Уменьшение антикомплементарной активности препарата иммуноглобулина может обеспечиваться различными способами: обработкой протеолитическими ферментами /5/, модификацией иммуноглобулина путем ацетилирования /8/ или сульфонирования /9/, выдерживанием при температуре 37°С в течение 18 часов /10/, инкубацией при температуре 30-45°С /11/, обработкой гелем гидроокиси алюминия с последующей температурной обработкой /12/. Однако подобное воздействие на иммуноглобулин может способствовать увеличению количества агрегированных форм иммуноглобулина /13/. Описан метод получения внутривенного иммуноглобулина с высоким содержанием мономеров /14/, способ получения немодифицированного жидкого иммуноглобулина с низкой ионной силой /15/. Известны способы получения препарата иммуноглобулина с использованием полиэтиленгликоля /16, 17, 18/, ионообменной хроматографией /19/, комбинацией ионообменной хроматографии, концентрирования ультрафильтрацией и инкубацией при температуре 30-45°С /20/.

Недостатками известных способов получения и препаратов иммуноглобулина являются сложность технологического процесса, высокая себестоимость, повреждающее воздействие фракционирующих агентов на молекулу иммуноглобулина, недостаточно высокое содержание мономерного IgG и низкая антикомплементарная активность.

Наиболее близкими техническими решениями являются способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и препарат иммуноглобулина для внутривенного введения (Габриглобин) /21, прототип/.

Данный известный способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения включает концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации за счет создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны с использованием дистиллированной воды (или, что то же, воды очищенной) для диализирующего раствора, добавление стабилизатора для установления содержания иммуноглобулина в растворе 5% и величины рН 3,5-5,0, а также стерилизующую фильтрацию.

Известный препарат иммуноглобулина для внутривенного введения получен способом, включающим концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации за счет создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны с использованием дистиллированной воды для приготовления диализирующего раствора, добавление стабилизатора с установлением содержания иммуноглобулина в растворе 5% и величины рН 3,5-5,0, а также стерилизующую фильтрацию.

При реализации этого известного способа стадию восстановления гидратных оболочек молекул иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации выполняют в течение 18-20 часов в ручном режиме. Для этого вискозную диализную оболочку нарезают на куски, дают ей намокнуть, затем герметизируют один конец оболочки, заполняют образующуюся емкость полуфабрикатом иммуноглобулина, герметизируют верхний конец оболочки, проверяют ее герметичность и проводят диализ в течение 12-14 часов с периодичной сменой диализного раствора вручную.

Как вариант может быть использован ультрафильтрационный аппарат (например, половолоконный аппарат АР-1,0, выпускаемый ОКБ ТМБ г.Кириши) в режиме диафильтрации. При этом в первичный контур ультрафильтрационного аппарата подают раствор иммуноглобулина, а во вторичном контуре аппарата с помощью насоса обеспечивают циркуляцию диализного раствора.

Дистиллированная или очищенная вода, используемая в качестве диализирующего раствора, имеет величину рН от 5,5 до 6,5. Использование такой воды без корректировки рН вызывает волнообразное увеличение величины рН раствора иммуноглобулина в процессе диафильтрации (во время восстановления гидратных оболочек иммуноглобулина) с 3,8 до 5,4. Ступенчатое повышение концентрации водородных ионов в растворе иммуноглобулина приводит, по-видимому, к неконтролируемым конформационным изменениям молекул иммуноглобулина и колебаниям антикомплементарной активности. Таким образом, в прототипе диализный раствор имеет неоптимальную кислотность, а в растворе иммуноглобулина отсутствуют вещества, формирующие эффективный градиент концентрации, в результате чего молекулы воды встраиваются в поврежденные или дегидратированные этанолом участки гидратной оболочки иммуноглобулина недостаточно активно для реализации эффективного процесса восстановления гидратных оболочек молекул иммуноглобулина и соответствующего снижения антикомплементарной активности. Получаемый препарат имеет недостаточно высокое количество мономерного иммуноглобулина и ненормированное количество хлорида натрия. (Содержание хлорида натрия в препарате иммуноглобулина отражает эффективность процесса удаления спирта и других низкомолекулярных веществ, используемых в процессе фракционирования иммуноглобулина. Чем ниже содержание хлорида натрия, тем эффективнее процесс диафильтрации).

