АГОНИСТЫ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

АГОНИСТЫ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ


RU (11) 2299731 (13) C2

(51) МПК
A61K 31/495 (2006.01)
A61P 11/00 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.05.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003131178/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.03.25 
(30) Приоритетные данные: 2,341,952 2001.03.23 CA 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.03.25 
(43) Дата публикации заявки: 2005.04.10 
(45) Опубликовано: 2007.05.27 
(56) Аналоги изобретения: WO 0115697, 08.03.2001, весь документ. WO 0023062, 27.04.2000, весь документ. ЗИЛЬБЕР А.П. Дыхательная недостаточность. - М.: Медицина, 1989, с.288-289, 295-296. Руководство по медицине. /Под ред. Р. БЕРКОУ, т. 1. - М.: МИР, 1997, с.450-451. ГРИППИ М.А. Патофизиология легких. - М.: БИНОМ, 2001, с.95-98. ДЕРКАЧ В.А. и др. Влияние химической
модификации на активность одиночного канала нейронального никотинового холинорецептора. Клеточная сигнализация. /Под. ред. П.Г. Костюк. - М.: Наука, 1992, с.14-23. BELESLIN DB. et al. Central nicotinic receptors: vomiting, ear twitching and panting. Brain Res Bull. 1983 Sep; 11(3): 299-302.

(72) Имя изобретателя: КОРМЬЕ Ивон (CA); ИСРАЭЛЬ-АССАЯГ Эвелин (CA); БЛАНШЕ Мари-Рене (CA) 
(73) Имя патентообладателя: ЮНИВЕРСИТЕ ЛАВАЛЬ (CA) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2003.10.23 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: CA 02/00412 (25.03.2002) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 02/076434 (03.10.2002) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Г.Б. Егоровой, рег.№ 513 

(54) АГОНИСТЫ НИКОТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения и профилактики легочных воспалительных заболеваний, а именно астмы, интерстициального фиброза легких (IPF), саркоидоза, гиперчувствительного пневмонита (HP), хронического HP и облитерирующего бронхиолита с организующейся пневмонией (ВООР). Для этого используют агонисты никотиновых рецепторов (АНР), выбранные из группы никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина, цитизина и их производных. АНР используют как в качестве монотерапии, так и в сочетании с другими агентами, например, бронходилятаторами, кортикостероидами, анти-лейкотриенами и иммуносупрессорами. Введение АНР осуществляют перорально, парентерально, местно или ингаляционно. Предлагается также использовать АНР для производства соответствующих лекарственных средств. Использование этой группы изобретений позволяет предупреждать или останавливать развитие фиброза в дыхательных путях и легких, а также минимизировать побочные явления, свойственные многим группам препаратов, применяемых при данной патологии. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 27 ил.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Область изобретения

Настоящее изобретение относится к лечению воспалительных заболеваний, включая различные заболевания легких, посредством применения или введения агонистов никотиновых рецепторов.

Предпосылки изобретения

Несмотря на то, что человек вдыхает более чем один кубический метр воздуха, защитные механизмы его легких обычно справляются с большими количествами частиц, антигенов, возбудителей инфекций, токсичных газов и паров, которые находятся во вдыхаемом воздухе. Взаимодействие этих частиц с иммунной системой и другими защитными механизмами легких приводит к возникновению регулируемой воспалительной ответной реакции, которая, как правило, является защитной и полезной. В основном данный процесс является саморегулируемым для сохранения целостности дыхательных путей и эпителиальных поверхностей альвеол, где происходит газообмен. Однако в некоторых случаях воспалительная ответная реакция не может находиться под контролем, и возрастает риск повреждения тканей. В зависимости от типа воздействия окружающей среды, генетической предрасположенности и различных болезнетворных факторов аномально большие количества воспалительных клеток могут появиться в различных местах дыхательной системы, приводя к развитию болезненного состояния или заболевания.

Воспалительная ответная реакция на попадаемый при дыхании или внутренний фактор характеризуется неспецифическим увеличением проницаемости сосудов, высвобождением медиаторов воспаления или хемотаксиса, включая гистамин, эйкозаноиды, простагландины, цитокины и хемокины. Данные медиаторы изменяют экспрессию и выработку молекул адгезии лейкоцитов - эндотелиальных клеток, способствуя появлению клеток воспаления в крови.

Более специфическая воспалительная реакция включает в себя распознавание и формирование острого специфического иммунного ответа на попадаемые при дыхании антигены. Данная реакция приводит к развитию астмы, гиперчувствительного пневмонита (НР) и, возможно, саркоидоза. Нарушение регуляции механизмов восстановления после травмы легких может привести к фиброзу и потере функциональной активности при астме, фиброзе легких, хроническом обструктивном заболевании легких (COPD) и хроническом НР.

Ранее сообщалось, что частота проявления НР у заядлых курильщиков значительно ниже, чем у некурящих людей [1-4]. Саркоидоз также значительно реже встречается у курильщиков по сравнению с некурящими [5, 6]. Механизм, лежащий в основе положительного влияния курения сигарет на развитие НР и других воспалительных заболеваний, остается неизвестным, но может быть связан с иммуномодулирующим действием никотина. Имеются клинические наблюдения по возникновению астмы de novo или ее обострению после прекращения курения. В данном случае трудно получить доказательства этого, и любое проявление защитного действия никотина в отношении профилактики или лечения астмы, вероятно, подавляется отрицательным воздействием табачного дыма с его тысячами составляющих компонентов.

Также сообщалось о положительном влиянии курения при других заболеваниях, из которых наиболее изученным является язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника [7, 8]. Никотин с успехом применяется при лечении данного заболевания [9, 10]. В других исследованиях была показана возможная лечебная ценность никотина при лечении болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона [11, 12].

