ВЫСОКОАКТИВНЫЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ЦИКЛОСПОРИНА А И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

ВЫСОКОАКТИВНЫЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ЦИКЛОСПОРИНА А И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2272643 (13) C2

(51) МПК
A61K 38/13 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.03.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004117751/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.06.11 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.06.11 
(45) Опубликовано: 2006.03.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2182577 С2, 20.05.2002. US 6486124 В2, 26.11.2002. US 6551619 В1, 22.04.2003. LECHUGA-BALLESTEROS D et al., Properties and stability of a liquid crystal form of cyclosporine - the first reported naturally occurring peptide that exists as a thermotropic liquid crystal, J Pharm Sci., 2003 Sep; 92(9), P.1821-1831. 
(72) Имя изобретателя: Бибикова Маргарита Васильевна (RU); Спиридонова Инна Анатольевна (RU); Грамматикова Наталья Эдуардовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Бибикова Маргарита Васильевна (RU) 
(98) Адрес для переписки: 125167, Москва, ул. Красноармейская, 26, корп.1, кв.28, М.В. Бибиковой 

(54) ВЫСОКОАКТИВНЫЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ЦИКЛОСПОРИНА А И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Изобретение относится к фармакологии пептидов, а именно к высокоактивному кристаллическому препарату циклоспорина А и способу его получения. Сущностью изобретения является высокоактивный кристаллический препарат циклоспорина А (ВКПЦ), представляющий собой циклический ундекапептид, полученный из гриба рода Tolypocladium inflatum subsporum blastospomm, выращенного на культуральной среде, дополнительно содержащей рубомицин в концентрации 2 мкг/мл и сернокислый цинк в концентрации 5 мг/мл, ферментационная среда содержит в качестве основных компонентов мальтекс и D,L-валин, конечная концентрация в среде препарата составляет 2,0-2,5 мг/мл, а продукт выделен из высушенных мицелиев гриба экстракцией петролейным эфиром до и после очистки хроматографией на силикагеле и кристаллизован в системе гексан - ацетон (4:1). Техническим результатом является создание эффективного препарата циклоспорина, в котором циклоспорин А составляет 80-85%. 2 н.п. ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к области фармакологии пептидов, точнее к получению высокоактивного кристаллического препарата циклоспорина А и способа его получения.

Циклоспорины представляют собой класс сходных по структуре циклических поли-N-метилированных ундекапептидов. Они включают природные циклоспорины А, В, С, D и G, а также их производные дигидроциклоспорины, полученные путем химических модификаций. Наибольшую известность среди этих антибиотиков получил циклоспорин А (ЦА), нашедший применение в хирургической практике при пересадке органов и тканей. Циклоспорин А является нейтральным циклопептидом, содержащим 11 аминокислот. Этот препарат является антигрибковым антибиотиком узкого спектра действия, так как избирательно подавляет рост Aspergillus niger и Curvularia lunata, являясь при этом неактивным в отношении дрожжей, грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Циклоспорины представляют принципиально новый класс важных иммунодепрессивных препаратов. На клеточном уровне их действие оказывается исключительно специфичным и направлено на субпопуляцию Т-лимфоцитов. В клинической практике циклоспорин А играет важную роль при трансплантации органов и тканей. В настоящее время изучается эффективность циклоспорина при широком круге аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний, включая идиопатический нефротический синдром, псориаз, увеит, инсулинзависимый сахарный диабет, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, первичный билиарный цирроз и др.

Циклоспорин как антигрибной и иммуносупрессивный антибиотик, продуцируемый грибными культурами Cylindrocarpon lucidum (депонирован в США в Объединенном Департаменте Сельского хозяйства под номером NRRL 5760) и Tolypocladium inflatum (депонирован в той же коллекции под номером NRRL 8044) был описан в патенте Швейцарии №528474, 1974. Аналог США №41174527/76, А 61 К 37/00, С 07 С 103/52, 1976. В научной литературе циклоспорин, его продуценты, способ биосинтеза и выделения были опубликованы Dreyfuss M. Et al. J.Appl. Microb. 1976. - №3, - р.125-133.

