АНТИГЕННЫЙ СОСТАВ ЧУМНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ

АНТИГЕННЫЙ СОСТАВ ЧУМНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ


RU (11) 2190424 (13) C1

(51) 7 A61K39/02 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2002.10.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001120156/14 
(22) Дата подачи заявки: 2001.07.18 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.07.18 
(45) Опубликовано: 2002.10.10 
(56) Аналоги изобретения: BAKER E.E., FOSTER L.E., MEYER K.F. et al. J. Jmmunol, 1952, v.68, №2, р.131-145. RU 2118362 C1, 27.08.1998. RU 2155962 С1, 09.10.2000. RU 2147234 С1, 27.08.1998. US 5985285 А, 16.11.1999. 
(71) Имя заявителя: Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации 
(72) Имя изобретателя: Бывалов А.А.; Евстигнеев В.И.; Дармов И.В.; Пименов Е.В. 
(73) Имя патентообладателя: Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации 
(98) Адрес для переписки: 610000, г.Киров-Центр, Октябрьский пр-т, 119, НИИМ МО РФ, Начальнику 

(54) АНТИГЕННЫЙ СОСТАВ ЧУМНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 

Изобретение относится к медицине и предназначено для совершенствования средств вакцинопрофилактики чумы, а именно разработки чумной химической вакцины, и касается антигенного состава чумной химической вакцины. В качестве антигенного состава чумной химической вакцины предлагается использование капсульного антигена ФI фракции I Y.pestis, а также, дополнительно, Б-антигена, выделяемого из биомассы клеток Y.pseudotuberculosis. Б-антиген представляет собой крупномолекулярный антигенный комплекс, включающий полисахаридную, белковую и липидную компоненты. Преимущество изобретения заключается в том, что первичная иммунизация препаратом, включающим антигены ФI и Б, способна индуцировать развитие выраженной специфической невосприимчивости к чумной инфекции у белых мышей, морских свинок и обезьян павианов, гамадрилов, а также характеризуется умеренной постпрививочной реакцией для экспериментальных животных. 5 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для разработки средств специфической профилактики чумы.

В настоящее время для специфической профилактики чумы разрешены к применению на людях вакцины: чумная живая на основе микробов штамма EV и инактивированные ("армейская" вакцина USP, США и вакцина Хавкина, Индия), которые используются для первичной иммунизации. Ведутся исследовательские работы по конструированию чумной химической вакцины, в частности, на основе ФI-антигена (Meyer K. F. , Hightower J.A., McCrumb F.R.// J.Infect. Dis. - 1974. - Vol.129. May. Suppl. - P.41-45; Бывалов А.А., Паутов В.Н., Чичерин Ю. В. и др. // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1984.- 4. - С. 74-76) или комплекса антигенов, одним из которых является ФI-антиген: ФI+V-антигены (Eyles J.E., Spiers I.D., Williamson E.D., Alpar H.O.// Vaccine. - 1998. Vol.16, 20. - P.2000-2009), ФI+ОСА (Дальвадянц С.М., Белобородов Р. А. , Сероглазов В.В. и др.// Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997 г., Саратов, 1997.) и др. Названные антигенные препараты могут быть использованы при создании чумной химической вакцины, предназначенной для ревакцинации людей, первично привитых чумной живой вакциной, так как имеют в своем составе ФI-антиген, являющийся эффективным ревакцинирующим препаратом для животных, грундиммунизированных живой вакциной. Экспериментальных данных о способности указанных препаратов индуцировать значимый уровень невосприимчивости к чуме при первичной иммунизации ими морских свинок и приматов (животных, используемых для оценки эффективности чумных вакцин) в литературе не имеется.

Известна вакцина чумная живая сухая на основе микробов штамма EV, иммунизаторное действие которой основано на приживлении и размножении в макроорганизме клеток вакцинного штамма. Вакцина, выпускаемая НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров, в соответствии с регламентом производства 377-97 и фармакопейной статьей ФС 42-3877-99, представляет собой пористую массу серовато-белого или слегка желтоватого цвета, содержащую живую культуру вакцинного штамма чумного микроба EV линии НИИЭГ, высушенную методом лиофилизации в стабилизирующей среде. Общим существенным признаком с заявляемым антигенным составом является то, что вакцина предназначена для первичной иммунизации людей против чумы, а также для их ревакцинации через 1 год (в особых случаях через 6 мес.) после первичной прививки вакцины.

Недостатками названной живой вакцины являются выраженная реактогенность, опасность поствакцинальных осложнений, сложность обеспечения точной дозировки, неэффективность в условиях проведения антибиотикопрофилактики.

Известна чумная вакцина USP, представляющая собой взвесь инактивированных формальдегидом чумных бактерий, выращенных при температуре 37oС, в концентрации 2109 микробов/мл. Вакцина USP, производимая фирмой "Cutter Biological", Berkeley, США, по правительственной лицензии 8, включает помимо "убитых" микробов в растворе NaCl для инъекций, содержащих ФI-антиген, 0,04% формалина, следовые количества экстракта сердечной мышцы быка, дрожжевого экстракта, агара, пептонов и пептидов сои и казеина и 0,5% фенола в качестве консерванта.

