ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА, СОДЕРЖАЩИЙ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА АНТАГОНИСТ IL-6

ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА, СОДЕРЖАЩИЙ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА АНТАГОНИСТ IL-6


RU (11) 2195960 (13) C2

(51) 7 A61K39/395, A61K38/19, C07K16/28 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.01.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000126295/14 
(22) Дата подачи заявки: 1999.03.16 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.03.16 
(31) Номер конвенционной заявки: 10/67250 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1998.03.17 
(33) Страна приоритета: JP 
(43) Дата публикации заявки: 2002.09.10 
(45) Опубликовано: 2003.01.10 
(56) Аналоги изобретения: JP-7-324097 А, 12.12.1995. JP-8-311098 А, 26.11.1996. JP-8- 245414 А, 24.09.1996. JP-9-235276 А, 09.09.1997. 
(71) Имя заявителя: ТУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ (JP); КИСИМОТО Тадамицу (JP) 
(72) Имя изобретателя: КИСИМОТО Тадамицу (JP); ИТО Хироаки (JP); ЯМАМОТО Мицунари (JP) 
(73) Имя патентообладателя: ТУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ (JP); КИСИМОТО Тадамицу (JP) 
(74) Патентный поверенный: Ятрова Лариса Ивановна 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2000.10.17 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: JP 99/01298 (16.03.1999) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 99/47170 (23.09.1999) 
(98) Адрес для переписки: 103735, Москва, ул.Ильинка, 5/2, ООО "Союзпатент", пат.пов. А.П.Агурееву 

(54) ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА, СОДЕРЖАЩИЙ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА АНТАГОНИСТ IL-6 

Изобретение относится к медицине и касается профилактического или терапевтического агента для лечения такого воспалительного заболевания кишечника, как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит, причем такой агент включает в качестве активного ингредиента такой антагонист интерлейкина-6 (IL-6), как антитело против рецептора IL-6. Преимущество изобретения заключается в разработке нового метода лечения вышеуказанных заболеваний, заключающийся в ингибированной активности цитокиков. 4 с. и 18 з.п. ф-лы, 1 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к профилактическому или терапевтическому агенту для лечения воспалительного заболевания кишечника, содержащему антагонист интерлейкина-6 (IL-6) в качестве активного ингредиента. Кроме этого, настоящее изобретение относится к профилактическому или терапевтическому агенту для лечения болезни Крона или язвенного колита, содержащему IL-6 антагонист в качестве активного ингредиента. 

Уровень техники

IL-6 представляет собой цитокин, называемый также В-клеточным стимулирующим фактором 2 (BSF2) или интерфероном 2. IL-6 был открыт, как фактор дифференцировки, принимающий участие в активации В-лимфоцитных клеток (Hirano. T с сотр. , Nature (1986) 324, 73-76). Позже был обнаружен многофункциональный цитокин, оказывающий влияние на различные клеточные функции (Akira, S. с сотр., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78). Имеется сообщение о том, что IL-6 индуцирует созревание Т-лимфатических клеток (Lotz, М. с сотр. , J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258). 

IL-6 передает свой биологический сигнал через два белка к клетке. Один из них служит рецептором IL-6, т.е. IL-6-связывающим белком с молекулярным весом порядка 80 кД (Тада, Т. с сотр., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, К. с сотр., Science (1987) 241, 825-828). IL-6 рецептор существует не только в связанной с мембраной форме с трансмембранным доменом, экспрессированным на поверхности клетки, но и в виде растворимого IL-6 рецептора, главным образом, состоящего из внеклеточной области. 

Другой белок представляет собой связанный с мембраной gp130, с молекулярным весом около 130 кД, принимающий участие в трансдукции несвязанного с лигандом сигнала. IL-6 и рецептор IL-6 образуют IL-6/ IL-6-рецепторный комплекс, который после связывания с gp130 передает свой биологический сигнал клетке (Тада, Т. с сотр., Cell (1989) 58, 573-581). 

Антагонисты IL-6 представляют собой вещества, ингибирующие трансдукцию биологической активности IL-6. В качестве антагонистов IL-6 к настоящему времени известны антитело против IL-6 (aнти-IL-6 антитело), антитело против рецептора IL-6 (анти-IL-6 рецепторное антитело) и антитело против gр130 (анти-gр130 антитело), измененный IL-6, частные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 и т.п. 

Анти-IL-6 рецепторное антитело описано в нескольких работах (Novick D. с сотр. , Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y.W. с сотр., Hybridoma (1993) 12, 621-630, опубликованная международная заявка WO 95/09873, заявка на патент Франции FR 2694767, патент США 521628). Известно, что очеловеченное (гуманизированное) антитело РМ-1 получают трансплантацией гипервариабельного участка (CDR) мышиного антитела РМ-1 (Hirata, Y. с сотр., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906) на человеческое матричное антитело (Международная патентная публикация WO/92-19759). 

Воспалительное заболевание кишечника (IBD) представляет собой неспецифическое воспаление, примерами которого может служить язвенный колит и болезнь Крона. Иммунологические нарушения проявляются в начале болезни, но это не приводит к выяснению этиологии. Однако, предполагается, что моноциты и лимфоциты, кластеризующиеся на поврежденных участках, принимают участие в повреждениях слизистой оболочки и в этой связи особое внимание уделяется медиаторам воспалительных процессов, особенно цитокинам (например, IL1, TNF и IL-6). 

В том, что касается IL-6, как медиаторов воспалений, обращается внимание на их взаимосвязь со статусом заболевания или на возможность выполнения ими функций специфического показателя IBD. Уровень содержания IL-6 в сыворотке повышен как в случае болезни Крона, так и язвенного колита, и этот уровень коррелирует с состоянием заболевания (Holtkamp, W. с сотр., J.Clin.Gastroenterology (1995) 20, 123-126, Niederau, С., с сотр., Hepato-Gastroenterology (1997) 44, 90-107). Измерение количества мРНК IL-6 в ткани в виде продуктов PCR (цепной полимеразной реакции) позволило обнаружить, что это количество хорошо коррелирует со статусом заболевания как в случае язвенного колита, так и болезни Крона (Stevens, С. с сотр., Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826. При увеличении продукции IL-6 в ходе активной стадии IBD анализировали механизм процесса и было установлено, что степень продуцирования, в том случае, когда моноядерные клетки в собственной пластинке (lamina propria) стимулируются митогеном Pokeweed, хорошо коррелирует с состоянием болезни (Reinecker, H, -С. с сотр., Clin.Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181). 

После этого, корреляцию между продуцированием IL-6 и статусом болезни наблюдали в культуре моноядерных клеток производных из lamina propria и в тканевой культуре слизи пациентов. В первом случае, было также показано, что число клеток, продуцирующих IL-6 в слизистой ткани, также возрастает. Среди мононуклеарных клеток наиболее важными клетками, продуцирующими IL-6, являются макрофаги, и было установлено, что имеется большое число СD68-позитивных макрофагов, которые бурно продуцируют IL-6 в собственной пластинке пациентов с IBD в активной стадии (Kusugami, К. с сотр., Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949-959). 

Было также обнаружено, что продуцирование IL-6 коррелирует с эндоскопическими наблюдениями пациентов, страдающих болезнью Крона (Reimund, J.-M. с сотр. . Gut (1996) 39, 684-689). Кроме этого, было обнаружено, что не только концентрация IL-6, но и концентрация рецептора IL-6 в сыворотке хорошо коррелируют со статусом заболевания (Mitsuyama, К. с сотр.. Gut (1995) 36, 45-49). 

Также известно, что в случае медиаторов воспалительного состояния, отличных от IL-6, степень продуцирования, например, IL-l также коррелирует с состоянием заболевания. С другой стороны, это не всегда справедливо для TNF- и в этом случае, степень продуцирования может иметь тенденцию к увеличению при низкой активности болезненного состояния (Reinecker,H - С. с сотр. , Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174-181, Reimund, J. - M. с сотр., Gut (1996) 39, 684-689). 

Современный метод лечения IBD заключается в комбинации диеты и медикаментов, причем в качестве последних были описаны салазосульфапиридин, глюкокортикоид и т.п. Однако, в случае применения этих медикаментов, некоторые пациенты не переносят эти лекарства из-за их побочных эффектов, в связи с чем возникают проблемы, касающиеся длительности применения. 

С другой стороны, проводился ряд опытов в качестве нового метода лечения IBD, цель которых состояла в улучшении состояния заболевания в результате ингибирования активности цитокинов. Основными мишенями таких исследований служили IL-1 и TNF- (Van Deventer, S.J.H. Gut (1997) 40, 443-448); причем IL-1, антагонист рецептора IL-1 (Cominelli F. с сотр., Gastroenterology (1992) 103, 65-71 и ингибитор IL-1, CGP47969A (Casini-Raggi с сотр., Gastroenterology (1995) 109, 812-818) и аналогичные объекты проходят клиническое исследование или экспериментальное изучение на животных. В случае TNF-, специфическое моноклональное антитело применяли на пациентах с болезнью Крона, и при этом наблюдали пониженную активность и залечивание язвы (Van Dullemen, H. M. с сотр., Gastroenterology (1995) 109, 129-135). Однако, до настоящего времени не было известно, что антагонист IL-6 способен излечивать IBD и специфически подавлять биологическую активность IL-6. 

Описание изобретения. 

Цель настоящего изобретения заключается в разработке профилактического или терапевтического агента для воспалительного заболевания кишечника, причем указанный агент свободен от указанных выше недостатков. 

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает (1) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий антагонист IL-6 в качестве активного ингредиента. 

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (2) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента. 

Настоящее изобретение также предусматривает (3) профилактический или терапевтический агент для воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента. 

Настоящее изобретение также предлагает (4) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6, предпочтительно, представляет собой антитело РМ-1. 