В дальнейшем были запатентованы и описаны другие грибные культуры, продуцирующие циклоспорин: Tolypocladim grodes, T.Nubicola, Т.Terricola, T.cylindrosporum, Т.tundrense, Chhaunopycnis alba, Aphanocladium sp., Beauveria bassiana, B. Brongniarti, Acremonium spp., Paecilomyces spp., Verticillium spp., Isaria felina, Fusarium spp., Trichoderma viride, Neocosmospora vasinfecta (Dreyfuss MM., Chapela IH. In The discovery of natural products with therapeutic Potential. Ed. Gullo VP., Butterworth-Heinemann, 1994, p.49-80), Sesquicillopsis rosariensis (4895207/13, опубл. 20.09.96, бюл. 26б Дрезден ГмбХ (DE), Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum (a.c. СССР 1830947, 27.10.1988, а.с. СССР 1836425, 23.08.1993). Активность культуральной жидкости составляет 600-1300 мкг/мл при культивировании от 6 до 14 суток и 3150 мкг/мл через 14 дней культивирования штамма Sesquicillopsis rosariensis F605. В описанных патентах предлагается способ получения комплекса циклоспоринов, в котором циклоспорин А составляет 55-65%.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного препарата циклоспорина и способа его получения, при котором биосинтез проводится в течение 6-7 суток, а содержание циклоспорина А в конце ферментации составляет 2000-2500 мкг/мл. Образуется комплекс циклоспоринов, в котором циклоспорин А составляет 80-85%.

Преимущественное образование циклоспорина А облегчает его очистку и повышает выход целевого продукта.

Получение циклоспорина А совершенствовалось и модифицировалось, появились и кристаллические формы циклоспорина (см. патент RU 2002754, 1993, патент RU 2066687, 1996). К защите, в основном, представлены различные модификации гриба рода Tolypocladium, выращенные на различных средах (патент RU 2112807, 1998) и очищенные в различных условиях (патент US 582655, 1995). Наиболее близкими по решаемой задаче можно считать патент RU 2170741, 2001 (способ получения циклоспорина) и патент RU 2182577, 2002 (способ получения циклоспорина А высокой чистоты).

Технической задачей настоящего изобретения является создание очищенного кристаллического препарата и способа получения циклоспорина А, с высокой удельной активностью на единицу объема культуральной среды (до 2500 мкг/мл).

Поставленная задача решается тем, что создан высокоактивный кристаллический препарат циклоспорина А (ВКПЦ), представляющий собой кристаллическую форму циклического ундекапептида, полученного из гриба рода Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum, этот род микрогриба зарегистрирован в коллекции Государственного научного Центра по антибиотикам за №330А, при культивировании его на стандартной агаризованной среде с последующей ферментацией, выделением, очисткой и кристаллизацией получен целевой продукт, при этом культуральная среда дополнительно содержит рубомицин в концентрации 2 мкг/мл и 5 мг/мл сернокислого цинка, а ферментационная среда содержит мальтекс и D,L-валин в качестве основных компонентов, при конечной концентрации в среде ВКПЦ 2,0-2,5 мг/мл, а продукт выделен из высушенных мицелиев гриба экстракцией петролейным эфиром до и после очистки хроматографией на силикагеле и кристаллизован в системе гексан - ацетон (4:1). 