Никотиновые рецепторы представляют собой пентамеры, состоящие из пяти полипептидных единиц, которые функционируют в качестве лиганда воротных ионных каналов. Когда лиганд связывается с рецептором, в полипептиде происходят конформационные изменения, открывающие центральный канал, в результате чего ионы натрия поступают из внеклеточной жидкости в цитоплазму. Установлено наличие четырех типов субъединиц: , , и . Рецептор может состоять из любой комбинации субъединиц данных четырех типов [13]. В недавнем исследовании было показано, что альвеолярные макрофаги (АМ) могут экспрессировать субъединицу -7 [14], в то время как бронхиальные эпителиальные клетки экспрессируют субъединицы -3, -5 и -7 [15] и лимфоциты - субъединицы -2, -5, -7, -2 и -4 [14]. В фибробластах [16] и клетках гладкой мускулатуры дыхательных путей также могут экспрессироваться данные рецепторы [17]. Следовательно, структурные легочные клетки (АМ, дендритные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты и т.д.) и клетки, появляющиеся при воспалительных заболеваниях (лимфоциты, полиморфноядерные клетки), экспрессируют никотиновые рецепторы.

Активация никотиновых рецепторов в лимфоцитах оказывает влияние на внутриклеточную сигнализацию, приводя к неполной активации клеток. Фактически обработка никотином приводит к повышению активности протеинкиназы, что, в свою очередь, повышает активность фосфолипазы А2 (PLA2). PLA2 ответственна за расщепление фосфоинозит-2-фосфата (PIP2) с образованием инозит-3-фосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG) [18, 19]. Продолжительное присутствие IP3 в клетках будет приводить к десенсибилизации запасов кальция, вызывая их истощение. Данное наблюдение можно объяснить тем фактом, что из обработанных никотином лимфоцитов кальций не высвобождается в достаточной мере в цитоплазму для активации факторов транскрипции, таких как NFk-B [20].

Никотин, основной фармакологический компонент дыма сигарет, является одним из наиболее известных агонистов никотиновых рецепторов [21]. Это натуральное соединение обладает хорошо установленными противовоспалительными и иммуносупрессорными свойствами [22] и может обладать антифиброзной активностью [23]. Воздействие на животных дыма от сигарет с высоким содержанием никотина оказывает более выраженное иммуносупрессорное действие, чем от сигарет с низким уровнем никотина [24]. Кроме того, обработка крыс никотином приводит к подавлению ответной выработки специфических антител на антигены и индуцирует анергию Т-клеток [25]. АМ курильщиков, несмотря на повышенное их количество, проявляют пониженную способность к секреции цитокинов воспаления в ответ на эндотоксины [20, 25, 26], и вероятно, ответственным компонентом за данное ингибирование является никотин [26]. В одном исследовании также было показано, что в лимфоцитах периферической крови курильщиков экспрессируются более высокие концентрации лиганда FAS (FASL) и что никотин повышает экспрессию FASL в лимфоцитах от некурящих людей, указывая на то, что никотин может влиять на апоптоз клеток [27]. Также было показано, что никотин оказывает ингибирующее действие на пролиферацию и образование внеклеточного матрикса в человеческих фибробластах десен в условиях in vitro [23]. Интересно, что, по-видимому, обработка никотином приводит к увеличению экспрессии самих никотиновых рецепторов [28].

Агонисты никотина могут подавлять активацию Т-клеток, действительно было показано, что никотин воздействует на экспрессию Т-клетками костимулирующих молекул CD28 и CTLA4 [29].

Костимуляция B7/CD28/CTLA4 играет ключевую роль в активации Т-клеток и поддержании гомеостаза [30, 31]. В этом участвуют два сигнальных пути. Положительный сигнал включает в себя связывание молекул В7 (CD80/CD86) с Т-клеточными CD28-рецепторами, что приводит к усилению ответных реакций со стороны Т-клеток (пролиферации, активации, экспрессии цитокинов и выживания) [32]. Отрицательный сигнал включает в себя взаимодействия В7 с CTLA4 на активированных Т-клетках, приводя к подавлению ответных реакций Т-клеток [33, 34]. Соотношение сигналов от CD28 и CTLA4 может изменять результат активации Т-клеток.

Ранее сообщалось, что при НР имеет место повышение экспрессии молекул В7 в АМ у пациентов с активной формой НР [35] и у мышей с НР [36]. Также было показано, что блокада пути костимуляции В7-CD28 у мышей подавляет воспаление легких [36]. Результаты этих исследований также показали, что экспрессия молекул В7 в АМ ниже у курильщиков по сравнению с некурящими, и в условиях in vitro вирус гриппа способен повышать экспрессию В7 в нормальных человеческих АМ, но не в АМ курильщиков; остается неизвестным, возникает ли это за счет никотина или других соединений, находящихся в дыме сигарет [35]. Сообщалось также об увеличении экспрессии молекул В7 при астме [37, 38] и саркоидозе [39].

К настоящему времени эпибатидин является наиболее эффективным агонистом никотина [40]. Он обладает противовоспалительными и болеутоляющими свойствами. Фактически его болеутоляющая активность в 200 раз выше, чем у морфина [40]. Также известно, что эта молекула подавляет пролиферацию лимфоцитов в условиях in vitro [41]. Связывание эпибатидина с рецептором является неспецифическим [42]. К сожалению, эпибатидин обладает существенными побочными реакциями в основном в отношении сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, что делает его неприемлемым для применения в качестве противовоспалительного препарата для лечения заболеваний легких [40].