На чертеже изображена характеристика изменения величины рН раствора иммуноглобулина от объема воды в процессе диафильтрации.

При использовании стадии ручного режима в технологическом процессе приготовления препарата повышаются производственные затраты, невозможна механизация процесса, снижается объем выпуска препарата иммуноглобулина, а также не удается стабилизировать содержание мономерного IgG и антикомплементарную активность при выпуске очередных серий препарата.

Из пяти проверенных серий препарата, полученного с использованием прототипа на Ивановской станции переливания крови, только две серии соответствовали требованиям фармакопейной статьи предприятия /22/, по антикомплементарной активности. (Фармакопейная статья предприятия является документом, определяющим показатели качества лекарственного средства, утверждается Министерством здравоохранения РФ). В связи с тем, что препарат выпускается в сухом виде, все анализы проводятся после растворения сухой массы в прилагаемом растворителе (с.5 ФСП №42-0265-16-21-01 /22/).

Технической задачей данной группы изобретений, объединенных единым техническим замыслом, является создание эффективного способа получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, а также создание препарата иммуноглобулина для внутривенного введения и расширение арсенала указанных способов и препаратов.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи данной группы изобретений, состоит в уменьшении риска возникновения побочных реакций, вследствие снижения и стабилизации антикомплементарной активности препарата иммуноглобулина и увеличения количества мономеров при сокращении количества димерных форм, обеспечении возможности механизации и автоматизации процесса получения препарата иммуноглобулина G, увеличении срока хранения препарата иммуноглобулина.

Антикомплементарная активность, как уже упоминалось, является одним из основных показателей качества препаратов внутривенного иммуноглобулина. Низкая антикомплементарная активность обуславливает отсутствие побочных реакций при внутривенном введении препарата. Поэтому значительные колебания этого показателя от серии к серии являются недопустимыми.

Следует иметь в виду, что при фракционировании, во время выделения иммуноглобулина из плазмы крови добиваются удаления гидратных оболочек путем введения в белковый раствор этанола, который забирает гидратную воду, тем самым снижает заряд белковых глобул и приводит к осаждению иммуноглобулинов /27/.

В свою очередь, это приводит к нарушению четвертичной (пространственной) структуры молекулы иммуноглобулина, демаскированию участков, на которых происходит связывание и дальнейшая активация комплемента, т.е. к увеличению антикомплементарной активности, что способствует возникновению побочных реакций. Одновременно появляются димерные и полимерные формы иммуноглобулина.

Необходимость восстановления «гидратных оболочек» иммуноглобулина для снижения и стабилизации антикомплементарной активности объясняется тем, что все белковые молекулы существуют в растворах, и их пространственная конфигурация зависит от взаимодействия радикалов аминокислот, образующих белковую цепочку, с молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот обращены вглубь молекулы, а полярные радикалы ориентированы в сторону воды.

Именно образование объемных гидратных или сольватных оболочек вокруг молекулы иммуноглобулина способствует наиболее стабильной конформации белковых глобул. Гидратные оболочки играют решающую роль в образовании третичной и четвертичной структуры молекулы иммуноглобулина и в ее стабильности /29/. Нарушение пространственной четвертичной структуры молекулы иммуноглобулина приводит к "открытию" участка молекулы IgG, на котором инициируется процесс активации комплемента. На конформацию белка в водных растворах влияет величина рН, температура и присутствие низкомолекулярных соединений /28/.

Направление создания препарата и способа его получения было выбрано с учетом результатов изучения причин значительного колебания антикомплементарной активности производственных серий известного препарата иммуноглобулина. Для этого было проведено специальное исследование, в результате которого установлено, что наиболее значимыми параметрами проведения данной стадии является механизм создания градиента концентрации и величина рН раствора, используемого при ультра- и диафильтрации.