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (5) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6, предпочтительно, представляет собой антитело MR16-1. 

В настоящем изобретении, также предлагается (6) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий рекомбинантное антитело против рецептора IL-6, в качестве активного ингредиента. Такое рекомбинантное антитело против рецептора IL-6, предпочтительно имеет константную область (С область) человеческого антитела. 

Настоящее изобретение предусматривает также (7) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий химерное или очеловеченное антитело против рецептора IL-6 в качестве активного ингредиента. 

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает также (8) профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий в качестве активного ингредиента гуманизированное антитело РМ-1. 

Настоящее изобретение предусматривает также (9) профилактический или терапевтический агент для лечения болезни Крона или язвенного колита, включающий в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (1)-(8). 

Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает (10) агент для подавления потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, причем указанный агент включает в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (1)-(8). 

Настоящее изобретение предусматривает также (11) агент для подавления потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, причем указанный агент включает в качестве активного ингредиента антагонист IL-6, описанный выше в пунктах (3)-(8). 

Описание предпочтительного варианта осуществления изобретения

В качестве антагонистов IL-6, используемых в настоящем изобретении, могут применяться соответствующие объекты любого происхождения, любого вида и любой формы, при условии наличия у них профилактического или терапевтического эффекта при лечении воспалительного заболевания кишечника, или эффекта контроля потерь веса при воспалительном заболевании кишечника. 

Антагонисты IL-6 блокируют трансдукцию сигнала от IL-6 и ингибируют биологическую активность IL-6. В качестве примеров антагонистов IL-6 предпочтительно следует отметить анти-Il-6-антитело, антитело к IL-6-рецептору, антитело к gр130, измененный IL-6, рецептор измененного растворимого IL-6, частичный пептид IL-6 или рецептора IL-6, а также вещества с низким молекулярным весом, обладающие аналогичной активностью. 

Анти-IL-6-антитела, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител, с использованием известного способа. В качестве антител к IL-6, предназначенных для применения в настоящем изобретении, особенно предпочтительными являются антитела млекопитающих. Моноклональные антитела такого происхождения включают такие вещества, которые продуцируются гибридомами, а также рекомбинантные антитела, продуцируемые клеткой хозяина, которую трансформировали с помощью вектора экспрессии, содержащего гены антитела, полученные методами генной инженерии. Такие антитела, в результате связывания с IL-6, блокируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, вследствие этого, блокируют трансдукцию сигнала биологической активности IL-6 в клетку. 

Примерами таких антител могут служить МН166 (Matsuda с сотр., Eur.J.Immunol. (1988) 18, 951-956) и SK2 антитело (Sato. К. с сотр.. The 21-st Nihon Mennekigakkai Soukai (Общий конгресс Японского иммунологического общества), Academic Record (1991) 21, 166) и т.п. 

Гибридома, продуцирующая антитело анти-IL-6, может быть, в основном, сконструирована с использованием известного способа, описанного ниже. Так например, IL-6 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена в традиционном методе иммунизации. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками с помощью общепринятого процесса слияния, после чего клетки, продуцирующие моноклональные антитела, подвергают скринингу с использованием известного способа с целью получения желаемой гибридомы. 

Если говорить более подробно, антитело анти-IL-6 может быть получено следующим образом. Так например, человеческий IL-6, предназначенный для использования в получении антитела, может быть получен с применением системы ген IL-6/аминокислотная последовательность, раскрытой в Eur.J.Biochem (1987) 168, 543-550, J. Iimmuno. (1988) 140, 1534-1541, или Agr.Biol.Chem. (1990) 54, 2685-2688. 

После того, как клетку подходящего хозяина трансформируют путем вставки последовательности IL-6 гена в известную экспрессионную векторную систему, белок LI-6 очищают от клетки хозяина или ее культурального супернатанта. Очищенный протеин IL-6 может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена. С другой стороны, слитый белок протеина IL-6 и другого белка может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена. 

Антитела к IL-6-рецептору, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител с помощью известного способа. В качестве антител к IL-6-рецептору для использования в настоящем изобретении, предпочтительными объектами являются моноклональные антитела, особенно, млекопитающего происхождения. Моноклональные антитела млекопитающего происхождения включают те, что продуцируются гибридомами, и те, что продуцируются клеткой хозяина, которую трансформировали вектором экспрессии, содержащим ген антитела, полученный методом генной инженерии. Такие антитела, путем связывания с рецептором IL-6, ингибируют связывание IL-6 с рецептором IL-6 и тем самым блокируют трансдукцию биологической активности IL-6 в клетку. 

Примерами таких антител могут служить антитело MR16-1 (Tamura, Т., с сотр. , Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1993)90, 11924-11928), антитело РМ-1 (Hirata, с сотр., J. Immunology (1998) 143, 2900-2906), или антитело AUK12-20, антитело AUK12-7 или антитело AUK146-15 (Международная патентная публикация WO 92-19759) и т.д. Среди них наиболее предпочтительным является антитело РМ-1. 

Линия клеток гибридомы, которая продуцирует антитело РМ-1, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как РМ-1 10 июля 1990 г. с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, с получением названия FERM ВР-2998. Кроме этого, линия клеток гибридомы, которая продуцирует антитело MR16-1, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как РМ-1 13 марта 1997 г. с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, с получением названия FERM ВР-5875. 

Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело к IL-6-рецептору, можно сконструировать с использованием известного способа, описанного ниже. Так например, рецептор IL-6 используют в качестве сенсибилизирующего антигена согласно традиционному способу иммунизации. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками в традиционном процессе слияния и, после этого, клетки, продуцирующие моноклональное антитело, могут быть подвергнуты скринингу с использованием известного способа, с получением целевой гибридомы. 

Антитело к IL-6-рецептору может быть получено следующим образом. Например, рецептор человеческого IL-6, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен с использованием системы генная последовательность IL-6 рецептора/аминокислотная последовательность, раскрытой в заявке на европейский патент ЕР 325474, а мышиный IL-6 рецептор может быть получен с использованием методики, раскрытой в заявке на патент Японии (Kokai) 3 (1991)-155795. 

Существует два типа рецепторных белков IL-6: IL-6 рецептор, экспрессированный на клеточной мембране, и IL-6 рецептор, отсоединенный от клеточной мембраны (рецептор растворимого IL-6) (Yasukava, К. с сотр., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Антитело рецептора растворимого IL-6, в основном, состоит из внеклеточной области рецептора IL-6, связанной с клеточной мембраной, и на этом основании оно отличается от IL-6 рецептора, связанного с мембраной, тем, что в последнем случае не имеется трансмембранной области и внутриклеточной области. Помимо белка рецептора IL-6 может использоваться любой IL-6 рецептор, если он может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена для продуцирования антитела к IL-6 рецептору, подходящего для использования в настоящем изобретении. 

После включения генной последовательности рецептора IL-6 в известную экспрессионную векторную систему, с целью трансформации соответствующей клетки-хозяина, желаемый IL-6 рецептор может быть очищен от клеток-хозяев или его культурального супернатанта с использованием известного способа. Очищенный таким образом белок рецептора IL-6 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена. С другой стороны, в качестве сенсибилизирующего антигена могут применяться клетки, экспрессирующие IL-6 рецептор или слитый белок рецепторного протеина IL-6 и другого белка. 

E.coli, содержащая плазмиду pIBIBSF2R, имеющую кДНК, кодирующую человеческий IL-6 рецептор, прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором, как HB101-pIBIBSF2R 9 января 1989 с помощью National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Япония, с получением названия FERM BP-2232. 

Анти-gp130 антитела, предназначенные для использования в настоящем изобретении, могут быть получены известными способами в виде поликлональных или моноклональных антител. В качестве анти gp-130 антител, для применения в настоящем изобретении, особенно предпочтительными являются антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающего происхождения включают те, что продуцированы гибридомами, и те, что продуцированы клеткой-хозяином, трансформированной вектором экспрессии, содержащим гены антитела, полученные методами генной инженерии. Такие антитела, в результате связывания с gp130, ингибируют связывание комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gр130 и вследствие этого блокируют трансдукцию биологической активности IL-6 в клетку. 

Примерами таких антител могут служить антитело АМ64 (Японская патентная публикация (Kokai) 3(1991)-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (патент США 5571513), антитело BS12 и антитело В-Р8 (Японская патентная публикация (Kokai) 8(1996)-291199). 

Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, может быть, в основных чертах, создана с использованием описанного ниже способа. Так, gp130 может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена и использоваться для иммунизации традиционным способом. Полученные таким образом иммунизированные клетки сливают с известными родительскими клетками с помощью общепринятого способа, после чего гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, подвергают скринингу с использованием традиционного метода отбора, с целью получения целевой гибридомы. 

Моноклональное антитело может быть получено следующим способом. Так например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для выработки антитела, может быть получен с использованием системы, генная последовательность gp130/аминокислотная последовательность, раскрытой в заявке на Европейский патент ЕР 411946. 

После инсерции генной последовательности gp130 в известную экспрессионную векторную систему, подходящую клетку хозяина трансформируют такой векторной системой и белок gp130 очищают от клетки-хозяина или от ее культурального супернатанта. Такой очищенный белок рецептора gp130 может использоваться в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, слитый белок протеина gp130 и другого белка может применяться в качестве сенсибилизирующего антигена. 

Хотя природа млекопитающих, подлежащих иммунизации с помощью сенсибилизирующего агента, не имеет решающего значения, такие объекты предпочтительно выбирать исходя из соображений их совместимости с родительскими клетками, при использовании в слиянии клеток. Обычно, они включают таких грызунов, как мыши, крысы, хомяки и т.п. 