Диметилфенилпиперазиний (DMPP) представляет собой синтетический агонист никотина, который является неспецифическим [13]. Его активность в отношении рецептора является такой же, что и у никотина в зависимости от вида клеток, участвующих в стимуляции [43]. Его преимущество по сравнению с никотином и другими агонистами никотина заключается в том, что в результате его химического строения он не проникает через гематоэнцефалический барьер, не вызывая тем самым аддикции или других эффектов со стороны центральной нервной системы [13]. Противовоспалительные свойства DMPP хорошо не описаны. Однако было показано, что в результате длительного лечения in vivo может произойти снижение числа лейкоцитов, уменьшение продукции цитокинов в спленоцитах и падение активности естественных киллерных клеток [44]. Исследовали действие DMPP на клетки гладкой мускулатуры дыхательных путей. DMPP первоначально оказывает непродолжительное по времени контрактивное действие, которое сменяется релаксирующим эффектом при контакте клеток с агонистом в течение более продолжительного периода времени [45]. Сам по себе данный бронхорасширяющий эффект не делает DMPP потенциально пригодным для лечения астмы, поскольку на рынке в настоящее время имеются более сильные бронходилятаторы (агонисты В2). Однако свойства данного агониста никотиновых рецепторов являются важными, поскольку данный препарат можно с безопасностью назначать астматикам и пациентам с COPD за счет его противовоспалительной активности. Кроме того, отсутствуют доказательства того, что DMPP оказывает какое-либо токсическое действие на важные органы, такие как сердце, мозг, печень и легкие.

Несмотря на имеющиеся успехи в лечении воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания легких, лечение с использованием имеющихся препаратов или средств часто приводит к проявлению нежелательных побочных эффектов. Например, воспаление COPD явно устойчиво к лечению кортикостероидами, и, следовательно, общепризнанной является потребность в разработке новых противовоспалительных препаратов для лечения данного заболевания [46].

Аналогично, несмотря на то, что кортикостероиды и другие иммуносупрессорные препараты обычно применяются для лечения фиброза легких, они проявляют только низкую эффективность [47].

Таким образом, имеется потребность в новых и надежных способах лечения воспалительных заболеваний, включая воспалительные заболевания легких, способах, которые ослабляют симптомы этих заболеваний, не вызывая побочных эффектов.

Краткое описание изобретения

Согласно настоящему изобретению обеспечивается новый способ лечения воспалительных заболеваний. В частности, описывается новый способ лечения воспалительных заболеваний легких посредством применения или введения агонистов никотиновых рецепторов.

Идея применения никотина или других агонистов никотиновых рецепторов для лечения воспалительных заболеваний легких является новой. Несмотря на высокие противовоспалительные и иммуносупрессорные свойства никотина и других агонистов никотиновых рецепторов, их пригодность для лечения аллергических и других воспалительных заболеваний легких ранее не раскрывалась. Сам по себе никотин является безопасным соединением, которое, вероятно, не вызывает продолжительных побочных эффектов [48, 49]. Связанные с табачным дымом заболевания легких, сердца и артерий не возникают в результате действия самого никотина, а вызываются тысячами других химических веществ, находящихся во вдыхаемом дыме. Основная проблема заключается в том, что никотин проникает через гематоэнцефалический барьер, вызывая аддикцию. Данное обстоятельство является основной причиной потери интереса к агонистам никотина для лечения заболеваний легких. Отрицательное действие курения сигарет является очевидным. Несмотря на то, что никотин не ответственен за токсические эффекты курения сигарет [49], ассоциация с ним остается.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается использовать агонисты никотиновых рецепторов, такие как DMPP, для лечения воспалительных заболеваний легких, таких как астма, COPD, интерстициальный фиброз легких (IPF), саркоидоз, НР и облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией (ВООР). Препарат можно вводить перорально или предпочтительно целенаправленной доставкой в легкие с помощью аэрозоля с различными и предпочтительными носителями для сведения до минимума системных эффектов.

Противовоспалительные и иммуносупрессорные свойства, а также минимальные побочные эффекты агонистов никотиновых рецепторов делают данные препараты идеально подходящими для медицинского применения при лечении широкого ряда заболеваний легких, которые характеризуются бронхиальным или интерстициальным воспалением. Данные заболевания включают в себя такие заболевания как астма, COPD, IPF, саркоидоз, НР и ВООР.

Другие предметы, преимущества и признаки настоящего изобретения станут более очевидными при ознакомлении с неограничивающим описанием его предпочтительных воплощений, представленных в виде примеров при обращении к сопровождающим фигурам.

Краткое описание фигур

Фигура 1: общее и дифференциальное число клеток в бронхоальвеолярном лаваже (BAL). Имело место заметное снижение общего числа клеток у обработанных никотином мышей в основном за счет уменьшения популяции лимфоцитов.

Фигура 2: экспрессия мРНК IFN- в выделенных одноядерных клетках легких. Наблюдалось значительное снижение мРНК IFN- .

Фигура 3: экспрессию мРНК TNF- индуцировали 24 ч стимуляцией LPS. Данные представлены в виде % экспрессии, 100% относится к группе с одной стимуляцией LPS. Интенсивность полосы получали, разделив интенсивность полосы TNF- на таковую для -актина. Обработка стимулированных клеток различными концентрациями (40-160 мкМ никотина и DMPP) индуцировала уменьшение экспрессии мРНК TNF- . Наибольший эффект получали при концентрации никотина, составляющей 40 мкМ (снижение экспрессии на 98%), в то время как все другие концентрации DMPP вызывали снижение экспрессии на 60-50%.

Фигура 4: экспрессию мРНК TNF- индуцировали 24 ч стимуляцией SR. Данные представлены, как описано для фиг.5. Обработка стимулированных клеток различными концентрациями (80 и 160 мкМ никотина и 40-160 мкМ DMPP) индуцировала уменьшение экспрессии мРНК TNF- . Только концентрация никотина 160 мкМ, оказывала действие на экспрессию мРНК, в то время как концентрации DMPP 40 и 80 мкМ приводили к уменьшению экспрессии мРНК TNF- на 60%.