Сущность изобретения в части способа заключается в том, что способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны с использованием воды очищенной для диализирующего раствора, добавление стабилизатора, установления величины рН 3,5-5,0, а также стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что во время ультрафильтрации и при восстановлении гидратных оболочек воду для диализирующего раствора используют с величиной рН от 3,8 до 4,5, а градиент концентрации создают за счет введения в раствор иммуноглобулина низкомолекулярного вещества в концентрации 0,1-2,5 мас.%, и, при необходимости, после стерилизующей фильтрации проводят сублимационное высушивание.

В качестве низкомолекулярного вещества предпочтительно использовать мальтозу или натрия хлорид.

Сущность изобретения в части препарата заключается в том, что препарат иммуноглобулина для внутривенного введения получен способом, предусматривающим концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывку от зтанола, заключительное концентрирование раствора, восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны с использованием воды очищенной для диализирующего раствора, добавление стабилизатора, установления величины рН 3,5-5,0, а также стерилизующую фильтрацию, причем во время ультрафильтрации и при восстановлении гидратных оболочек воду для диализирующего раствора используют с величиной рН от 3,8 до 4,5, а градиент концентрации создают за счет введения в раствор иммуноглобулина низкомолекулярного вещества в концентрации 0,1-2,5 мас.%, при этом препарат в жидкой форме имеет показатель прозрачности раствора менее 0,01, содержит мономерного иммуноглобулина G более 97% при полном отсутствии полимерных форм, белка от 4,5 до 11% и хлорида натрия не более 0,3%.

При необходимости препарат иммуноглобулина может быть выпущен в сухой форме, при этом до начала сублимационной сушки он имеет следующие показатели: прозрачность раствора - менее 0,01, содержание мономерного иммуноглобулина G более 97% при полном отсутствии полимерных форм, белка - от 4,5 до 11% и хлорида натрия - не более 0,3%.

Процесс полного восстановления гидратных оболочек иммуноглобулина в технологической схеме получения иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, крайне важен, так как позволяет увеличить стабильность лекарственной формы, предотвратить образование полимеров и агрегатов и устранить спонтанную активацию комплемента.

Лабораторным показателем эффективности данного процесса являются показатель прозрачности раствора, содержание мономерного IgG и антикомплементарная активность иммуноглобулина.

Отмеченные показатели качества препаратов иммуноглобулина, приготовленного в соответствии с прототипом и заявляемым методом, приведены в таблице 1.

Таблица 1 
Лабораторные показатели качества препаратов иммуноглобулина, приготовленного по прототипу и заявляемому методу 
Препарат иммуноглобулина Прозрачность раствора (оптическая плотность, безразмерная величина) Содержание мономерного IgG (%) Антикомплементарная активность (мг белка, не активирующие 2 СН 50) 
Полученный по прототипу 0,0080±0,00068 92,44±1,372 7,0±2,4 
Полученный заявляемым способом 0,0033±0,0013 97,166±0,298 10,0±0,0 


Если среднее значение антикомплементарной активности пяти серий иммуноглобулина, приготовленного по прототипу, составило 7,0±2,4, то антикомплементарная активность 10 серий препарата иммуноглобулина Габриглобин, приготовленного предлагаемым способом, составила (10±0) мг белка, не активирующих 2 CH50. В препарате, приготовленном заявляемым способом, содержание мономерного IgG было выше, а раствор был значительно прозрачнее.

Стабильность основных параметров получаемого препарата от партии к партии иллюстрируется таблицей 2, где суммированы наиболее существенные показатели качества десяти производственных серий препарата иммуноглобулина, полученного заявляемым способом.