Продукт ВКПЦ представляет собой кристаллическую форму циклического ундекапептида, который получен из гриба рода Tolypocladium inflatum subsporum blastosporum, зарегистрированного в коллекции Государственного научного Центра по антибиотикам за №330А при культивировании на стандартных средах, отличающийся тем, что в агаризованную культуральную среду Райстрика дополнительно вносят рубомицин 2,0 мкг/мл и сернокислый цинк 5 мг/мл. Споровым материалом с мицелием культуры, выращенной на агаровой среде при 24°С, засевают посевную среду следующего состава, мас.%:

Соевая мука 3,0-3,5 
Глицерин 2,5-3,5 
Калий фосфорнокислый од незамещенный 0,3-0,6 
Натрий хлористый 0,5-0,8 
Меласса 2,5-3,0 
Водопроводная вода 


Среда имеет рН 6,5.

Объем среды в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл - 50 мл. Культивирование проводят на качалках при 200-220 об/мин в течение 48 часов. Культуральную жидкость из посевных колб в количестве 10% засевают ферментационную среду следующего состава, мас.%:

Мальтекс 4,0-8,0 
Соевая мука 1,0-2,0 
Дрожжевой экстракт 2,0-6,0 
Глицерин 1,0-1,5 
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1,0-1,2 
Натрий азотнокислый 0,2-0,5 
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,3 
Вода водопроводная 
D,L-Валин 0,4-0,6 


Среда имеет рН 6,5.

Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, объем питательной среды в колбе - 50 мл. Культивирование осуществляют при 24°С в течение 6-7 суток. Содержание циклоспорина А в культуральной жидкости составляет 2000-2500 мкг/мл.

Получается ферментационная жидкость с конечной концентрацией в ней ЦА 2,0-2,5 мг/мл, а продукт выделен из высушенного мицелия гриба экстракцией петролейным эфиром, с последующей очисткой хроматографией на силикагеле и кристаллизован в системе гексан - ацетон (4:1).

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения такого препарата.

Поставленная задача достигается тем, что разработан способ получения высокоактивного кристаллического препарата ВКПЦ, охарактеризованного выше, включающий культивирование гриба на агаризованной среде, ферментацию, выделение и очистку, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит рубомицин 2 мкг/мл и сернокислый цинк 5 мк/мл, а ферментационная среда содержит в качестве основных компонентов мальтекс и D,L-валин, далее отделяют мицелий гриба, содержащий комплекс циклоспоринов А, В, С, D от нативного раствора, сушат мицелий и экстрагируют целевой продукт петролейным эфиром до и после очистки хроматографией на силикагеле или окиси алюминия, фракции, содержащие циклоспорин А, объединяют и кристаллизуют в системе гексан - ацетон (4:1), с содержанием целевого продукта не менее 97,5%.

Другим объектом изобретения является способ получения препарата. 

Препарат, охарактеризованный выше, получают следующим образом:

- Получение агаризованного посевного материала.

- Получение вегетативного посевного материала.

- Получение высокоактивной культуральной жидкости. 

- Выделение: отделение мицелия, содержащего 90% комплекса циклоспоринов А, В, С, D, от нативного раствора, сушку его, экстракцию комплекса из высушенного мицелия петролейным эфиром или системой петролейный эфир - ацетон (10:1), хроматографическое разделение комплекса циклоспоринов на колонке с силикагелем (водная кремневая кислота, кизельгель), системой петролейный эфир - ацетон (4:1) или на колонке с окисью алюминия системой петролейный эфир - ацетон (7:3), осаждение гексаном или кристаллизацию в системе гексан - ацетон (4:1).