Фигура 5: экспрессию мРНК IL-10 индуцировали 24 ч стимуляцией LPS. Данные представлены, как описано для фиг.5. Обработка стимулированных клеток различными концентрациями (40-160 мкМ никотина и DMPP) индуцировала уменьшение экспрессии мРНК IL-10. Наибольшее уменьшение экспрессии (снижение на 87%) имело место при концентрации никотина, равной 40 мкМ. DMPP приводил к снижению экспрессии на 55-40% при всех трех концентрациях.

Фигура 6: экспрессию мРНК IL-10 индуцировали 24 ч стимуляцией SR. Обработка стимулированных клеток различными концентрациями (80 и 160 мкМ никотина и 40-80 мкМ DMPP) индуцировала уменьшение экспрессии мРНК IL-10. Наибольшее уменьшение экспрессии мРНК имело место при обработке никотином в концентрации 160 мкМ (снижение экспрессии на 60%) и при обработке DMPP в концентрации 80 мкМ (снижение экспрессии на 90%).

Фигура 7: экспрессию мРНК IFN- в клетках RAW 264,7 индуцировали 24 ч стимуляцией LPS. Данные представлены, как описано для фиг.5. Обработка стимулированных клеток DMPP в различных концентрациях индуцировала уменьшение экспрессии мРНК IFN- . Наибольшее уменьшение экспрессии (снижение на 80%) имело место при обработке DMPP в концентрации 40 мкМ.

Фигура 8: а) экспрессию CD80 индуцировали либо обработкой LPS (38%), либо антигеном SR (35%). Обработка никотином (40 мкМ в течение 48 ч) снижала экспрессию в стимулированных LPS клетках на 20% и в стимулированных SR клетках на 26%; b) экспрессию CD80 индуцировали либо обработкой LPS (38%), либо антигеном SR (35%). Обработка DMPP (40 мкМ в течение 48 ч) снижала экспрессию в стимулированных LPS клетках на 17% и в стимулированных SR клетках - на 20%.

Фигура 9: экспрессия мРНК IFN- в лимфоцитах, выделенных из бронхоальвеолярного лаважа (BAL), проведенного у пациентов с НР. Обработка DMPP снижала экспрессию IFN- в этих клетках.

Фигура 10: экспрессия CD86 в общей клеточной фракции, выделенной из BAL, проведенного у здорового человека. Клетки, которые обработали DMPP, экспрессировали CD86 на 50% ниже по сравнению с необработанными клетками.

Фигура 11: клетки из BAL от обработанных DMPP, никотином и эпибатидином мышей. Обработка никотином и эпибатидином приводила к достоверному подавляющему действию на индуцированное SR воспаление через 24 ч.

Фигура 12: было установлено достоверное подавляющее действие DMPP на воспаление легких при увеличении числа животных в опыте.

Фигура 13: уровни TNF в BAL обработанных DMPP мышей. DMPP достоверно снижал концентрацию TNF в BALF.

Фигура 14: влияние внутрибрюшинного введения DMPP в возрастающих дозах на общее накопление клеток в BAL, проведенном у мышей с астмой. Количество клеток было значительно выше у мышей при стимуляции OVA и без обработки. Введение DMPP в дозах 0,5 и 2,0 мг/кг приводило к достоверному снижению числа клеток.

Фигура 15: дифференциальное число клеток в зависимости от дозы. У мышей при стимуляции OVA (OVA OVA) было обнаружено больше эозинофилов и лимфоцитов в BAL по сравнению с контрольной группой (sal sal). Введение DMPP приводило к достоверному снижению числа эозинофилов и лимфоцитов в BAL во всех группах (n=8; р<0,05).

Фигура 16: влияние ответной реакции после второй дозы при обработке DMPP в/б на общее накопление клеток в BAL у мышей с астмой. Количество клеток было значительно выше у мышей при стимуляции OVA и без обработки. Введение DMPP в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг приводило к достоверному снижению общего числа клеток.

Фигура 17: дифференциальное число клеток после введения второй дозы. Введение DMPP в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг приводило к достоверному снижению эозинофилов и лимфоцитов, доза 0,5 мг/кг была наиболее эффективной для проявления противовоспалительного действия DMPP.

Фигура 18: концентрации IL-5 в BAL у контрольных мышей, мышей с астмой и обработанных мышей. Стимуляция OVA повышала концентрацию IL-5 в BAL, в то время как введение DMPP группе мышей в дозе 0,5 мг/кг приводило к достоверному снижению концентраций IL-5.

Фигура 19: резистентность легких после введения метахолина у нормальных мышей, мышей с астмой и мышей с астмой, но обработанных DMPP в дозе 0,5 мг/кг интраназально. Очевидно, что DMPP приводит к снижению % прироста резистентности легких по сравнению с астматическими мышами.

Фигура 20: отделяли провокационную дозу стимуляции при 200% резистентности легких (РС200). Введение DMPP приводило к достоверному снижению РС200 у обработанных мышей по сравнению с астматическими мышами (р=0,04; n=6).

Фигура 21: экспрессию мРНК IL-4 индуцировали 24 ч стимуляцией LPS. Данные представлены, как описано для фиг.5. Клетки обрабатывали различными концентрациями (40-160 мкМ никотина и DMPP). Обработка никотином приводила к уменьшению экспрессии мРНК IL-4 (снижение экспрессии на 90% в группе с концентрацией 40 мкМ). Обработка DMPP приводила к полному блокированию экспрессии мРНК IL-4 в стимулированных LPS клетках при всех концентрациях.

Фигура 22: действие DMPP на трансмиграцию эозинофилов крови. DMPP индуцировал зависимое от дозы подавление трансмиграции эозинофилов через искусственную базальную мембрану.

Фигура 23: действие мекамиламина, антагониста никотина, на подавляющий трансмиграцию эозинофилов крови эффект DMPP. Мекамиламин «снимал» действие DMPP, на основании чего можно предположить, что для ингибирующего эффекта DMPP необходима активация никотиновых рецепторов.