Иммунизацию животных с помощью сенсибилизирующего антигена проводят известным способом. Так например, общий способ включает внутрибрюшинное или подкожное введение сенсибилизирующего антигена млекопитающему. Согласно такому способу, сенсибилизирующий антиген, разбавленный в соответствующем количестве фосфатного буферного раствора (PBS) или физиологического раствора и т.п., смешивают, если это желательно, с соответствующим количеством традиционного стимулятора, например, полного адьюванта Фрейнда. После эмульгации, полученную эмульсию предпочтительно вводят млекопитающему несколько раз в течение каждых 4-21 дня. Совместно с сенсибилизирующим агентом во время иммунизации может применяться подходящий носитель. 

После иммунизации и подтверждения увеличения титра желаемого антитела в сыворотке, иммунизированные клетки отбирают от млекопитающего, подвергают процессу клеточного слияния. Предпочтительные иммунизированные клетки включают, главным образом, клетки селезенки. 

Клетки миеломы млекопитающих, в качестве других родительских клеток, которые подвергают клеточному слиянию с упомянутыми выше иммунизированными клетками, предпочтительно, включают такие известные различные клеточные линии, как Р3Х63Аg8.653)(Kearney, J.F. с сотр., J. Immunol. (1979)123: 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur.J.Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. с сотр., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M с сотр. , Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St.Groth. S.F. с сотр., J. Iinmunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J.Exp. Med (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. с сотр., Nature (1979) 277: 131-133) и т.п. 

Процесс слияния клеток, осуществляемый между указанными выше иммунизированными клетками и миеломными клетками, может проводиться в соответствии с таким известным способом, как метод, описанный Milstein с сотр. (Kohler, G. и Milstein, С., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) и т.п. 

Если говорить более подробно, то описанное слияние клеток проводят в традиционном питательном бульоне в присутствии, например, ускорителя слияния клеток. В качестве акселератора клеточного слияния могут применяться, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), вирус Sendai (HVJ) и т.п. Кроме этого, такой адъювант, как диметилсульфоксид и т.п., может добавляться по желанию с целью повышения эффективности слияния. 

Предпочтительное соотношение между количеством иммунизированных клеток и миеломных клеток таково, что иммунизированных клеток, например, в 1-10 раз больше, чем миеломных клеток. Примерами культурной среды, применяемой для упомянутого выше слияния клеток, могут служить среда RPMI1640 и культурная среда MEM, подходящая для роста указанных выше миеломных клеточных линий, причем могут добавляться традиционная культурная среда, применяемая для клеток такого типа, и такая дополнительная сыворотка, как фетальная телячья сыворотка (FCS). 

В таком процессе клеточного слияния, определенные количества иммунизированных клеток и миеломных клеток хорошо смешивают в указанной выше культурной среде, к которой добавляют раствор ПЭГ, предварительно нагретый до 37oС, например раствор ПЭГ со средним молекулярным весом 1000-6000 с концентрацией 30-60% (вес. /об. ) и полученную систему перемешивают с получением желаемых слитых клеток (гибридом). Затем, в результате повторения стадий последовательного добавления подходящей культурной среды и центрифугирования для удаления супернатанта, могут быть удалены агенты клеточного слияния и т. п., которые нежелательны для роста гибридомы. 

Указанную гибридому подвергают селекции с помощью культуры в традиционной селекционной среде, например, среде HAT (культурная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT обычно продолжают в течение времени, достаточного для уничтожения клеток, отличных от желаемых гибридом (неслитые клетки), обычно в течение промежутка времени от нескольких дней до нескольких недель. Осуществляют традиционный способ серийного разбавления, согласно которому гибридомы, продуцирующие желательное антитело, подвергают скринингу и клонированию. 

Кроме этого, для получения указанных выше гибридом иммунизацией животного, отличного от человека, антигеном, можно также сенсибилизировать человеческие лимфоциты in vitro желаемым антигеном или желаемыми антиген-экспрессирующими клетками, и полученные в результате сенсибилизированные лимфоциты В сливают с клетками человеческой миеломы, например, U266, с получением желаемого человеческого антитела с активностью связывания с желаемым антигеном или желаемыми антиген-экспрессирующими клетками (см. патентную публикацию Японии (Kokoku) 1 (1989)-59878). Кроме этого, трансгенное животное с полным набором генов человеческого антитела, иммунизируют антигеном или антиген-экспрессирующими клетками с получением желаемого человеческого антитела, с помощью описанного выше способа (см. международные патентные публикации WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735). 

Сконструированные таким образом гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, могут быть субкультивированы в традиционную культурную среду, или могут храниться в течение продолжительного времени в жидком азоте. 

С целью получения моноклональных антител из указанной гибридомы можно применять способ, в котором указанную гибридому культивируют обычным методом и антитело получают в виде супернатанта, либо способ, в котором гибридому вводят и выращивают в организме млекопитающего, совместимого с указанной гиборидомой, а антитело получают в асцитах. Первый способ подходит для получения антител высокой чистоты, тогда как последний - подходит для крупномасштабного производства антител. 

Согласно специальному варианту, гибридома, продуцирующая антитело к рецептору IL-6, может быть сконструирована с использованием способа, раскрытого в Японской патентной публикации (Kokai) 3(1989)-139293. Такое конструирование можно проводить способом, в котором гибридому, продуцирующую антитело РМ-1, прошедшую международное депонирование в рамках Будапештского договора с присвоением названия FERM ВР-2998, 10 июля 1990 в National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsucuba-shi, Ibaraki pref. , Япония, внутрибрюшинно вводят мышам BALB/с с получением асцитов, из которых получают антитело РМ-1 в чистом виде, или способом, в котором указанную гибридому культивируют в такой подходящей культурной среде, как RPMI1640, содержащей 10% фетальной коровьей сыворотки и 5% BM-Condimed HI (препарата, выпускаемого Boehringer Mannheim), гибридомная SEM среда (выпускаемая GIBCO-BRL), среда PFHM-II (выпускаемая GIBCO-BRL) и т.п., и антитело РМ-1 может быть очищено от супернатанта. 

Рекомбинантное антитело, которое получают методом генной рекомбинантной технологии, в котором ген антитела клонируют из гибридомы и интегрируют в подходящий вектор, которым трансформируют клетки хозяина, может использоваться в настоящем изобретении в качестве моноклонального антитела (см., например, Borrebaeck С.А.К. и Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликованную в Великобритании изд-ом MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990). 

Согласно конкретному варианту, мРНК, кодирующую вариабельный участок (V) желаемого антитела, отделяют от таких клеток, продуцирующих антитело, как гибридомы. Выделение мРНК проводят путем получения общей РНК с использованием, например, такого известного способа, как ультрацентрифужный гуанидиновый способ (Chirgwin, J.M. с сотр., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), способ AGPC (Chomczynski, P с сотр., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) и после этого, мРНК очищают из общей РНК с использованием набора для очистки мРНК (выпускаемого Pharmacia) и т.п. С другой стороны, мРНК может быть получена непосредственно с использованием набора Quick Prep mRNA purification Kit (выпускаемого Pharmacia). 

кДНК V области антитела может быть синтезирована из мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК может быть синтезирована с использованием набора для синтеза ДНК AMV reverce Transcriptase first-strand cDNA Synthesis Kit и т.п. С другой стороны, для синтеза и амплификации кДНК, могут применяться набор 5'-Ampli FINDER RACE KIT (выпускаемый Clontech) и 5'-race способ (Frohman, M.A. с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, А. С сотр., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), в котором применяется цепная полимеразная реакция (PCR). Желаемый фрагмент ДНК очищают от продукта PCR и его можно лигировать с вектором ДНК. Кроме этого, из него конструируют рекомбинантный вектор и затем трансформируют в E.coli. и т.п., из которой выбирают колонии для получения желаемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидная последовательность желаемой ДНК может быть подтверждена таким известным способом, как дидеокси-способ. 

После получения ДНК, кодирующей V-область желаемого антигена, ее можно лигировать с ДНК, кодирующей константную область (С область) желаемого антитела, с последующей интеграцией в вектор экспрессии. С другой стороны, ДНК, кодирующую V-область антитела, можно интегрировать в вектор экспрессии, который уже содержит ДНК, кодирующую C-область антитела. 

Для получения антитела для использования в настоящем изобретении, ген антитела интегрируют, как описано ниже, в вектор экспрессии с целью проведения экспрессии под контролем участка регуляции экспрессии, например, энхансера и/или промотора. Далее, вектор экспрессии можно трансформировать в клетку-хозяина и после этого в него можно экспрессировать антитело. 

В соответствии с настоящим изобретением, такое искусственно измененное рекомбинантное антитело, как химерное антитело или гуманизированное антитело, можно использовать в целях снижения гетерологической антигенности против человека. Такие измененные антитела могут быть получены с использованием известных способов. 

Химерное антитело может быть получено путем лигирования полученной таким образом ДНК, кодирующей V-область антитела, с ДНК, кодирующей C-область человеческого антитела, с последующей интеграцией в вектор экспрессии и трансформацией в клетку хозяина для продуцирования в ней антитела (см. заявку на Европейский патент ЕР 125023 и Международную патентную публикацию WO 92/19759). При использовании такого известного способа, может быть получено полезное для настоящего изобретения химерное антитело. 

Так например, плазмида, содержащая ДНК, кодирующую L-цепь V-области или H-цепь V-области химерного антитела РМ-1, обозначается, как pPM-k3 или рРМ-h1, соответственно, a E. coli с такой плазмидой прошла международное депонирование в соответствии с Будапештским договором с присвоением названия NCIMB 40366 и NCIMB 40362, соответственно, на 11 февраля 1991 г. в рамках National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited. 

Гуманизированное антитело, которое также называют реконструированным человеческим антителом, может быть получено трансплантацией гипервариабельных участков (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, например, мышиного антитела в CDR человеческого антитела. Общая рекомбинантная технология ДНК для получения таких антител также известна (см. заявку на европейский патент ЕР 125023 и Международную патентную публикацию WO 92-19759). 