Таблица 2 
Показатели качества десяти производственных серий препарата иммуноглобулина, приготовленного заявляемым способом 
Значение показателей 
Показатели качества Минимальное и максимальное значение Среднее значение Отклонение 
Прозрачность 0,001-0,006 0,0033 0,0013 
Цветность 0,009-0,013 0,0107 0,00104 
pH 4,25-4,38 4,33 0,0276 
Белок, % 4,61-5,21 4,89 0,153 
Натрия хлорид, % 0,1-0,12 0,102 0,0036 
Электрофоретическая однородность, % 98-98 98 0 
Содержание полимеров, % 0-0 0 0 
Содержание димеров, % 1,99-3,50 2,777 0,345 
Содержание мономеров, % 96,50-97,58 97,166 0,2988 
Содержание фрагментов, % 0-0,45 0,088 0,1408 
Антикомплементарная активность, мг белка 10-10 10 0 
Антитела к альфастафилолизину, МЕ/мл 2-2 2 0 
Антитела к вирусу кори, МЕ/мл 25-25 25 0 


Препарат иммуноглобулина, приготовленный предлагаемым методом, имел во всех сериях стабильные показатели качества, содержание мономерной фракции составило более 97%, полимеры отсутствовали во всех сериях, а содержание хлорида натрия было менее 0,1%.

Клиническое применение заявляемого препарата иммуноглобулина показало, что при внутривенном введении он хорошо переносится, не вызывает побочных реакций и не уступает по лечебной эффективности лучшим зарубежным образцам, что подтверждено клиническими испытаниями в Челябинской городской клинической больнице №1; Челябинском межтерриториальном ожоговом центре им. Р.И.Лифшица на базе городской клинической больницы №6; Институте ревматологии РАМН; Кафедре пропедевтики внутренних болезней Ярославской медицинской академии, Измайловской детской клинической больнице и Государственном научном центре «Институт иммунологии МЗ РФ».

В ходе контролируемых клинических испытаний показано, что данный иммуноглобулин эффективен при гнойно-септических осложнениях основного заболевания у травматологических и общехирургических больных; сепсисе; ожогах; системной красной волчанке; системных васкулитах; атипичной пневмонии, тромбоцитопенической пурпуре у детей и агаммаглобулинемии / Алешин В.А. и соавт., 2003, Донюш Е.К. и соавт., 2003, Онищенко Г.Г., 2002/.

Способ получения препарата иммуноглобулина реализуется следующим образом.

Каждую партию сырья для получения препарата готовят из плазмы крови, полученной от группы доноров, путем фракционирования ее белков этанолом при температуре ниже 0°С (метод Кона).

Во фракции III (фильтрат «Б») спиртового метода Кона устанавливают величину рН 3.5-5.0 и концентрируют на ультрафильтрационной установке до уменьшения объема раствора в 10-12 раз. Ультрафильтрация - один из видов мембранной фильтрации для образования безбелковой жидкости. Ультрафильтрация характеризуется использованием мембран с размером пор 1-300 кД, удаляет все коллоидные взвеси, органические и неорганические загрязнения с размером молекул больше пор мембран. Перенос веществ через мембраны происходит под действием разности концентраций, разности электрических потенциалов по обе стороны мембраны или разности давлений.

Затем удаляют этанол, используя 5-6 объемов воды очищенной с величиной рН от 3,8 до 4,5, а далее концентрируют раствор иммуноглобулина до содержания белка 6-7%. После этого проводят восстановление гидратных оболочек, для чего вводят в раствор иммуноглобулина низкомолекулярное вещество, предпочтительно, мальтозу или NaCl в количестве 0,1-2,5% и выполняют молекулярную диафильтрацию с использованием воды очищенной с величиной рН 3,8-4,5. Установку для проведения диафильтрации собирают в соответствии со схемой, рекомендованной Броком /26/. В первичный контур установки подают раствор иммуноглобулина с низкомолекулярным веществом, а во вторичном контуре аппарата с помощью насоса обеспечивают циркуляцию диализного водного раствора с величиной рН 3,8-4,5.

Использование низкомолекулярного вещества для создания градиента концентрации и диализного раствора с контролируемой величиной рН позволяет эффективно восстанавливать молекулярные оболочки иммуноглобулина с использованием только ультрафильтрационной установки, отпадает необходимость проведения диализа в ручном режиме, достигаются стабильные показатели антикомплементарной активности, содержания мономеров и отсутствие полимерных форм от серии к серии.