Фигура 24: действие других агонистов никотина на трансмиграцию эозинофилов крови. Никотин, эпибатидин и цитозин снижали трансмиграцию эозинофилов крови.

Фигура 25: действие DMPP на экспрессию мРНК коллагена 1А в нормальных человеческих фибробластах легких. DMPP снижал экспрессию мРНК коллагена 1А в зависимости от дозы.

Фигура 26: действие никотина на экспрессию мРНК коллагена 1А в человеческих фибробластах легких. Никотин снижал экспрессию мРНК коллагена 1А в концентрации 1 и 10 мкМ, в то время как в более высоких концентрациях ингибирующее действие не проявлялось.

Фигура 27: действие эпибатидина, другого агониста никотина, на экспрессию мРНК коллагена 1А в человеческих фибробластах легких. Эпибатидин также обладал ингибирующим эффектом на экспрессию мРНК коллагена 1А.

Описание предпочтительных воплощений

Наличие никотиновых рецепторов в клетках воспаления и легких было описано ранее. Однако новизна настоящего изобретения заключается в установлении того, что агонисты никотиновых рецепторов являются пригодными для лечения воспалительных заболеваний легких, и в связанном с этим установлении противовоспалительных и иммуносупрессорных свойств агонистов никотина, особо направленных против механизма патогенеза таких воспалительных заболеваний легких как астма, НР, саркоидоз, ВООР, IPF и COPD. Примером этого является действие дыма сигарет на экспрессию костимулирующих молекул В7.

Для изучения действия агонистов никотина при воспалительных заболеваниях легких использовали две модели на животных: модель НР и модель астмы. На обеих этих моделях исследовали влияние агонистов никотиновых рецепторов (как избирательных, так и неизбирательных) на физиологию легких и воспаление. Проводили опыты in vitro с использованием выделенных клеток воспаления, полученных в опытах на животных, или от пациентов, а также промышленно доступных клеточных линий для попытки понять механизм, с помощью которого агонисты никотина подавляют воспаление.

Первоначально опыты проводили с неспецифическими агонистами, т.е. агонистами, которые связываются со всеми субъединицами никотиновых рецепторов (никотин, диметилфенилпиперазиний (DMPP) и эпибатидин [13, 42]. Специфический агонист 4-субъединицы, цитизин [42], также тестировали для проверки того, может ли обладать специфическая стимуляция противовоспалительным действием.

Для целей настоящей заявки термин «животное» предназначен для обозначения людей, приматов, домашних животных (таких как лошади, коровы, свиньи, козы, овцы, кошки, собаки, морские свинки, мыши и т.д.) и других животных. Как правило, данный термин используется для обозначения живых существ, имеющих хорошо развитую кровеносную систему.

Для целей настоящего изобретения агонисты или средства (агенты) представляют собой молекулы или соединения, которые связываются и модулируют функцию никотиновых рецепторов. Предпочтительные средства являются специфическими для рецепторов и не проходят через гематоэнцефалический барьер, например, такие как DMPP. Пригодные средства можно найти в многочисленных химических классах, хотя, как правило, они являются органическими соединениями и предпочтительно - малыми органическими соединениями. Малые органические соединения имеют молекулярную массу более 150, менее 4500, предпочтительно менее чем примерно 1500, более предпочтительно менее чем примерно 500. Примерные группы включают в себя пептиды, сахариды, стероиды, гетероциклические, полициклические, замещенные ароматические соединения и тому подобное.

Выбранные агенты могут быть модифицированы для повышения эффективности, стабильности и фармацевтической совместимости и тому подобное. Для идентификации, получения или скрининга дополнительных средств можно использовать структурную идентификацию агента. Например, если пептидные агенты идентифицированы, их можно модифицировать различными путями, описанными выше, например, повысить их протеолитическую стабильность. Другие методы стабилизации могут включать в себяинкапсулирование, например, в липосомы и т.д. Данные связывающие агенты готовят любым подходящим способом, известным специалистам в данной области.

Для терапевтического применения средства, влияющие на функцию никотиновых рецепторов, можно вводить любыми подходящими путями. Небольшие молекулы предпочтительно вводят перорально; другие композиции и средства предпочтительно вводят парентерально, соответственно в фармацевтически или физиологически приемлемом носителе, например в забуференном фосфатом физиологическом растворе или тому подобное. Как правило, композиции вводят в физиологическую жидкость, такую как кровь или синовиальная жидкость.

В качестве примеров, многие такие терапевтические средства можно непосредственно вводить в виде инъекций или инфузий, местно, интратрахеально/интраназально, например, с помощью аэрозоля, внутриокулярно или внутри/на имплантатах (таких как коллаген, осмотические насосы, трансплантаты, включая соответствующим образом трансформированные клетки, и т.д.) с лечебными пептидами. Как правило, вводимое количество будет определяться эмпирически, обычно оно заключено в пределах примерно от 10 до 1000 мкг/кг массы реципиента. Для средств на основе пептидов концентрация обычно будет составлять примерно от 50 до 500 мкг/мл вводимой дозы. Могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, бактерициды и т.д. Данные добавки будут находиться в обычно применяемых количествах.

Агонисты никотина не заменят все лекарственные препараты, которые в настоящее время применяются для лечения воспалительных заболеваний легких и обструкции дыхательных путей, которая часто связана с этими заболеваниями. Бронходилятаторы остаются пригодными для немедленного снятия бронхоспазмов. Однако бронходилятаторы не оказывают влияния на лежащую в основе причину заболевания или воспаление.

Кортикостероиды являются эффективными противовоспалительными препаратами. Их системное применение вызывает серьезные побочные эффекты, которые исключают их длительное применение, там, где это возможно. Вводимые путем ингаляции, плохо всасывающиеся стероиды применяют для лечения воспаления дыхательных путей. В низких дозах данные лекарственные средства, если и вызывают побочные реакции, то весьма незначительные. Однако при введении в более высоких дозах возрастает риск возникновения кандидоза ротовой полости, паралича голосовых связок, катаракты и остеопороза. Вводимые ингаляционно стероиды не оказывают воздействия на интерстиций легких и не обладают антифиброзными свойствами [57].