Отделение мицелия от культуральной жидкости проводят центрифугированием или фильтрацией в вакуум-барабанном фильтре или на рамном фильтр-прессе с намывным слоем вспомогательного фильтрующего средства - фильтроперлита (около 10 грамм на литр культуральной жидкости). Содержание влаги в полученном мицелии - 75%. Содержание влажной биомассы мицелия в культуральной жидкости составляет 20%. Отфильтрованный влажный мицелий высушивают в сушилке СП-30 в псевдоожиженном слое при температуре 45-50°С. Содержание влаги в высушенном мицелии около 6%. Выход циклоспоринового комплекса на стадии сушки около 80%. Содержание циклоспорина А в высушенном мицелии определяют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Комплекс циклоспоринов А, В, С, D экстрагируют из высушенного мицелия петролейным эфиром (температура кипения используемого петролейного эфира 70-100°С). Использование петролейного эфира является особенностью описанного способа, т.к. ЦА не растворяется в петролейном эфире, а экстракция его происходит за счет жировых примесей, образуемых продуцентом и содержащихся в мицелии, в которых растворяется циклоспориновый комплекс. В отличие от других экстрагентов петролейный эфир не образует эмульсий при экстракции и не экстрагирует окрашенные примеси. Выход циклоспоринов на стадии экстракции составляет 50-60% от содержания в сухом мицелии. Экстракт содержит комплекс циклоспоринов, в котором содержание циклоспорина А составляет около 80%, С, В, D около 20%. Для увеличения выхода на стадии экстракции в качестве экстрагента используется система петролейный эфир - ацетон (10:1), однако экстракт будет содержать небольшое количество пигментов, что приводит к необходимости вводить дополнительную стадию хроматографической очистки. При пропускании экстракта через столб силикагеля в колоночных условиях жировые примеси вытесняются с вытекающим раствором, а комплекс циклоспоринов сорбируется в верхнем слое силикагеля. После промывания колонки петролейным эфиром комплекс циклоспоринов элюируют системой петролейный эфир - ацетон (4:1). Элюат собирают фракционно и анализируют с помощью ТСХ на пластинках "Силуфол" в системе растворителей бензол - ацетон (2:1) с проявлением в парах йода и закреплением окраски 0,01% в водном растворе перманганата калия или с помощью ВЭЖХ. Фракции, содержащие циклоспорин А, объединяют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе. ЦА осаждают гексаном или кристаллизуют в системе гексан - ацетон (4:1), получают сырец препарата с содержанием циклоспорина А не менее 98,5% и примесью около 1,5%. Фракции с содержанием примесей более 1,5% объединяют и подвергают повторной хроматографической очистке на силикагеле (в системе петролейный эфир - ацетон (4:1)) или на окиси алюминия (в системе петролейный эфир - этилацетат (7:3)).

Анализ препаратов методом ВЭЖХ. Условия ВЭЖХ: колонка Zorbax С 18, 250 X 4,6 мм, 5 мкм. Температура термостатирования 70°С. Детектор 214 нм. Элюент: ацетонитрил - вода - ортофосфорная кислота 70:30:0,05 (объем/объем). Скорость потока 2,0 мл/мин.

Результаты такого анализа подтверждаются следующими примерами.

ПРИМЕР 1.

Агаризованную культуру выращивают на среде Райстрика, содержащей рубомицин 2 мкг/мл и сернокислый цинк 5 мк/мл, при 24°С в течение 10 суток. Споровым материалом с мицелием культуры 330А засевают посевную среду следующего состава, мас.%: Соевая мука - 3,0; Глицерин - 2,5; Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,3; Натрий хлористый - 0,5; Меласса - 2,5; Водопроводная вода; рН 6,5. Объем среды в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл - 50 мл. Культивирование проводят на качалках при 200-220 об/мин в течение 48 часов. Культуральную жидкость из посевных колб в количестве 10% засевают ферментационную среду следующего состава, мас.%: Мальтекс - 4,0, Соевая мука - 1,0; Дрожжевой экстракт - 2,0, Глицерин - 1,0; Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 1,0; Натрий азотнокислый - 0,2; Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1, Вода водопроводная; D,L-Валин - 0,4, рН 6,5.

Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, объем питательной среды в колбе - 50 мл. Культивирование осуществляют при 24°С в течение 6-7 суток. Содержание циклоспорина А в культуральной жидкости составляет 2000-2500 мкг/мл.