Более конкретно, последовательность ДНК, которая предназначена для лигирования CDR мышиного антитела с каркасными областями (FR) человеческого антитела, синтезируют из нескольких раздельных олигонуклеотидов, поглощающих участки перекрывания на их концах. Полученную таким образом ДНК лигируют с ДНК, кодирующей С-область человеческого антитела, и затем интегрируют в вектор экспрессии, которым трансформируют клетки-хозяина для продуцирования антитела (см. заявку на Европейский патент ЕР 239400 и Международную патентную публикацию WO 92-19759). 

Для FR человеческого антитела, лигированной с CDR, выбирают гипервариабельный участок, образующий благоприятную структуру, связывающую антиген. Если желательно, то аминокислоты в каркасной области вариабельного участка антитела могут быть заменены таким образом, что гипервариабельная область реконструированного человеческого антитела может образовывать соответствующую структуру, связывающую атиген (Sato, К. с сотр., Cancer Res. (1993) 53 851-856). 

Так например, в химерном антителе или гуманизированном антителе используют С-область человеческого антитела. В качестве С-области человеческого антитела, можно отметить Сy, кроме этого, могут также использоваться Cy1, Сy2, Сy3 и Сy4. C-область человеческого антитела может быть модифицирована с целью повышения стабильности антитела или его продуктов. 

Химерное антитело состоит из вариабельной области антитела, производного млекопитающего, отличного от человека, и С-области, производной человеческого антитела, тогда как гуманизированное антитело состоит из гиперваприабельных областей антитела, производного млекопитающего, отличного от человека, и каркасных областей и С-области антитела, производного человеческого антитела. В соответствии с этим, их антигенность в организме человека понижена таким образом, что эти вещества становятся полезными антителами для применения в настоящем изобретении. 

Предпочтительное воплощение гуманизированного антитела для применения в настоящем изобретении включает гуманизированное РМ-1 антитело (см. Международную патентную публикацию WO 92-19759). 

Гены антитела, сконструированные, как описано выше, могут экспрессироваться и продукт такого процесса получают известными способами. В случае клеток млекопитающих, экспрессия может осуществляться с использованием вектора, содержащего традиционно применяемый промотор, ген антитела, подлежащий экспрессиии и ДНК, в которой поли А сигнал операбельно присоединен к его 3' в прямом направлении считывания генетического кода или вектор, содержащий указанную ДНК. Примером системы промотор/энхансер может служить человеческий цитомегаловирусный непосредственно ранний промотор/энхансер. 

Кроме этого, в качестве промотора/энхансера, который может использоваться для экспрессии антитела при применении в настоящем изобретении, существуют такие вирусные промоторы/энхансеры, как ретровирусы, полиомные вирусы, аденовирусы и вирус обезьяны 40 (SV40), а также промоторы/энхансеры, производные таких клеток млекопитающих, как человеческий фактор элонгации 1 (HEF1). 

Так например, экспрессию можно легко осуществлять по способу Mulligan с сотр. , (Mulligan, R.C. с сотр., Nature (1979) 277, 108-114) при использовании SV40 промотора/энхансера, или по способу Mizushima с сотр. (Mizushima, S. и Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) с использованием HEFI промотора/энхансера. 

В случае E. coli, экспрессию можно осуществлять оперативной сшивкой традиционно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела, и гена антитела, подлежащего экспресиии, с последующей его экспрессией. В качестве промотора можно, например, упомянуть lacz промотор и arab промотор. При использовани промотора lacz можно применять способ Ward с сотр., (Ward, E.S. с сотр.. Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. с сотр., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), а способ Better с сотр. (Better, M. с сотр., Science (1988) 240, 1041-1043) может применяться при использовании аraВ промотора. 

В качестве сигнальной последовательности для секреции антитела, в случае продуцирования в периплазме Е.coli, может использоваться ре1В сигнальная последовательность (Lei, S.P. с сотр., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). После выделения антитела, накопленного в периплазме, структуру антитела соответствующим образом перегибают перед применением (см., например, WO 96/30394). 

В качестве источника репликации можно использовать производные SV40, полиомного вируса, аденовируса, вируса коровьей папиломы (BPV) и т.п. Кроме этого, с целью амплификации числа копий гена в системе клетки хозяина, векторы экспрессии могут включать в качестве способных к селекции маркеров ген аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген Е.coli ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и т.п. 

Для получения антитела, предназначенного для использования в настоящем изобретении, может применяться любая продукционная система. Продукционная система получения антитела включает in vitro или in vivo продукционную систему. В качестве in vitro продукционной системы, можно упомянуть продуцирующую систему, в которой используются эукариотические клетки, и продукционную систему, в которой применяют прокариотические клетки. 

При использовании эукариотных клеток, имеются продукционные системы, в которых применяют животные клетки, растительные клетки и клетки грибков. Известные животные клетки включают (1) такие клетки млекопитающих, как СНО клетки, COS клетки, миеломные клетки, клетки почки молодых хомячков (ВНК), клетки HeLa и клетки Vero, (2) такие клетки амфибий, как Xenopus ооциты или (3) такие клетки насекомых, как sf9, sf21 и Тn5. Известные растительные клетки включают, например, полученные из Nicotiana Tabacum, которые могут быть объектом для каллусной культуры. Известные грибковые клетки включают такие дрожжи, как вид Saccharomyces, особенно Saccharomyces cereviceae, или клетки таких нитевидных грибов, как вид Aspergillus, особенно Aspergillus niger. 

При использовании прокариотических клеток, имеются продукционные системы, в которых применяют бактериальные клетки. Известные бактериальные клетки включают Escherichia coli (E.coli) и Bacillus subtilis. 

В результате трансформации гена желаемого антитела в такие клетки и культивирования трансформированных клеток in vitro, может быть получено антитело. Культивирование проводят известными способами. В качестве культурной среды могут использоваться в комбинации DMEM, MEM, RPMI1640 и IMDM, а также сывороточные добавки, например, фетальная телячья сыворотка (FCS). Кроме этого, антитела могут продуцироваться in vivo путем инъекции клеток, трансформированных геном антитела в абдоминальную полость животного и т.п. 

В качестве продукционных систем in vivo можно упомянуть те, в которых используются животные, а также те, в которых применяются растения. При использовании животных, имеются продукционные системы, в которых используются млекопитающие и насекомые. 

В качестве млекопитающих могут использоваться козы, свиньи, овцы, мыши и крупный рогатый скот (Vici Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993). В качестве насекомых может применяться тутовый шелкопряд. 

При использовании растений может применяться, например, табак. 

Гены антител трансформируют в указанные животные или растения и антитела продуцируются в таких животных или растениях и выделяются. Так например, ген антитела вставляют в середину гена, кодирующего белок, который непосредственно продуцируется в молоке, такой как -казеин коз, с получением слитых генов. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в который вставлен ген антитела, инъектируются в козий эмбрион и такой эмбрион переносится в самку козы. Желаемое антитело получают из молока, вырабатываемого трансгенной козой, рожденной козой, получившей эмбрион, или ее потомством. С целью увеличения количества молока,

содержащего желаемое антитело, выработанное трансгенной козой, трансгенному животному могут даваться соответствующие гормоны (Ebert, K.M. с сотр., Bio/Technology (1994) 12, 699-702). 

При использовании тутового шелкопряда, бакуловирус, в который вставляли ген желаемого антитела, использовали для инфицирования тутового шелкопряда и желательное антитело может быть получено из жидкой среды организма тутового шелкопряда (Maeda, S. с сотр., Nature (1985) 315, 592-594). Кроме этого, при использовании табака, ген желаемого антитела вставляют в вектор экспрессии для растений, например, pMON 530, и затем такой вектор используют для инфицирования такой бактерии, как Agrobacterium tumefaciens. Затем такой бактерией инфицируют такой табак, как Nicotiana tabacum с получением желательного антитела из личинок табака (Julian, К. -С. Ма с сотр., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). 

В том случае, когда антитело вырабатывается в in vitro или in vivo продуцирующих системах, описанных выше, ДНК, кодирующая тяжелые цепи (Н цепь) или легкие цепи (L цепь) антитела, может быть отдельно интегрирована в каждый вектор экспрессии при одновременной трансформации хозяев, или ДНК, кодирующую Н цепь и L цепь, можно интегрировать в единственный вектор экспрессии и трансформировать им хозяина (см. Международную патентную публикацию WO 94-11523). 

Антитела, предназначенные для применения в настоящем изобретении, могут представлять собой фрагменты антител или их модифицированные версии, в тех случаях, когда их применение является предпочтительным. Так например, в качестве фрагментов антител можно отметить Fab, F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv (scFv), в котором Fv Н цепи и L цепи подвергали лигированию с использованием подходящего линкера. 

Если говорить более подробно, антитела обрабатывают энзимом, например, папаином или пепсином, с получением фрагментов антитела, или конструируют гены, кодирующие такие фрагменты антител, и после этого их интегрируют в вектор экспрессии, который экспрессируется в подходящей клетке хозяина (см., например. Со, M.S. с сотр., J.Immunol. (199^) 152, 2968-2976; Better, M. и Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, А. В Skеrrа, A. , Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. С сотр., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. с сотр., TIBTECH (1991) 9, 132-137). 

ScFv может быть получен лигированием V области Н цепи и V области L цепи антитела. В scFv, V область Н цепи и V область L цепи предпочтительно лигируют через линкер, предпочтительно пептидный линкер (Huston, J.S. с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci. США (1988) 85, 5879-5883). V область Н цепи и V область L цепи в scFv могут быть получены из любого из упомянутых выше антител. В качестве пептидного линкера для лигирования V областей может использоваться любой одноцепочный пептид, содержащий, например, 12-19 аминокислотных остатков. 