Появившиеся позднее лекарственные препараты, такие как антилейкотриены, в некоторых случаях пригодны при астме [58], но они не оказывают влияния на COPD и другие заболевания легких. Данные лекарственные препараты обладают противовоспалительными свойствами, ограничивающимися компонентами воспаления, вызванными лейкотриенами [59]. Лечение интерстициальных заболеваний легких, таких как IPF, саркоидоз, НР и ВООР в основном основывается на применении системных кортикостероидов. Данное лечение эффективно для борьбы с некоторыми видами воспаления, но, к сожалению, оно приводит к проявлению серьезных побочных эффектов и не снимает лежащие в основе фиброзные изменения. В некоторых случаях при тяжелом IPF пытались применять иммуносупрессоры, такие как циклофосфамид и азатиоприн, но их терапевтическое значение не доказано и в лучшем случае очень ограничено [60]. В сущности, фиброз легких обычно прогрессирует и не поддается лечению, и большинство пациентов с IPF умирают в результате этого заболевания [61].

Агонисты никотина могут быть пригодны в качестве дополняющего или замещающего стероиды препарата. При целенаправленной доставке к фагоцитам легких данные препараты могут быть полезны для борьбы с воспалением дыхательных путей и интерстициальным воспалением. Одним из основных преимуществ агонистов никотина по сравнению с кортикостероидами, помимо того, что они проявляют меньше побочных эффектов, является то, что данные агонисты обладают непосредственным действием на фибробласты, и, следовательно, могут предупреждать или останавливать фиброз в дыхательных путях и легких, что не могут делать кортикостероиды. Интерстициальный фиброз является признаком заболевания в случае IPF, основным последствием в случае НР и саркоидоза, и фиброз органов дыхательной системы практически всегда обнаруживают при астме [57].

В качестве потенциальных новых лекарственных препаратов для лечения воспалительных заболеваний легких активно исследовались другие вещества. Особое внимание было уделено многим цитокинам (например, IL-5, IL-13, IL-16...) [62]. Предполагается, что в результате сложности путей, участвующих в воспалении, вряд ли любой какой-нибудь специфический цитокин или другой медиатор воспаления будет оказывать существенное влияние на лечение данных заболеваний легких. Агонисты никотиновых рецепторов, в отличие от кортикостероидов, имеют то преимущество, что они направлены против широкого спектра воспалительных ответных реакций. Это лежит в основе их активности при лечении воспалительных заболеваний легких.

Примеры

I - Воспаление наподобие гиперчувствительности

Действие агонистов никотина на хронически индуцируемый гиперчувствительный пневмонит (НР) у мышей.

Пример 1: опыт с НР in vivo

Гипотеза заключается в том, что стимуляция никотиновых рецепторов никотином снижает иммунный ответ на антигены НР посредством подавления цитокинов воспаления и ингибирования специфической опосредуемой антигенами активации клеток.

Данную модель выбрали потому, что, как было упомянуто выше, частота возникновения НР у курильщиков ниже, чем у некурящих людей [50], а также потому, что данная модель хорошо описана. НР индуцировали путем введения антигена Saccharopolyspora rectivirgula (SR), возбудителя такого заболевания как «легкое фермера» [51], формы НР. Мышей одновременно обрабатывали внутрибрюшинно (в/б) никотином в дозах в пределах от 0,5 до 2,0 мг/кг, дважды в день. Введение никотина значительно снижало общее число клеток, обнаруженных в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) у данных мышей. Лимфоциты представляли собой популяцию, на которую обработка никотином оказывала наибольшее влияние (фиг.1). Из легких выделяли макрофаги и лимфоциты и стимулировали антителами против CD3 + рекомбинантного IL-2. Определяли продукцию данными клетками мРНК IFN- , цитокина, который, как известно, участвует в развитии НР и других воспалительных заболеваний легких [52]. В клетках животных, обработанных никотином, имелась достоверно более низкая экспрессия мРНК IFN- по сравнению с клетками необработанных животных (фиг.2).

Пример 2: опыты in vitro, в которых показано влияние агонистов никотина на экспрессию цитокинов.

Для дальнейшего выяснения механизма супрессорного эффекта никотина на модели in vivo использовали клеточную линию альвеолярных макрофагов.

Исследовали влияние обработки никотином или DMPP на клетки АМJ2-С11 в отношении экспрессии мРНК TNF- , IL-10 с помощью RT-ПЦР. Данные цитокины принимают участие в развитии воспалительных заболеваний легких, таких как НР, астма и саркоидоз [52-55]. Обработка никотином и DMPP приводила к значительному снижению экспрессии мРНК TNF (снижение экспрессии на 98% в стимулированных LPS и обработанных 40 мкМ никотина), но эффект не зависел от концентрации (фиг.3). Аналогичные результаты получали на клетках, стимулированных SR (фиг.4). Подобную не зависящую от концентрации ответную реакцию можно объяснить десенсибилизацией никотиновых рецепторов в результате большого количества агониста в среде. Обработка никотином и DMPP также оказывала влияние на экспрессию мРНК IL-10. Наибольшее снижение имело место при концентрации никотина, равной 40 мкМ (на стимулированных LPS клетках; снижение экспрессии мРНК на 88%; фиг.5), и при концентрации DMPP, равной 80 мкМ (на стимулированных SR клетках; снижение экспрессии мРНК на 87%; фиг.6). Вновь эффект не зависел от концентрации.