От одного литра культуральной жидкости, содержащей 2500 мкг/мл циклоспорина А, отделяют мицелий центрифугированием или фильтрованием и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 50°С в течение трех часов. Получают 150 г сухого мицелия. Комплекс циклоспоринов из сухого мицелия экстрагируют при перемешивании в течение трех часов сначала трехкратным объемом петролейного эфира (температура кипения 70-100°С), затем, после отделения мицелия центрифугированием, еще двумя объемами петролейного эфира. Экстракты объединяют и пропускают через силикагель, загруженный в петролейным эфире в колонку размером (высота к диаметру) 30 см : 4 см. После пропускания экстракта колонну промывают петролейным эфиром. Жировые примеси вымываются с вытекающим раствором, а комплекс циклоспоринов А, С, В, D сорбируется в верхнем слое силикагеля. Элюцию антибиотика осуществляют системой петролейный эфир - ацетон (4:1) со скоростью 10 мл/час. Анализ фракций на содержание циклоспоринов проводят методом ТСХ на пластинках силуфол (ЧССР Kavalier) в системе растворителей бензол - ацетон (2:1). Циклоспорины проявляют в парах йода с закреплением окраски пятен в 0,01% водном растворе перманганата калия. Фракции с циклоспорином А без визуального обнаружения на пластинках других циклоспоринов (В и D) объединяют, концентрируют в вакууме и осаждают 20-кратном объемом гексана. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, промывают гексаном и сушат в вакуум-сушильном шкафу при 50°С в течение двух часов. Фракции с примесями других циклоспоринов объединяют, концентрируют в вакууме и подвергают повторной хроматографической очистке в тех же условиях. Препарат с содержанием циклоспорина А не менее 98,5% объединяют. Получают 1,0 г субстанции. Выход циклоспорина А составляет 50% от содержания в сухом мицелии.

ПРИМЕР 2.

Получение спорового и вегетативного посевного материала проводят, как в примере 1. Ферментацию проводят на среде следующего состава, мас.%: Мальтекс - 8,0, Соевая мука - 2,0; Дрожжевой экстракт - 6,0, Глицерин - 1,5; Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 1,2; Натрий азотнокислый - 0,5; Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,3, Вода водопроводная; D,L-Валин - 0,6, рН 6,5. Ферментацию проводят, как в примере 1. Содержание циклоспорина А в культуральной жидкости составляет 2300-2500 мкг/мл.

Получение препарата ЦА из высушенного мицелия из одного литра культуральной жидкости с активностью 2 мг/кг проводят в аналогичных условиях на кизельгеле 60 (Merk) 0,04-0,05 мкм с 60% выходом и содержанием циклоспорина А 99,7%. 

ПРИМЕР 3.

Проводят биосинтез и выделение циклоспорина, как в примерах 1 и 2. Хроматографическое разделение 300 г комплекса циклоспоринов А, В, D (с содержанием циклоспорина А около 80%) проводят на колонке размером (диаметр к высоте) 1:20 с окисью алюминия (14 кг), используя систему растворителей петролейный эфир - этилацетат (7:3). Чистые фракции (после анализа методом ВЭЖХ) объединяют, концентрируют, сушат. Получают 190 грамм циклоспорина А с содержанием примесей менее 2,5%. Субстанцию очищают кристаллизацией в гексане с ацетоном (4:1). Получают 150 грамм субстанции с содержанием циклоспорина А 98,6%. Выход циклоспорина А составляет 50% от исходной субстанции.

ПРИМЕР 4.