Получают заявляемый препарат иммуноглобулина с антикомплементарной активностью 10 мг белка, не активирующих 2 CH50 с содержанием мономерного IgG более 97%, полном отсутствии полимерных форм, концентрацией хлорида натрия менее 0,3%, прозрачностью менее 0,01 и содержанием белка от 4,5 до 11%.

Пример 1.

Фракцию III в количестве 300 л, полученную при фракционировании плазмы спиртовым методом Кона, помещают в реактор (емкость) и устанавливают величину рН 3,5 с помощью 1 М раствора HCl. Фильтрат подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке. После уменьшения раствора до 30 л проводят удаление (отмывание) этанола, используя 150 л (5 объемов) воды очищенной с величиной рН 4,2 и концентрируют иммуноглобулин до 25 л (6,5% белка).

Проводят восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации. Для этого в раствор иммуноглобулина вводят 30 г натрия хлорида (концентрация 0,1%) и перемешивают до полного растворения. Проводят диафильтрацию, используя воду очищенную с величиной рН 3,8 в количестве 150 л. После этого проверяют и при необходимости корректируют величину рН, вводят стабилизатор и устанавливают содержание (концентрацию) белка 4,5%. Проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив по флаконам. Препарат иммуноглобулина до начала сублимационной сушки имел следующие параметры: показатель прозрачности раствора 0,0030, содержание мономерного иммуноглобулина G - 97,2%, полимерные формы отсутствуют, белок - 4,5% и хлорида натрия - 0,25%. Для получения лекарственной формы препарат высушивают из замороженного состояния (лиофилизируют).

Пример 2.

Во фракции III, полученной при фракционировании плазмы спиртовым методом Кона, общим объемом 100 л коррегируют величину рН до 4,2 и подвергают концентрированию на ультрафильтрационной установке в течение 2 часов, пока общий объем не уменьшится до 10 л. После этого удаляют этанол и соли, используя 50 л воды очищенной с величиной рН 4,5. Для восстановления гидратных оболочек в раствор иммуноглобулина (10 л) вносят 250 г мальтозы, что составляет 2,5% (концентрация). После растворения низкомолекулярного иона обеспечивают диафильтрацию концентрата иммуноглобулина на ультрафильтрационной установке, используя воду очищенную с величиной рН 4,5 в количестве 300 л. На заключительном этапе концентрируют раствор до содержания (концентрации) белка 11%, устанавливают величину рН в требуемых пределах, проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, разливают по флаконам и получают 3,7 л иммуноглобулина в жидкой форме с антикомплементарной активностью 10 мг белка, не активирующих 2 CH50, прозрачностью раствора 0,0025, с содержанием мономерного IgG 98,4%, полном отсутствии полимеров, концентрацией натрия хлорида менее 0,2%.

Источники информации:

1. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения.: Автореф. дисс канд.биол. наук. - Л., 1990. - 20 с.

2. Berkman S.A., Lee M.L, Gale R.P. Clinical uses of intravenous immunoglobulins. // Annals of internal medicine. - 1990. - V.112, №4. - P.278-292.

3. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения в терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний. - Н.Новгород. - 1998. - 40 с.

4. Патент SU №2141341. Шарыгин С.Л. и соавт. Способ получения иммуноглобулина человека антистафилококкового для внутривенного введения. 1999.

5. Патент SU №618958.

6. Евченко Т.А., Комплексная оценка комплементсвязывающей способности внутривенных иммуноглобулинов. Автореф. дисс. канд биол. наук. М. - 2000. - 24 с.

7. Barandun S., Kistler P., Jenet F., Isliker H Intravenous administration of human y-globulin. // Vox sanguinis. - 1962. - V7. - №2. - P.157-174.

8. US patent №4356173.

9. US patent №4360457. Ono et al. S-sulfonated immunoglobulin composition having a high monomer content and a process for production thereof, 1982.

10. Мостовская Е.В. Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения. Автореф. дисс. канд. М., 2004, 22 с.

11. ЕР №0085747.