Другую клеточную линию макрофагов (RAW 264.7, АТСС) использовали для исследования влияния DMPP на экспрессию IFN-(с помощью RT-ПЦР, поскольку клетки AMJ2-С11 не экспрессируют мРНК IFN- (данные не представлены). Клетки стимулировали антигеном SR в концентрации 50 мкг/мл и инкубировали в присутствии DMPP в концентрациях в пределах от 40 до 160 мкМ. Обработка DMPP в концентрации 40 мкМ снижала экспрессию INF- в данных клетках до 75% (фиг.7). Вновь эффект, по-видимому, не зависел от концентрации.

Пример 3: влияние агонистов никотина на экспрессию костимулирующих молекул в условиях in vitro

Исследовали влияние никотина и DMPP на экспрессию молекул В7 (СD80) в условиях in vitro. Клетки AMJ2-С11 (мышиные альвеолярные макрофаги из АТСС) инкубировали с 40 мкМ никотина или DMPP, и стимулировали LPS (0,1 мкг/мл) или антигеном SR (50 мкг/мл) в течение 48 ч. Процент экспрессии CD80 в обработанных клетках составлял примерно половину от уровня экспрессии в стимулированных LPS и SR, но не в обработанных, клетках (фиг.8(а) и (b)).

Пример 4: изучение человеческих клеток в BAL (АМ и лимфоцитов)

Поскольку ставилась цель лечить пациентов с помощью DMPP или подобных препаратов, то оценивали действие данного препарата на лимфоциты пациентов с НР. Проводили BAL у пациентов с НР. Лимфоциты отделяли от других клеток, находящихся в BAL, стимулировали РНА и инкубировали DMPP. Определяли зависимость эффекта DMPP от концентрации на продукцию мРНК цитокинов (с помощью RT-ПЦР) в отношении IFN- (фиг.9).

Проводили лаваж бронхов и альвеол у здоровых людей, и выделяли альвеолярные макрофаги. Вновь было показано, что в стимулированных SR и обработанных никотином или DMPP клетках экспрессия CD86 составляла примерно половину от этого показателя в случае необработанных клеток (фиг.10).

Пример 5: исследование влияния других агонистов никотина на кратковременно индуцированное SR острое воспаление

Интраназальная инстилляция антигенов Saccharopolyspora rectivirgula (SR), возбудителя заболевания «легкое фермера», мышам вызывает выраженную воспалительную ответную реакцию в легких. Нейтрофилы являются первыми клетками воспаления, которые появляются в месте воспаления. Обработка мышей DMPP (0,5 мг/кг), никотином (0,5 мг/кг) и эпибатидином (2 мкг/кг) оказывала выраженное подавляющее действие на индуцированное SR воспаление (фиг.11). Агонисты никотина вводили интраназально в объеме 50 мкл каждые 6 ч и мышей убивали через 24 ч после инстилляции SR.

Наблюдали значительное ингибирующее действие никотина и эпибатидина, но не DMPP. Однако при увеличении числа мышей, обработанных или не обработанных DMPP, до 15, авторы установили достоверное подавляющее воздействие по сравнению с необработанной группой (фиг.12).

Концентрации TNF (цитокина провоспаления) были ниже в лаваже бронхов и альвеол у обработанных DMPP мышей (фиг.13), что указывает на то, что подавление воспаления могло иметь место в результате снижения концентрации TNF.

II - Воспаление наподобие воспаления при астме

Пример 6: модель астмы in vivo

Подобные опыты проводили на сенсибилизированных яичным альбумином мышах. DMPP, как утверждают, подавляет как воспалительную ответную реакцию, так и гиперреактивность на вдыхаемые аллергены и метахолин.

Группы мышей Balb/c сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 20 мкг яичного альбумина (альбумин из куриных яиц; Sigma-Aldrich), эмульгированного в 2 мг гидроокиси алюминия в PBS. Через 4 недели стимулирующие дозы OVA 1,5%/50 мкл вводили интраназально. Стимуляцию проводили ежедневно в течение 3 дней и затем мышей обследовали на наличие аллергического воспаления легких через 24 ч после последней аэрозольной обработки. Группы мышей обрабатывали DMPP в различных концентрациях во время периода стимуляции. Проводили лаваж бронхов и альвеол (BAL) и жидкость центрифугировали при 400g для отделения клеток от жидкости (фиг.14, 15, 16 и 17).

Супернатанты использовали для определения концентрации IL-5 в легких. Определяли общее число клеток в жидкости после BAL и проводили их дифференциальный анализ (фиг.18).

Эксперимент повторяли с оптимальной концентрацией DMPP для оценки реактивности дыхательных путей.

Определение AHR

Определяли гиперреактивность дыхательных путей (AHR) в ответ на воздействие метахолина у мышей, находящихся под наркозом, с трахеотомией и вентиляцией легких с использованием вентилятора с компьютерной регуляцией (Flexi VENT).

Через яремную вену вводили метахолин в возрастающих дозах (0 мг/кг-32,5 мг/кг)(фиг.19, 20).

Пример 7: влияние обработки агонистами на экспрессию мРНК IL-4

Также исследовали влияние обработки агонистами на экспрессию мРНК IL-4, цитокина, который, как хорошо известно, принимает участие в развитии астмы (53). Никотин в концентрации 40 мкМ снижал экспрессию мРНК IL-4 до 92% (фиг.9). DMPP полностью блокировал экспрессию мРНК IL-4 (фиг.21). Как было показано ранее, экспрессия мРНК IL-4 отсутствовала, когда клетки стимулировали антигеном SR (данные не представлены).

Пример 8: действие различных агонистов на трансмиграцию эозинофилов.

Для дальнейшего изучения влияния агонистов никотина на подавление воспаления при астме заявители исследовали действие различных агонистов на трансмиграцию эозинофилов.