Вакцина USP используется следующим образом. Первичная иммунизация включает две или три инъекции вакцины в дельтовидную мышцу: первая - в объеме 1 мл, вторая - в объеме 0,2 мл спустя 1-3 мес. и третья - в объеме 0,2 мл через 3-6 мес. после второй инъекции. Бустерное введение вакцины рекомендовано в объеме 0,2 мл через каждые 6 мес. после предшествующей инъекции препарата. К недостаткам вакцины USP следует отнести ее относительно невысокую протективность для предупреждения бубонной формы чумы и неэффективность в отношении легочной формы заболевания (Edsall G.// Military Med. - 1963. - V.128, 1. - Р.37-39 и др.). Указанные недостатки обусловлены отсутствием или недостаточным содержанием в вакцинном препарате антигена (антигенов), который является основным иммуногеном чумного микроба для морских свинок, приматов и, по-видимому, человека. Указанное обстоятельство объясняется, по нашим данным, неспособностью возбудителя чумы при его выращивании в условиях in vitro продуцировать значимые количества такого иммуногена.

Общими существенными признаками с заявляемым антигенным составом являются наличие в препарате ФI-антигена как одного из компонентов микробной клетки, а также то, что они предназначены для использования в составе вакцинных препаратов не только для ревакцинации, но и для первичной иммунизации против чумы без предшествующей грундиммунизации живой чумной вакциной.

Наиболее близкой к заявляемому антигенному составу чумной химической вакцины является фракция I (ФI, ФI-антиген) чумного микроба (Baker E.E., Foster L.E., Meyer K.F. et al.// J.Immunol. - 1952. - V.68, 2. - Р.131-145), представляющая собой водорастворимый белково-полисахаридный (ФIА) или белковый (ФIВ) антиген. ФI-антиген обладает высокой протективной активностью в отношении возбудителя чумы при первичной иммунизации белых мышей и крыс, но не морских свинок и приматов. Фракция I является эффективным ревакцинирующим препаратом для экспериментальных животных, первично привитых живой чумной вакциной. В настоящее время разрабатывается чумная химическая вакцина на основе ФI-антигена, предназначенная для ревакцинации людей, предварительно иммунизированных живой чумной вакциной (Дубровин М.Ю., Чичерин Ю.В., Додонов Н. П. и др.// Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний (тез.докл. к Межведомственной науч.конф. 26-28 марта 1991 г.) - 1991. Киров, 1991. - С.126-128).

Недостатком фракции I как протективной основы чумной химической вакцины является ее низкая эффективность при первичной иммунизации экспериментальных животных (морских свинок, обезьян павианов гамадрилов), исключающая возможность конструирования соответствующего вакцинного препарата для людей.

Общим существенным признаком с заявляемым антигенным составом является использование в качестве одного из иммуногенов ФI-антигена.

Задачей изобретения является создание антигенного состава чумной химической вакцины, предназначенной как для первичной иммунизации, так и для ревакцинации после иммунизации живой чумной вакциной.

Поставленная задача решается благодаря тому, что наряду с уже известным ФI-антигеном заявляемый антигенный состав препарата дополнительно содержит Б-антиген.

Препарат Б-антигена представляет собой слегка опалесцирующую жидкость. Б-антиген является крупномолекулярным антигенным комплексом, включающим полисахаридную, белковую и липидную составляющие, относительно прочно связанные между собой.

Предложенный препарат Б-антигена получают из культуральной жидкости глубинной аэрируемой культуры псевдотуберкулезного микроба штамма 681 (музей микробных культур НИИМ МО РФ), выращенной в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса при температуре (371)oС в течение 27-36 ч, с использованием методов ультра-, микрофильтрации и высаливания сульфатом аммония.

Препарат Б-антигена способен вызывать формирование специфической невосприимчивости при первичной однократной иммунизации морских свинок в отношении как подкожного, так и аэрогенного способов заражения животных культурой капсулообразующих штаммов возбудителя чумы. Первичная иммунизация морских свинок Б-антигеном индуцирует защиту животных и при аэрогенном заражении вирулентной культурой бескапсульного штамма возбудителя чумы, что является важным достоинством, учитывая наличие циркулирующих в природе штаммов Y.pestis, не синтезирующих ФI-антиген. Учитывая вышеизложенное, использование для иммунизации сочетания двух антигенов (ФI и Б) позволяет считать реальным разработку такого вакцинного препарата, который был бы эффективен при первичной иммунизации и морских свинок, и белых мышей - лабораторных животных двух видов, принятых для оценки иммунобиологических свойств чумных вакцин.

Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно: первичная однократная иммунизация морских свинок комбинацией двух антигенов (ФI и Б), в основном, за счет последнего из них вызывает формирование специфической невосприимчивости животных к заражению культурами капсулообразующего (ФI+) и бескапсульного (ФI-) штаммов возбудителя чумы. Иммунизация морских свинок препаратами только ФI-антигена (прототип) или вакцины USP (аналог), проведенная в аналогичных условиях, не обеспечивает выраженной защиты животных от чумной инфекции.