ДНК, кодирующая scFv, может быть получена с использованием ДНК, кодирующей Н цепь или Н цепь V области упомянутого выше антитела, и ДНК, кодирующей L цепь или L цепь V области указанного выше антитела, в качестве матрицы для амплификации части ДНК, кодирующей желаемую аминокислотную последовательность из упомянутых выше последовательностей, с помощью метода PCR в присутствии пары праймеров, обозначающих оба их конца, и последующей амплификации комбинации ДНК, кодирующей часть пептидного линкера и пары праймеров, которые показывают, что оба окончания указанной ДНК лигированы с Н цепью и L цепью, соответственно. 

При конструировании ДНК, кодирующих scFv, вектор экспрессии, содержащий ее, и хозяин, трансформированный указанным вектором экспрессии, могут быть получены традиционными методами, а scFv может быть получен традиционными методами с использованием трансформированного хозяина. 

Такие фрагменты антитела могут продуцироваться путем получения их гена с использованием способа, аналогичного описанному выше, с проведением экспрессии в хозяине. Термин "антитело", используемый в тексте настоящей заявки, включает такие фрагменты антитела. 

В качестве антител могут использоваться антитела, связанные с такими различными молекулами, как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Термин "антитело", используемый в тексте настоящей заявки, охватывает такие модифицированные антитела. Эти модифицированные антитела могут быть получены путем химического модифицирования полученных таким образом антител. Эти способы уже известны в данной области техники. 

Описанные выше продуцированные и экспрессированные антитела могу быть выделены из внутренней или внешней части клетки хозяина и затем могут быть очищены до состояния гомогенности. Выделение и очистка антитела, предназначенного для использования в настоящем изобретении, могут осуществляться методом аффинной хроматографии. В качестве колонки, применяемой для такой аффинной хроматографии, можно отметить колонку с протеином А и колонку с протеином С. Примерами носителей, используемых в колонке с протеином А, могут служить Hyper D, POROS, Sepharose F.F. и т.п. С другой стороны, способы выделения и очистки, традиционно применяемые для белков, могут использоваться без каких-либо ограничений. Выделение и очистка антитела, предназначенного для применения в настоящем изобретении, могут проводиться путем комбинирования, если это необходимо, метода хроматографии, отличного от упомянутой выше аффинной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. Хроматографические методы включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и т.д. Такие хроматографические методы могут проводиться в режиме жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР). С другой стороны, может использоваться ЖХВР с обращением фаз. 

Концентрацию антитела, полученного выше, можно определять путем измерения оптического поглощения или используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и т.п. Так например, при использовании измерения оптического поглощения, испытуемый образец соответствующим образом разбавляют PBS(-) и затем измеряют оптическое поглощение при длине волны 280 нм, с последующим расчетом с использованием коэффициента поглощения порядка 1,350D при концентрации 1 мг/мл. При использовании анализа ELISA измерения проводят следующим образом. 100 мкл козьего антитела против человеческого IgG (выпускаемого TAGO), разбавленного до концентрации 1 мкг/мл в 0,1М бикарбонатном буфере, рН 9,6, помещают в 96-луночный планшет (выпускаемый Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4oC с целью иммобилизации антитела. После блокады, в систему добавляют 100 мкл каждого из соответствующим образом разбавленного антитела настоящего изобретения или образца, содержащего такое антитело, или 100 мкл человеческого IgG (выпускаемого CAPPED в качестве стандарта и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. 

После промывания, добавляют 100 мкл 5000-кратно разбавленного антитела против человеческого IgG, меченного щелочной фосфатазой (выпускаемого BIO SOURSE), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания, добавляют раствор субстрата и проводят инкубацию, после чего измеряют оптическое поглощение при 405 нм с использованием считывающего устройства MICROPLATE REASDER Model 3550 (выпускаемого Bio-Rad) с целью расчета концентрации желаемого антитела. 

Измененный IL-6, предназначенный для использования в настоящем изобретении, обладает активностью связывания с рецептором IL-6 и не передает биологическую активность IL-6. Так, измененный IL-6, несмотря на его конкуренцию с IL-6 за связывание с рецептором IL-6, не передает биологическую активность IL-6 и вследствие этого, блокирует сигнальную трансдукцию IL-6. 

Измененный IL-6 может конструироваться в результате введения мутации путем замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. IL-6, источник измененного IL-6, может иметь любое происхождение, но, принимая во внимание, антигенность, предпочтительно использовать человеческий IL-6. 

Следует отметить, что вторичная структура IL-6 может быть предсказана с использованием известной программы моделирования молекул для аминокислотной последовательности, например программы WHATIF (Vriend с сотр., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52-56) и могут быть оценены общие эффекты, оказываемые аминокислотными остатками, подлежащими замене. После определения соответствующего аминокислотного остатка, мутацию вводят с помощью традиционно используемого метода цепной полимеразной реакции (PCR) с применением вектора, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующего ген человеческого IL-6 с тем, чтобы получить ген, кодирующий измененный IL-6. Затем проводят интеграцию, если это желательно, в соответствующий вектор экспрессии, из которого может быть получен измененный IL-6 в соответствии с экспрессией, продукцией и очисткой указанного рекомбинатного антитела. 

Конкретные примеры измененного IL-6 описаны Brakenhoff с сотр., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, и Savino с сотр., ЕМВО J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648 и WO 96-17869. 

Неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6, предназначенные для использования в настоящем изобретении, обладают активностью связывания с рецептором IL-6 или IL-6, соответственно, и не передают биологическую активность IL-6. Таким образом, неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 связываются с рецептором IL-6 или IL-6, соответственно, и вследствие этого захватывают их. В результате они не передают биологическую активность IL-6 и блокируют сигнальную трансдукцию IL-6. 

Неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 представляют собой пептиды, содержащие часть или всю аминокислотную последовательность области, участвующей в связывании с IL-6 и рецептором IL-6 в аминокислотной последовательности IL-6 или его рецептора. Такие пептиды, обычно, содержат 10-80, предпочтительно, 20-50, более предпочтительно 20-40 аминокислотных остатков. 

Неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 могут быть сконструированы путем определения области, участвующей в связывании с IL-6 или его рецептором в аминокислотной последовательности IL-6 или рецептора IL-6, и продуцированием части или всей аминокислотной последовательности таким традиционным способом, как генно-инженерная технология или метод пептидного синтеза. 

С целью получения неполных (частичных) пептидов IL-6 или рецептора IL-6 методом генно-инженерной технологии, ДНК-последовательность, кодирующую желаемый пептид, интегрируют в вектор экспрессии, из которого пептид может быть получен экспрессией, продукцией и очисткой указанного рекомбинантного антитела. 

Получение неполного пептида IL-6 или рецептора IL-6 методом пептидного синтеза может осуществляться с использованием способа традиционно применяемого в области синтеза пептидов, такого, как твердофазный синтез, или жидкофазный синтез. 

Для этой цели подходит способ, описанный Zoku-Iyakuhin no Kaihatsu (Sequel to Development of Pharmaceuticals), т.14, Peptido Gousei (Peptide Synthesis), изд. Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991 г. Используемый метод твердофазного синтеза включает, например, реакцию, в которой аминокислоту, соответствующую C-окончанию синтезируемого пептида, соединяют с носителем, который нерастворим в органических растворителях, и затем аминокислоту, в которой -аминогруппа или функциональная группа боковой цепи защищены соответствующей защитной группой, конденсируют по одной аминокислоте за определенный период времени, в направлении от С-окончания до N-окончания и реакцию, в которой элиминируют указанную защитную группу -аминогруппы аминокислоты или пептида, связанного со смолой, поочередно повторяют с целью удлинения пептидной цепи. Методы твердофазного пептидного синтеза подразделяются на Вос метод и Fmoc метод, в зависимости от типа используемой защитной группы. 

После завершения синтеза желаемого пептида, осуществляют реакцию снятия защитной группы и расщепления пептидной цепи с носителем. С целью расщепления пептидной цепи, обычно применяют фтористый водород или трифторметансульфокислоту в методе Вос и TFA в методе Fmoc. Так например, в методе Вос, пептидную смолу обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Далее, удаляют защитную группу и пептид выделяют отщеплением от носителя. В результате лиофилизации, может быть получен сырой пептид. С другой стороны, в способе Fmoc аналогичным образом используют, например, TFA, с целью осуществления реакции снятия защитной группы и реакции отщепления пептида от носителя. 

Полученный таким образом сырой пептид может быть подвергнут обработке методом ЖХВР с целью его выделения и очистки. Элюирование пептида может проводиться в системе растворителей вода-ацетонитрил, которая обычно используется для очистки белка в оптимальных условиях. Фракцию, соответствующую пику полученного хроматографического профиля, собирают и лиофилизируют. Очищенную таким образом пептидную фракцию идентифицируют, подвергая ее анализу на определение молекулярного веса методом масс-спектроскопии, анализу на аминокислотный состав или анализу аминокислотной последовательности и т.п. 

Конкретные примеры неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 раскрыты в Японских патентных публикациях (Kokai) 2 (1990)-188600, 7 (1995)-324097, 8(1996)-311098 и патенте США 5210075. 

Активность антагониста IL-6, предназначенного для использования в настоящем изобретении, может быть оценена с использованием традиционного известного способа. Согласно такому специальному варианту, IL-6 зависимую клетку MH60. BSF2 подвергают культивированию, в систему добавляют IL-6 и активность оценивают с использованием введения 3H-тимидина в IL-6-зависимую клетку в присутствии антагониста IL-6. С другой стороны, такую оценку можно проводить культивированием клетки U266, экспрессирующей рецептор IL-6, одновременно добавляя в систему 125Т-меченый IL-6 и антагонист IL-6 с последующим определением количества IL-6, меченного изотопом 125I, связанного с клеткой, экспрессирующей рецептор IL-6. В описанной выше аналитической системе, используют отрицательную контрольную группу, не содержащую антагониста IL-6, и группу, в которой присутствует антагонист рецептора IL-6, и результаты, полученные в этих группах, подвергают сравнению для оценки IL-6-ингибирующей активности антагониста рецептора IL-6. 