Инфильтрация эозинофилами и другими клетками воспаления в тканях легких является важным признаком астмы и причиной воспаления и гиперреактивности дыхательных путей. Прохождение клеток воспаления из кровотока в легкие связано с прохождением через сосудистый эндотелий, базальную мембрану и составляющие компоненты внеклеточного матрикса. Клетки воспаления проходят через базальную мембрану, продуцируя протеиназы. В данных предварительных опытах in vitro заявители исследовали влияние различных агонистов никотина на миграцию выделенных из крови эозинофилов через искусственную базальную мембрану (покрытая Matrigel® камера для хемотаксиса). DMPP приводил к зависимому от концентрации снижению трансмиграции эозинофилов (фиг.22), в то время как данный эффект снимался антагонистом мекамиламином (MEC) (фиг.23). Затем данное ингибирующее действие было установлено для других агонистов никотина, включая сам никотин, эпибатидин и цитозин (фиг.24). Данные выражены в виде процента ингибирования (обработанные агонистом клетки) по сравнению с контролем без агонистов.

На основании этих данных можно предположить, что агонисты никотина подавляют синтез или активацию протеиназ, которые разрушают компоненты базальной мембраны, ингибируя, таким образом, миграцию эозинофилов в слизистую легких.

Пример 9: влияние агонистов никотина на продукцию коллагена

Для астмы характерны структурные изменения дыхательных путей, включая субэпителиальное отложение коллагена, что может быть причиной хронического течения заболевания. Нарушение баланса между синтезом коллагена и его деградацией фибробластами может иметь место при этом процессе [56]. В предварительных опытах заявители исследовали действие агонистов никотина на синтез коллагена А1, продуцируемого первичными нормальными фибробластами. Экспрессию гена коллагена А1 оценивали с помощью RT-ПЦР.

Данные выражены в виде экспрессии гена в процентах в обработанных агонистами клетках по сравнению с необработанными клетками.

DMPP подавлял экспрессию гена коллагена А1 в зависимости от концентрации (фиг.25). Никотин оказывал незначительное ингибирующее действие в концентрациях 1 и 10 мкМ, в то время как при более высоких концентрациях эффект отсутствовал (фиг.26), возможно, за счет десенсибилизации рецепторов. Возможно, для достижения ингибирования необходимы более низкие концентрации, и в последующем они будут тестированы. Ингибирование также наблюдали под действием эпибатидина (фиг.27).

Несмотря на то, что настоящее изобретение описано выше в виде его предпочтительных воплощений, его можно модифицировать, не отступая от сущности и природы данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.



ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ облегчения или профилактики воспалительного легочного заболевания, выбранного из группы, состоящей из астмы, интерстициального фиброза легких (IPF), саркоидоза, гиперчувствительного пневмонита (HP), хронического HP и облитерирующего бронхиолита с организующейся пневмонией (ВООР), предусматривающий введение агониста никотинового рецептора, выбранного из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина и их производных.

2. Способ по п.1, где указанное воспалительное легочное заболевание представляет собой астму.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный агонист выбран из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанный агонист является диметилфенилпиперазинием (DMPP).

5. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно предусматривающий введение других агентов, способных облегчить или предупредить воспалительные заболевания.

6. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно предусматривающий введение других агентов, выбранных из бронходилятаторов, кортикостероидов, анти-лейкотриена и иммуносупрессивных агентов.

7. Способ по любому из пп.1-6, где указанный агонист представлен в виде лекарственной формы для перорального введения, непосредственно для введения путем инъекции или инфузии, для местного, внутритрахеального/назального или ингаляционного введения.

8. Применение агониста никотиновых рецепторов, выбранного из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина и их производных, при производстве лекарственного средства для облегчения или профилактики воспалительного легочного заболевания, выбранного из группы, состоящей из астмы, интерстициального фиброза легких (IPF), саркоидоза, гиперчувствительного пневмонита (HP), хронического HP и облитерирующего бронхиолита с организующейся пневмонией (ВООР).

9. Применение по п.8, где указанное воспалительное заболевание представляет собой астму.

10. Применение по п.8 или 9, где указанный агонист выбран из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина.

11. Применение по любому из пп.8-10, где указанный агонист является диметилфенилпиперазинием (DMPP).

12. Применение по любому из пп.8-11, согласно которому дополнительно предусмотрены другие средства, способные облегчать или предупреждать воспалительные заболевания.

13. Применение по любому из пп.8-11, согласно которому дополнительно предусмотрены другие средства, выбранные из бронходилятаторов, кортикостероидов, анти-лейкотриена и иммуносупрессивных агентов.

14. Применение по любому из пп.8-12, где указанное средство представлено в виде лекарственной формы для перорального введения, непосредственно для введения путем инъекции или инфузии, для местного, внутритрахеального/назального или ингаляционного введения.

15. Применение по любому из пп.8-12, где указанный агент облегчает или предупреждает астму путем целенаправленного воздействия на никотиновые рецепторы, участвующие в воспалении, гиперреактивности бронхов или (фиброзного) перерождения бронхов, ассоциированных с астмой.

16. Способ облегчения или профилактики воспалительного ответа и гиперчувствительности дыхательных путей, ассоциированных с астмой, предусматривающий введение агониста никотинового рецептора, выбранного из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина и их производных.

17. Способ по любому из пп.16-17, где указанный агонист выбран из никотина, диметилфенилпиперазиния (DMPP), эпибатидина и цитизина.

18. Способ по любому из пп.16-18, где указанный агонист представляет собой диметилфенилпиперазиний (DMPP).

19. Способ по любому из пп.16-19, дополнительно предусматривающий введение других агентов, способных облегчить или предупредить воспалительные заболевания.

20. Способ по любому из пп.16-19, дополнительно предусматривающий введение других агентов, выбранных из бронходилятаторов, кортикостероидов, анти-лейкотриена и иммуносупрессивных агентов.

21. Способ по любому из пп.16-19, где указанный агонист представлен в виде лекарственной формы для перорального введения, непосредственно для введения путем инъекции или инфузии, для местного, внутритрахеального/назального или ингаляционного введения.