Первый из заявляемой комбинации антигенов, ФI-антиген, получают либо из ацетонвысушенных клеток возбудителя чумы (Baker Е.Е., Foster L.E., Meyer K. F. et al. // J.Immunol. - 1952.- V. 68, - 2. - Р.131-145), либо из культуральной жидкости после глубинного выращивания чумных микробов (Вейнблат В.И. , Дальвадянц С. М. , Веренков М.С.// Лабораторное дело. - 1983. - 12. - С. 37-39).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Получение антигенов ФI и Б.

Препарат ФI-антигена получали в соответствии с опубликованным методом (Вейнблат В.И., Дальвадянц С.М., Веренков М.С.// Лабораторное дело. - 1983. - 12. - С.37-39). Раствор ФI-антигена имел серологическую активность в реакции двойной диффузии в геле с антисывороткой к ФI-антигену, равную 512 АЕ, и содержал 2,0 мг/мл сухого вещества.

Для получения препарата Б-антигена использовали штамм 681 Y.pseudotuberculosis, I серотип, депонированный в музее микробных культур НИИМ МО РФ. Глубинное выращивание проводили в ферментере МД-300, "Marubishi", Япония, в среде на основе ферментативного гидролизата мяса с использованием в качестве источника углеводного питания галактозы. Культивирование вели при температуре (371)oС в течение 30 ч при постоянном аэрировании и перемешивании. Культуральную жидкость отделяли от клеток центрифугированием, затем ее концентрировали ультрафильтрацией (порог - 10000 Д), стерилизовали микрофильтрацией (диаметр пор - 0,2 мкм). Б-антиген из концентрата культуральной жидкости выделяли с помощью высаливания сульфатом аммония. Препарат ресуспендированного в забуференном фосфатами физиологическом растворе и отдиализованного против него же Б-антигена имел в реакции двойной диффузии в геле по Оухтерлони 32 АЕ с антисывороткой к Б-антигену и содержал 0,4 мг/мл сухого вещества.

Пример 2. Протективные свойства заявляемого антигенного состава препарата для экспериментальных животных, зараженных культурой возбудителя чумы.

В табл. 1 представлены результаты изучения защитных свойств заявляемого антигенного состава препарата - ФI и Б и препаратов сравнения для экспериментальных животных, зараженных подкожным и аэрогенным способами вирулентной культурой возбудителя чумы, штамм 1300, через 21 сутки после однократной подкожной иммунизации депонированными в неполном адъюванте Фрейнда антигенными препаратами.

Как видно из табл.1, препарат Б-антигена в указанной дозе вызывал, в отличие от ФI-антигена, развитие выраженной специфической невосприимчивости у морских свинок как к подкожному, так и к аэрогенному заражению культурой возбудителя чумы - выжило соответственно 100% и 80% иммунизированных животных. Совместное введение двух антигенов (ФI и Б) защитило всех взятых в опыт животных при обоих способах инфицирования.

В табл. 2 представлены результаты подкожного заражения культурой возбудителя чумы морских свинок и белых мышей, иммунизированных заявляемым антигенным составом препарата (антигены ФI и Б в весовом соотношении 1,0:0,7) в нарастающих с 4-кратным шагом дозах, а также отдельными антигенами в аналогичных дозах. Для белых мышей Б-антиген оказался непротективным, значения показателя ЛД50 после иммунизации ФI-антигеном и заявляемым препаратом составили 2,0:1,20 мкг и 0,7:1,97 мкг соответственно.

Последний из указанных препаратов индуцировал выраженную защиту морских свинок и, как это видно из табл. 2, в основном, за счет Б-антигена. Следует отметить, что каждый из двух антигенов заявляемого препарата стимулирует иммуногенность другого как для морских свинок, так и для белых мышей (р<0,05).50, в то время как иммунизация препаратом сравнения (ФI-антиген) не предотвратила гибели от первично легочной чумы ни одной из двух обезьян.

Пример 3. Реактогенные свойства заявляемого антигенного состава препарата для экспериментальных животных.

Реактогенные свойства заявляемого антигенного состава изучали, оценивая его "острую" (табл.4) и "хроническую" (табл.5) токсичность при введении морским свинкам - лабораторным животным, наиболее чувствительным к воздействию Б-антигена.

Как видно из данных, представленных в табл. 4, гибели животных от интракордиального введения заявляемого препарата в испытанных дозах не отмечали; снижения массы тела также зафиксировано не было. При оценке "хронической" токсичности препарата (табл.5) достоверного снижения массы тела морских свинок не зарегистрировано (препарат вводили в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека в пересчете на 1 кг массы тела). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Антигенный состав чумной химической вакцины, включающий ФI-антиген Y. pestis, отличающийся тем, что он дополнительно содержит Б-антиген, выделенный из культуры Y. pseudotuberculosis.