С целью подтверждения эффектов, достигаемых настоящим изобретением, антагонист IL-6, предназначенный для использования в настоящем изобретении, применяли на животных, характеризующихся воспалительным заболеванием кишечника, путем инъекции CD4-положительных и CD45RB-сильно положительных клеток (CD4+CD45RBhigh клетки) и оценивали эффект подавления потери веса и улучшения состояния воспалительного заболевания кишечника. В качестве дополнительных положительных эффектов настоящего изобретения можно отметить эффекты подавления анорексии, понижения абдоминальных болей, улучшения состояния диарреи или предотвращение рецидивов воспалительного заболевания кишечника. 

CD4+CD45RBhigh клетки, перенесенные в организм животного, могут быть выделены с помощью антагониста IL-6 с использованием, например, способа, описанного в следующем ниже примере. Животными, из которых отбирают клетки CD4+CD45RBhigh, могут быть традиционно используемые в экспериментах мыши и крысы. 

Как описано в следующем ниже Примере, у животных с выраженным воспалением кишечника, применение антитела против рецептора IL-6 обеспечивает снижение потерь веса и улучшение степени воспалительного заболевания кишечника, и, таким образом, устанавливается факт проявления такими антагонистами IL-6, как антитело против рецептора IL-6, терапевтического действия на воспалительное заболевание кишечника. 

Объектом лечения в настоящем изобретении являются млекопитающие. Предпочтительным объектом лечения являются люди. 

Профилактические или терапевтические агенты настоящего изобретения могут применяться орально, парентерально, системно или локально. Так, например, для этих целей может быть выбрана такая внутривенная инъекция, как капельное внутривенное вливание, внутримышечная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, подкожная инъекция, а также применение свечей, промывание кишечника, применение оральных таблеток, покрытых энтеросолюбильной оболочкой, и т.п., а способ применения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста и состояния пациента. Эффективная доза выбирается из интервала 0,01-100 мг на кг веса тела в расчете на одно применение. С другой стороны, может быть выбрана доза в интервале 1-1000 мг, предпочтительно 5-50 мг на пациента. 

Профилактические и терапевтические агенты для воспалительного заболевания кишечника, согласно настоящему изобретению, могут содержать фармацевтически применимые носители или добавки, в зависимости от пути введения, применения. Примерами таких носителей или добавок могут служить вода, фармацевтически применимый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивинильный полимер, натрий карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилат натрия, альгинат натрия, водо-растворимый декстран, натрий карбоксиметилкрахмал, пектин, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, ксантановая смола, аравийская камедь, казеин, желатина, агар, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин, парафин, стеариловый спирт, стеариновая кислота, альбумин человеческой сыворотки (HSA), маннит, сорбит, лактоза, фармацевтически применимое поверхностно-активное соединение и т.п. Используемые добавки выбирают, без ограничения сферы изобретения, из указанных выше веществ или их комбинаций в зависимости от формы дозировки. 

Основное заболевание, подлежащее лечению с помощью настоящего изобретения, представляет собой воспалительное заболевание кишечника. Воспалительное заболевание кишечника включает язвенный колит и болезнь Крона. Такие заболевания, главным образом, встречаются у молодых людей в возрасте 20 лет и даже в настоящее время мало, что известно об антигенах, являющихся причиной болезни, или механизме воспалительной патологии. Однако проводятся широкие исследования, направленные на выяснение этих факторов с использованием различных клеток и цитокинов. 

В последние годы наблюдается прогресс в исследовании клеток, вызывающих воспалительное заболевание кишечника. Так например, было выяснено, что модель воспалительного заболевания кишечника у животного может быть сконструирована передачей (переносом) очищенных СD4-положительных, С045RВ-сильно положительных клеток (CD4+CD45RBhigh) в иммунодефицитную мышь (мышь SCID) (Morrissey, P. J. с сотр. , J,Exp.Med. (1993) 178, 237-244; Leach, M.W. с сотр. . Am. J. Patol. (1996) 148, 1503-1515; Aranda, R. С сотр., J. Immunol. (1997) 158, 3464-3473). 

С другой стороны, было показано, что CD-положительные, CD45RB-cлaбo положительные клетки (CD4+CD45RBlow) не способны индуцировать воспалительное заболевание кишечника и в большей степени происходит подавление индукции воспалительного заболевания кишечника CD-положительными, CD45RB-сильно положительными клетками (Powie, F.R. с сотр., J. Exp. Med. (1994) 179, 589-600). Известно, что степень экспрессии CD45RB в расчете на клетку коррелирует с картиной продукции цитокинов. Таким образом, предполагается, что CD-положительные, CD45RB-сильно положительные клетки представляют собой клетки, подобные хелперу типа 1 (Th1), которые продуцируют IFN- и TNF-, тогда как CD-положительные, CD45RB-cлaбo пoлoжитeльныe клетки относятся к клеткам, подобным хелперу типа 2 (Th2), которые продуцируют IL-4, IL-10 и т.п. (Lee, W. с сотр., J. Immunol. (1990) 144, 3288-3295). 

Таким образом, предполагается, что начало IBD, с высокой вероятностью, связано с нарушением баланса между Th1 и Th2 и это предположение было подтверждено тем фактом, что хронические энтериты, напоминающие язвенный колит человека, развиваются в мышах с дефицитом IL-10, которые были получены методом гена-мишени (Kuhn, R. С сотр., Cell (1993) 75, 263-274). 

Модельные животные, используемые в примерах, очень похожи на пациентов с язвенным колитом и болезнью Крона по гистологическим особенностям толстой кишки (Leach, M. W. с сотр., Am.J.Pathol. (1996) 148, 1503-1515). В случае язвенных колитов, часто, в нарастающей последовательности, наблюдаются повреждения в области, начиная с прямой кишки, причем эпителий слизистой оболочки повреждается в особой степени. В настоящей модели, клинические патологические признаки очень похожи в том, что поврежденные участки охватывают большую площадь, хотя главным образом локализованы в толстой кишке с выраженными криптами. 

С другой стороны, болезнь Крона представляет собой воспаление по всей толщине слоя, не локализованное в слизистой оболочке, и распространяется в любой области пищеварительного тракта от ротовой полости до ануса. Гистологически, такое заболевание характеризуется воспалением некапсулированной гранулемы. Такая модель очень похожа на заболевание Крона тем, что воспаление, не локализованное в слизистом слое, обнаружено там, где аккумулируются макрофаги, лимфоциты и многоядерные гигантские клетки, и часто имеет форму гранулемы, и тем, что редко обнаруживается абсцесс крипты. 

Имеются сообщения о случаях сосуществования признаков язвенных колитов и болезни Крона в клинических исследованиях (Tanaka, М. с сотр, Hepatogastroenterology (1990) 31, 18-31). При воспалительном заболевании кишечника, усиленная экспрессия главного комплекса гистосовместимости класса II обнаружена в эпителии (Trejdosiewicz, L. K. с сотр., Dig.Dis.Sci. (1989) 34, 1449-1456), и то же самое справедливо для настоящей модели. В такой модели, проявляется характерное уплотнение эпителиальной ткани, которое, как полагают, связано с усиленным клеточным ростом, установленным у пациентов с язвенным колитом (Serafini, Е.Р. с сотр., Gut (1981) 22, 648-652). 

Настоящая модель очень похожа на клиническую картину воспалительного заболевания кишечника и в некоторых случаях может индуцировать потерю веса. В эксперименте с использованием модели настоящего изобретения, гистологические нарушения явно улучшаются и не наблюдается потери веса, что указывает на тот факт, что антагонист IL-6 демонстрирует терапевтическое действие на такое воспалительное заболевание кишечника, как язвенный колит и болезнь Крона. 

Примеры

Далее, настоящее изобретение будет подробно разъяснено со ссылкой на рабочие примеры, справочные примеры и экспериментальные примеры. Однако следует отметить, что настоящее изобретение никоим образом не ограничивается приведенными примерами. 

Пример

Селезенку асептически удаляли у мышей разновидности BALB/c и после гомогенизации энергично пипетировали с образованием суспензии изолированных клеток. Затем, с целью удаления эритроцитов, клеточный осадок после центрифугирования обрабатывали лизисным раствором (смесь 0,16М NH4Cl с 0,17М Трис-буфера в соотношении 9:1, рН 7,2), который далее дважды промывали фосфатным забуференным раствором с получением клеток селезенки мыши. 

Промытые клетки селезенки мыши суспендировали в среде RPMI1640, содержащей 2% FCS, и после подсчета клеток их концентрацию доводили до 1,1108/мл. В полученную систему добавляли антитело против мышиного CD4 (L3T4 Microbeads, выпускаемые Miltenyi Biotec) до 1/9 объема и связывали с клетками в течение 15 минут на льду (при плотности клеток 1108/мл). После этого, проводя обработку на колонке с использованием сепарационной системы Mini Macs (выпускаемой Miltenyi Biotec), собирали фракцию CD4-положительных клеток. После подсчета клеток их суспендировали в фосфатном буферном растворе с добавкой 2% FCS с целью установления плотности клеток на уровне 4107/мл. 

К суспензии CD4-положительных клеток добавляли 1/100 объема РЕ-меченого крысиного антитела против мышиного CD4 (L3T4) (0,2 мг/мл, клон RM4-5, выпускаемый Pharmingen) и 1/100 объема FITC-меченого крысиного антитела мышиного CD45RB (0,5 мг/мл, клон 16А, выпускаемый Pharmingen). Систему оставляли на льду на 20 минут для связывания антител. К меченым клеткам добавляют среду RPMI1640 с 2% FCS, промывают центрифугированием и повторно суспендируют в фосфатным буферном растворе с 2% добавленного FCS и хранили в темном холодном месте. 