Проводят биосинтез циклоспорина, как в примерах 1 и 2. Мицелий из 140 литров культуральной жидкости, содержащей 2 г/л циклоспорина А, отделяют на рамном фильтр-прессе или фильтре барабанного типа с намывным слоем вспомогательного фильтрующего средства - фильтроперлита (1%). Полученный влажный мицелий в количестве около 30 кг с содержанием влаги 75% высушивают в сушилке СП-30 с псевдоожиженным слоем при 50°С. Получают 6 кг сухого мицелия. Содержание циклоспорина А в пересчете на грамм сухого мицелия определяют с помощью ВЭЖХ. Потери циклоспорина А при сушке составляют 20%, экстракцию циклоспорина А из сухого мицелия проводят в системе петролейный эфир - ацетон (10:1) в реакторе с перемешиванием сначала с тремя объемами экстрагента (по отношению к весу мицелия) в течение трех часов. После отделения первого экстракта мицелий повторно экстрагируют двумя объемами той же системы.

Хроматографическую колонку (диаметр к высоте равен 1:20) загружают взвесью 14 кг водной кремневой кислоты в петролейном эфире. После пропускания через колонку экстрактов (первого и второго) хроматографическое разделение комплекса циклоспорина проводят системой петролейный эфир - ацетон (4:1), как описано в примере 1.

Анализируют фракции на содержание циклоспорина А методом ВЭЖХ. Чистые фракции объединяют, концентрируют, а смешанные фракции подвергают повторной хроматографической очистке в тех же условия. Концентраты, содержащие циклоспорин А, от двух хроматографических колон объединяют и кристаллизуют в системе гексан - ацетон (4:1). 

ПРИМЕР 5.

Проводят биосинтез, выделение и очистку циклоспорина, как в примерах 1 и 2. Кристаллизация ЦА.

Концентрация циклоспорина А в количестве 130 г (содержание циклоспорина А 98%) растворяют в 0,3 л ацетона. Раствор фильтруют и медленно при перемешивании вливают в реактор, содержащий 1,2 л гексана. Реактор охлаждают до 5°С. Кристаллический осадок циклоспорина А отделяют фильтрованием, промывают 0,2 л охлажденного гексана и сушат в вакуум-сушильном шкафу при 50-60°С до содержания влаги в субстанции не более 1%. Получают субстанцию в количестве 110 г с содержанием циклоспорина А 99,1%. Выход 84% от исходного препарата.

Таким образом, настоящее изобретение является усовершенствованным способом получения препарата циклоспорина, позволяющим получить высокоактивный препарат циклоспорина А в кристаллической форме.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Высокоактивный кристаллический препарат циклоспорина А (ВКПЦ), представляющий собой циклический ундекапептид, полученный из гриба рода Tolypocladium inflatum subsporum blastosporum, зарегистрированного в коллекции Государственного научного Центра по антибиотикам за №330А, при культивировании его на стандартной агаризованной среде с последующей ферментацией, выделением, очисткой и кристаллизацией, отличающийся тем, что культуральная среда дополнительно содержит рубомицин в концентрации 2 мкг/мл и сернокислый цинк в концентрации 5 мг/мл, а ферментационная среда содержит в качестве основных компонентов мальтекс и D,L-валин, при этом конечная концентрация в среде препарата составляет 2,0-2,5 мг/мл, а продукт выделен из высушенных мицелиев гриба экстракцией петролейным эфиром до и после очистки хроматографией на силикагеле и кристаллизован в системе гексан - ацетон (4:1).

2. Способ получения высокоактивного кристаллического препарата ВКПЦ, охарактеризованного в п.1, включающий культивирование гриба на агаризованной среде, ферментацию, выделение и очистку, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит 2 мкг/мл рубомицина и 5 мк/мл сернокислого цинка, а ферментационная среда содержит мальтекс и D,L-валин в качестве основных компонентов, далее отделяют мицелий гриба, содержащий комплекс циклоспоринов А, В, С, D, от нативного раствора, сушат мицелий и экстрагируют целевой продукт петролейным эфиром до и после очистки хроматографией на силикагеле или окиси алюминия, фракции, содержащие циклоспорин А, объединяют и кристаллизуют в системе гексан - ацетон (4:1) с содержанием целевого продукта не менее 97,5%.