12. 3убкова Н.В. Физико-химические и биологические свойства препаратов иммуноглобулинов при разных способах удаления и инактивации вирусов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2002, 24 с.

13. Исрафилов А.Г., А.Г.Лютов, Корнилова И.А., Конева O.K., Евченко Т.А. Изучение условий предупреждения агрегации и снижения димеризации иммуноглобулина при температурной обработке. // Актуальные вопросы прикладной биохимии и биотехнологии, - Уфа. - 1998. - С.171-174.

14. US patent №4476109. Kimura et al. Method of preparing gamma globulin suitable for intravenous administration, 1984.

15. ЕР №0278422.

16. US patent №4164495. Hansen. Method of recovering immunoglobulin using a polyol and an alkanoic acid, 1979.

17. US patent №5132406. Uemura et al. Method of producing immunoglobulin preparatios for intravenous injection, 1992.

18. US patent №5945098. Sarno et al. Stable intravenously-administrable immune globulin preparation, 1999.

19. US patent №6069236. Burnouf-Radosevich et al. Immunoglobulin G concentrate for therapeutic use and process for producing said concentrate, 2000.

20. ЕР №0085747.

21. Патент RU №2122864. Алешкин В.А., Лютов А.Г. Препарат иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения.

22. Фармакопейная статья предприятия (ФСП) №42-0265-1621-01. Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой. Ивановская станция переливания крови.

23. Алешкин В.А., Лютов А.Г, Афанасьев С.С. и др. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных. // Новые лекарственные препараты. М., 2003, в.4, с.6-32.

24. Донюш Е.К., Лютов А.Г., Сосков Г.И., Новичкова ГА., Тюкалова Н.Р. Опыт применения Габриглобина у детей с аутоиммунной тромбоцитопенической пурпурой // Вопросы онкологии и химиотерапии, 2003, №1, с.87-90.

25. Онищенко Г.Г. (ред.) Препараты иммуноглобулина. В кн.: Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. Коллектив авторов. М., 2002, с.262-324.

26. Брок Т. Мембранная фильтрация. М., "Мир", 1987, с.374.

27. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. М., "Мед.", 1983, с.75-78.

28. Кяйвяряйнен А.И. // Динамическое поведение белков в водной среде и их функции. Ленинград, 1980.

29. Литмен Г., Гуд Р. Иммуноглобулины. М., Мир, 1981, 495 с.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ получения препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, включающий концентрирование фракции III спиртового метода Кона ультрафильтрацией при величине рН 3,5-5,0, отмывку от этанола, заключительное концентрирование раствора, восстановление гидратных оболочек иммуноглобулина методом молекулярной фильтрации путем создания градиента концентрации низкомолекулярных веществ по разные стороны полупроницаемой мембраны с использованием воды очищенной для диализирующего раствора, добавление стабилизатора, установление величины рН 3,5-5,0, а также стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что во время ультрафильтрации и при восстановлении гидратных оболочек воду для диализирующего раствора используют с величиной рН от 3,8 до 4,5, а градиент концентрации создают за счет введения в раствор иммуноглобулина низкомолекулярного вещества в концентрации 0,1-2,5 мас.%, и, при необходимости, после стерилизующей фильтрации проводят сублимационное высушивание.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве низкомолекулярного вещества используют мальтозу или натрия хлорид.

3. Способ по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что после стерилизующей фильтрации проводят сублимационное высушивание.

4. Препарат иммуноглобулина для внутривенного введения в жидкой форме, полученный в соответствии со способом по п.1, имеющий показатель прозрачности раствора менее 0,01, содержащий мономерного иммуноглобулина G более 97% при полном отсутствии полимерных форм, белка от 4,5 до 11% и хлорида натрия - не более 0,3%.

5. Сублимационно высушенный препарат иммуноглобулина для внутривенного введения, полученный в соответствии со способом по п.1, имеющий следующие показатели до начала сублимационной сушки: прозрачность раствора менее 0,01, содержание мономерного иммуноглобулина G более 97% при полном отсутствии полимерных форм, белка от 4,5 до 11% и хлорида натрия - не более 0,3%.