Из меченных CD4-пoлoжитeльныx клеток выбирали клетки группы CD4-положительных и CD45RB-сильно положительных клеток (клетки CD CD4+CD45RBhigh) с использованием проточного цитометра (FACS Vantage, выпускаемый Becton Dickinson). Такая группа клеток соответствует системе, в которой более 50% клеток имеют высокую экспрессию CD45RB среди CD4- и CD45RB-пoлoжитeльныx клеток. Полученные клетки, после центрифугирования, суспендировали в фосфатном буферном растворе до концентрации 4106/мл. Чистота таких клеток, представляющих CD45RB-пoлoжитeльныe клетки, составила 97%, а степень выживаемости составила 98%. 

Высоко очищенные клетки инъецировали внутрибрюшинно с нормой применения 4105/мл (по 100 мкл каждого вида с концентрацией 4x106/мл) мышам вида С.В. - 17 scid с целью получения модели воспалительного заболевания кишечника (Leach, M.W. с сотр., Am.J.Pathol. (1996) 148, 1503-1515, Aranda.R. С сотр., J.Immunol.(1997) 158, 3464-3473). Эксперимент осуществляли на следующих трех группах, используя следующие режимы обработки: (1) клеточный перенос, группа из 5 мышей, на которых не применяли антитело против рецептора IL-6, (2) клеточный перенос, группа из 3 мышей, на которых применяли антитело против рецептора IL-6, и (3) группа из 3 мышей без клеточного переноса. 

Антитело против рецептора IL-6 MR16-1 применяли следующим образом. Вначале устанавливали концентрацию 20 мг/мл в фосфатном буферном растворе, по 100 мкл этого раствора в расчете на мышь применяли внутрибрюшинно за 15-30 минут до инъекции указанных выше клеток. Через неделю устанавливали концентрацию 10 мг/мл в фосфатном буферном растворе, и внутрибрюшинно применяли на каждой мыши по 100 мкл полученного раствора. Описанную обработку повторяли каждую неделю вплоть до 8-й недели после клеточного переноса. Группе животных, на которой не применяли антитело, аналогичным образом давали фосфатный буферный раствор. 

Через 8-9 недель после клеточного переноса производили взвешивание мышей, после чего ткань толстой кишки (нисходящая часть толстой кишки) удаляли и погружали в соединение OCT. Образцы замораживали до -80oС. С использованием криостата блоки образцов делили на части с получением замороженных срезов толщиной 6 мкм, которые фиксировали в 10% растворе формалина. Фиксированный срез подвергали двойному окрашиванию гематоксилинэозиновым методом для гистологического анализа. 

Оценку эффективности лекарственного препарата проводили путем определения изменений веса тела (соотношение между значениями до и после клеточного переноса) и путем проведения гистологического анализа перед индукцией воспалительного заболевания кишечника путем клеточного переноса и через 8-9 недель после клеточного переноса. В целях гистологического анализа, ткань каждой мыши оценивали по следующим 4 стадиям оценок воспалительного заболевания кишечника (далее в тексте оценка заболевания кишечника) (Ito, Н., с сотр., J. Autoimmunity (1997) 10, 455-459). 

Показатели воспалительного заболевания кишечника:

Оценка 0 (отсутствие воспаления): отсутствие отличий от нормальных мышей BALB/c. 

Оценка 1 (минимальное воспаление): наблюдается небольшая гипертрофия эпителиальной ткани. 

Оценка 2 (умеренное воспаление): среднее состояние между оценками 1 и 3. 

Оценка 3 (тяжелая стадия заболевания): выраженная гипертрофия эпителиальной ткани, сопровождающаяся широким распространением инфильтраций клеток воспаления, и дефицит клеточных клубков. 

Результаты изменений веса тела и оценки воспалительного заболевания кишечника приведены в таблице. 

У мышей, которым имплантировали CD-4 положительные и СВ45RВ-сильно положительные клетки, развивалось воспалительное заболевание кишечника и выраженное воспаление также наблюдали гистологически. Они также проявляли астению, связанную с началом заболевания, и 11% снижение общего веса тела. С другой стороны, в группе, на которой применяли антитело против рецептора IL-6, наблюдалось статистически значимое подавление весовых потерь и сохранялся практически тот же вес тела, что был до клеточного переноса. Кроме этого, гистологические оценки воспалительного заболевания кишечника демонстрировали улучшение состояния заболевания кишечника. 

Для статистического теста на изменения веса тела, вначале проводили анализ ANOVA (вариационный анализ, SPSS для windows, версия 6, SPSS Inc.) для подтверждения статистической значимости полученных результатов с последующим многоуровневым сравнением по методу Bonferroni, в котором статистическую значимость наблюдали с уровнем значимости порядка 5%. 

Такая модель очень похожа на воспалительное заболевание кишечника человека и, таким образом, было продемонстрировано, что антитело против рецептора IL-6 является эффективным профилактическим или терапевтическим агентом для такого воспалительного заболевания кишечника, как язвенный колит или болезнь Крона. 

Изменение веса тела выражали в виде сродного значения стандартное отклонение в группе. 

Оценку заболевания кишечника выражали в виде среднего значения в группе. 

Справочный пример 1. Приготовление рецептора человеческого растворимого IL-6. 

Рецептор растворимого IL-6 получали методом PCR с использованием плазмиды pBSF2R.236, содержащей кДНК, которая кодирует рецептор IL-6, полученной по способу Yamasaki с сотр., (Yamasaki, К., с сотр., Science (1988) 241, 825-828). Плазмиду pBSF2R.236 переваривали с рестриктазой Sph I с получением кДНК рецептора IL-6, которую затем вставляли в mp18 (производимый Amersham). Используя синтетический олигопраймер, предназначенный для инсерции терминирующего кодона в кДНК рецептора IL-6, в кДНК рецептора IL-6 проводили мутацию методом PCR, с использованием системы мутагенеза in vitro (выпускаемой Amersham). В результате такой методики происходила инсерция терминирующего кодона на уровне аминокислоты в положении 345 и получали кДНК, кодирующую рецептор растворимого IL-6. 

С целью экспрессии кДНК рецептора растворимого IL-6 в клетках СНО, проводили лигирование с плазмидой pSV (выпускаемой Pharmacia) с получением плазмиды pSVL344. кДНК рецептора растворимого IL-6, которую расщепляли с помощью Hind III-Sal I, вставляли в плазмиду pECEdhfr, содержащую кДНК dhfr с получением плазмиды pECEdhfr344, которая может быть экспрессирована в клетках СНО. 

10 мг плазмиды pECEdhfr344 трансфецировали в dhfr-CHO клеточную линию DXB-11 (Uriand с сотр., Proc.Natl. Acad.Sci. США (1980) 77, 4216-4220) методом осаждения в фосфате кальция (Chen С., с сотр., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Трансфецированные клетки СНО культивировали в течение 3 недель в не содержащую нуклеозида селекционную среду MEM, содержащую 1 мМ глутамина, 10% диализированного FCS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. 

Отобранные клетки СНО подвергали скринингу методом серийных разведений с получением единичного клона клеток СНО. Такой клон клеток СНО амплифицировали в 20 - 200 нМ метотрексате (МТХ) с получением СНО клеточной линии 5Е27, которая продуцирует рецептор человеческого растворимого IL-6. СНО клеточную линию 5Е27 культивировали в среду Дульбеко, модифицированную по способу Исков (IMDM, выпускаемую Gibco), содержащую 5% FBS. Культуральный супернатант собирали и концентрацию рецептора растворимого IL-6 в культуральном супернатанте определяли методом ELISA. Полученный результат подтвердил, что рецептор растворимого IL-6 присутствует в культуральном супернатанте. 

Справочный пример 2. Получение антитела против человеческого IL-6. 

Десятью мкг рекомбинантного IL-6 (Hirano с сотр., Iiranunol. Lett., 17: 41,1988) иммунизировали мышей вида BALB/c совместно с полным адъювантом Freund и эту операцию повторяли каждую неделю до момента детекции антитела против IL-6 в сыворотке. Иммунные клетки удаляли из отдельного лимфатического узла и затем сливали с миеломной клеточной линией P3U1 с использованием полиэтиленгликоля 1500. Гибридомы подвергали селекции по методу Oi с сотр., (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman и Co., San Francisco, 351, 1980), в котором использовали среду HAT, и в результате получали гибридому, которая продуцировала антитело против IL-6. 

Гибридому, продуцирующую антитело против человеческого IL-6, подвергали анализу на связывание IL-6, который проводили следующим образом. Для этого, 96-луночный микропланшет для тестирования из гибкого поливинила (выпускаемый Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va) покрывали 100 мкл козьих антител против мышиного 1 g (10 мкл/мл), (выпускаемых Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) в течение ночи при 4oС. Далее, микропланшет обрабатывали PBS, содержащим 1% альбумина коровьей сыворотки (BSA), при комнатной температуре в течение 2 часов. 

После промывания системы в PBS, в каждую лунку добавляли по 100 мкл супернатанта гибридомной культуры и после этого проводили инкубацию в течение ночи при 4oС. Планшет промывали, в каждую лунку добавляли меченный изотопом 125I IL-6 до концентрации 2000 импульсов в минуту/0,5 нг/лунку и затем радиоактивность каждой лунки после промывания определяли счетчиком гамма-частиц (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Из 216 гибридомных клонов, 32 были положительными в анализе связывания IL-6. Из таких клонов окончательно получали стабильный MH166. BSF2. Антитело против IL-6 MH166, продуцированное указанной гибридомой, относилось к подтипу IgGI k. 

Затем, IL-6-зависимый клон мышиной гибридомы MH60.BSF2 использовали для изучения нейтрализующей активности, касающейся роста гибридомы под воздействием антитела MH166. Клетки MH60.BSF2 дозировали пипеткой до концентрации l104/200 мкл/лyнкy и добавляли образцы, содержащие антитело MH166, проводили культивирование в течение 48 часов, добавляли 0,5 м Сi/лунку 3H-тимидина (New Ingland Nuclear, Boston, Ma), после чего культивацию продолжали еще в течение 6 часов. Клетки помещали на стеклофильтровальную бумагу и обрабатывали автоматическим харвестором (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan). В качестве контрольного образца использовали антитело против IL-6 кролика. 

В результате МН166 антитело ингибировало доза-зависимым образом, внедрение 3H-тимидина в клетки MH60.bsf2, индуцированные IL-6. Полученный результат позволил установить, что антитело МН166 нейтрализует активность IL-6. 

Справочный пример 3. Получение антитела рецептора человеческого aнти-IL-6

Антитело против рецептора IL-6 MT18, полученное по методу Hirata с сотр. , (Hirata, Y. с сотр., J.Immunol., 143, 2900-2906,1989), связывали с CNBr-активированной Sepharose 4B (выпускаемой Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NY) в соответствии с режимом присоединения, и очищали рецептор IL-6 (Yamasaki, К. с сотр., Science (1988), 241, 825-828). Линию клеток человеческой миеломы U266 солюбилизировали 1 мМ гидрохлоридом фторида п-пара-аминофениламиносульфонила (выпускаемого Wako Chemicals), содержащего 1% дигитонина (выпускаемого Wako Chemicals), 10 мМ триэтаноламина (рН 7,8) и 0,15 М NaCl (дигитониновый буфер) и смешивали с антителом MT18, связанным с гранулами Sepharose 4B. Затем, гранулы шесть раз промывали дигитониновым буфером для получения частично очищенного рецептора IL-6. 

Мышей BALB/с иммунизировали по четыре раза каждые десять дней упомянутым выше частично очищенным рецептором IL-6, полученным из 3109 клеток U266, и затем стандартным способом получали гибридому. Супернатант гибридомной культуры из ростоположительной лунки испытывали на активность связывания с рецептором IL-6 согласно описанному ниже способу. 5107 клеток U266 метили 35S-метионином (2,5 м Сi) и солюбилизировали указанным выше дигитониновым буфером. Солюбилизированные клетки U266 смешивали с 0,04 мл антитела МТ18, связанного с гранулами Sepharose 4B, и затем систему шесть раз промывали дигитониновым буфером. Меченный изотопом 35S рецептор IL-6 элюировали 0,25 мл дигитонинового буфера (рН 3,4) и нейтрализовали в 0,025 мл 1М Трис-буфера (рН 7,4). 

0,05 мл супернатанта культуры гибридомы смешивали с 0,01 мл белка G Сефарозы (выпускаемой Pharmacia). После промывания, Сефарозу инкубировали в присутствии 0,005 мл раствора меченного изотопом 35S рецептора IL-6, полученного, как описано выше. Иммунопреципитат анализировали методом SDS-PAGE с целью поиска супернатанта культуры гибридомы, реагирующего с рецептором IL-6. В результате, устанавливали положительный гибридомный клон РМ-1. Антитело, продуцированное гибридомой РМ-1, относилось к подтипу IgGlk. 

Ингибирующую активность антитела, продуцированного гибридомой РМ-1, связывания IL-6 с рецептором человеческого IL-6, изучали с использованием линии клеток человеческой миеломы U266. Человеческий рекомбинантный IL-6 получали из E.coli (Hirano с сотр., Immunol. Lett., 17:41-45, 1988) и метили изотопом 125I с использованием реагента Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga,T с сотр., J.Exp. Med. (1987) 166, 967-981). 4105 клеток U266 культивировали с 70% (об./об.) культуральным супернатантом гибридомы РМ-1 совместно с IL-6, меченным изотопом 125I 14000 импульсов/мин, в течение 1 часа при комнатной температуре. Образец в количестве 70 мкл наслаивали на 300 мкл FCS в 400 мкл полиэтиленовой пробирки микрофуги. После центрифугирования, определяли радиоактивность клеток. 

Полученный результат позволил установить, что антитело, продуцированное гибридомой РМ-1, ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6. 

Справочный пример 4. Получение антитела против рецептора мышиного IL-6. 

Моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6 получали согласно способу, описанному в работе Saito, с сотр., J.Immunol. (1993) 147, 168-173,

Клетки СНО, продуцирующие рецептор мышиного растворимого IL-6, культивировали в среде IMDM, содержащей 10% FCS. Из супернатанта культуры, рецептор мышиного растворимого IL-6 выделяли с использованием мышиного растворимого IL-6 рецепторного антитела RS12 (см. Saito, с сотр., выше) и афинной колонки с неподвижным гелем Affigel 10 (выпускаемого Biorad). 

Рецептор мышиного растворимого IL-6 (50 мкг) смешивали с полным адъювантом Фрейнда, который затем инъецировали в брюшную полость крыс Wistar. Через 2 недели после применения, животных повторно иммунизировали полным адъювантом Фрейнда. На 45-й день крыс умертвляли, и клетки селезенки в количестве 2108 сливали с 1107 клетками мышинной миеломы P3U1, с использованием 50% PEG1500 (Boehringer Mannheim) и традиционного способа, после чего подвергали скринингу с применением культуральной среды HAT. 

После того, как супернатанты культуры гибридом добавляли в планшет, покрытый кроличьим антителом против крысиного IgG (выпускаемого Cappel), добавляли рецептор мышиного растворимого IL-6. Затем, с использованием антитела против мышиного кроличьего рецептора IL-6 и овечьего анти-кроличьего IgG, меченного щелочной фосфатазой, гибридомы, продуцирующие антитела против рецептора мышиного растворимого IL-6, подвергали скринингу с помощью ELISA. После подтверждения продуцирования желаемого антитела, клоны гибридом дважды повторно скринировали для получения единственного гибридомного клона. Этот клон обозначали, как MR16-1. 

Нейтрализующую активность антитела, продуцированного гибридомой при сигнальной трансдукции мышиного IL-6, изучали инкорпорацией 3H-тимидина с использованием клеток MH60. BSF2 (Matsuda,T. с сотр., J.Immunol. (1988) 18, 951-856). Клетки MH60.BSF2 получали в количестве 1104 клеток/200 мкл/лунку в 96-луночном микропланшете. В каждую лунку добавляли 10 пг/мл мышиного IL-6 и антитела MR16-1 или антитела RS12 в количестве 12,3-1000 нг/мл, после чего проводили культивацию при 37oС в течение 44 часов в 5% СО2 и после этого добавляли 1 мк Сi/лунку 3H-тимидина. Через 4 часа, измеряли включение 3H-тимидина. В результате было установлено, что антитело MR16-1 подавляет включение 3H-тимидина в клетку MH60.BSF2. 

Таким образом, было показано, что антитело, продуцированное гибридомой МК16-1, ингибирует связывание IL-6 с рецептором IL-6. 

Промышленная применимость. 

В соответствии с настоящим изобретением было показано, что такой антагонист IL-6, как антитело против рецептора IL-6, обладает терапевтическим действием на воспалительное заболевание кишечника. Таким образом, было продемонстрировано, что антагонист IL-6 является ценным терапевтическим агентом для лечения болезни Крона и язвенного колита. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Профилактический или терапевтический агент для лечения воспалительного заболевания кишечника, включающий в качестве активного ингредиента нейтрализующее антитело против рецептора интерлейкина-6 (IL-6). 

2. Профилактический или терапевтический агент по п. 1, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против рецептора IL-6. 

3. Профилактический или терапевтический агент по п. 2, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6. 

4. Профилактический или терапевтический агент по п. 2, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6. 

5. Профилактический или терапевтический агент по пп. 1-4, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой рекомбинантное антитело. 

6. Профилактический или терапевтический агент по п. 3, в котором моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6 представляет собой антитело РМ-1. 

7. Профилактический или терапевтический агент по п. 4, в котором моноклональное антитело против рецептора мышиного IL-6 представляет собой антитело MR16-1. 

8. Профилактический или терапевтический агент по любому из пп. 1-3, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой химерное или гуманизированное антитело против рецептора IL-6. 

9. Профилактический или терапевтический агент по п. 8, в котором гуманизированное антитело против рецептора IL-6 представляет собой гуманизированное рМ-1 антитело. 

10. Профилактический или терапевтический агент по любому из пп. 1-9, в котором воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона или язвенный колит. 

11. Агент для подавления потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, включающий в качестве активного ингредиента нейтрализующее антитело против рецептора IL-6. 

12. Способ профилактики или лечения воспалительного заболевания кишечника, заключающийся во введении объекту лечения нейтрализующего антитела против рецептора IL-6. 

13. Способ по п. 12, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против рецептора IL-6. 

14. Способ по п. 13, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6. 

15. Способ по п. 13, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой моноклональное антитело против мышиного рецептора IL-6. 

16. Способ по любому из пп. 12-15, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой рекомбинантное антитело. 

17. Способ по п. 14, в котором моноклональное антитело против рецептора человеческого IL-6 представляет собой антитело РМ-1. 

18. Способ по п. 15, в котором моноклональное антитело против рецептора мышиного представляет собой антитело MR16-1. 

19. Способ по любому из пп. 12-14, в котором антитело против рецептора IL-6 представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело против рецептора IL-6. 

20. Способ по п. 19, в котором гуманизированное антитело против рецептора IL-6 представляет собой гуманизированное антитело РМ-1. 

21. Способ по любому из пп. 12-20, в котором воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона или язвенный колит. 

22. Способ уменьшения потерь веса при воспалительном заболевании кишечника, включающий назначение объекту лечения нейтрализующего антитела против рецептора IL-6.