ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ГИПЕРИММУННАЯ СЫВОРОТКА ПРОТИВ РОТА-, КОРОНА-, ГЕРПЕСВИРУСОВ И E.coli (K 99, A 20) ДЛЯ ЛОКАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОТЕРАПИИ СМЕШАННЫХ ФОРМ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ

ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ГИПЕРИММУННАЯ СЫВОРОТКА ПРОТИВ РОТА-, КОРОНА-, ГЕРПЕСВИРУСОВ И E.coli (K 99, A 20) ДЛЯ ЛОКАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОТЕРАПИИ СМЕШАННЫХ ФОРМ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ


RU (11) 2145504 (13) C1

(51) 7 A61K39/42, C07K16/12, A61K39/40, A61K39/395, C07K16/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - может прекратить свое действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.02.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 99110172/13 
(22) Дата подачи заявки: 1999.05.19 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1999.05.19 
(45) Опубликовано: 2000.02.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 2043772 C, 20.09.95. RU 2054289 C, 20.02.96. RU 2086236 C, 10.08.97. Гаффаров Х.З. и др. Полиспецифическая сыворотка как средство экстренной профилактики и лечения рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тез. докл. V Всероссийской конференции, 14 - 17 мая 1996. - Щелково: 1996, с.94. 
(71) Имя заявителя: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт 
(72) Имя изобретателя: Гаффаров Х.З.; Спиридонов Г.Н.; Ефимова М.А.; Гусев В.В. 
(73) Имя патентообладателя: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт 
(98) Адрес для переписки: 420075, Казань, Научный городок 2, ВНИВИ 

(54) ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ГИПЕРИММУННАЯ СЫВОРОТКА ПРОТИВ РОТА-, КОРОНА-, ГЕРПЕСВИРУСОВ И E.coli (K 99, A 20) ДЛЯ ЛОКАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ И ИММУНОТЕРАПИИ СМЕШАННЫХ ФОРМ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ 

Изобретение предназначено для специфической иммунотерапии и пассивной профилактики смешанных форм инфекционных энтеритов и энтероколитов новорожденных телят. Волов-продуцентов гипериммунизируют поливалентными вирусными и эшерихиозными антигенами. Для этого в качестве вирусных антигенов используются культуральные суспензии рота-, корона-, герпесвирусов. Вирусы выращивают раздельно на перевиваемых культурах клеток, соответственно на культуре клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ), почки эмбриона коров (линия МДВК) и культуре клеток трахеи эмбриона коров (линия ТР). В качестве эшерихиозного антигена используют соматические адгезивные антигены (К99, А20) и ТЛ-, ТС-анатоксины E. coli. Гипериммунизацию волов-продуцентов осуществляют путем внутривенного вливания смеси вирусных антигенов и подкожной инъекции эшерихиозного антигена в нарастающих дозах с интервалом 14 - 16 дней. Полиспецифическую гипериммунную сыворотку применяют с целью локальной защиты кишечника и иммунотерапии смешанной рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят. Изобретение обеспечивает пассивный иммунитет в предельно короткие сроки и экстренное лечение при развившейся болезни. 6 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, микробиологии и биотехнологии, в частности к производству биопрепарата, предназначенного для специфической иммунотерапии и пассивной профилактики смешанных форм инфекционных энтеритов и энтероколитов новорожденных телят.

В структуре заболеваемости новорожденных желудочно-кишечные болезни бактериальной и вирусной этиологии, клинически проявляющиеся диареей, занимают особое место и являются одной из основных причин гибели молодняка. Так, по некоторым опубликованным данным ежегодно в молочно-товарных фермах Российской Федерации заболевает 70-90% новорожденных телят и при этом около трети их гибнет в первые дни жизни вследствие острых гастроэнтеритов с явлениями диареи (Гаффаров Х.З., 1983, - Ветеринария, N 4, стр. 73-76; Волков К.Г., Баранников В.Д., 1997, - Ветеринария, N 2, стр. 7-10; Сидоров М.А., Субботин В. В., 1998, - Ветеринария, N 1, стр. 3-7; и др.).

Эта группа болезней наносит хозяйствам огромный экономический ущерб, складывающийся из высокой смертности заболевших, больших затрат на лечение больных, снижения привесов и проведения общих и специфических мероприятий.

Без эффективной защиты новорожденных от возбудителей инфекционных болезней, циркуляция которых в природе обусловлена эволюцией сложившихся взаимоотношений между популяциями микроорганизмов и их хозяев, не представляется возможным получение здорового молодняка и биологически полноценной животноводческой продукции.

Имеющиеся в специальной литературе данные последних лет и накопленные нами знания и опыт свидетельствуют о том, что массовые энтериты и энтероколиты новорожденных телят с клиническими признаками диареи обусловливаются различными этиологическими факторами: если в основе возникновения неинфекционных болезней лежат функциональные расстройства желудочно-кишечного тракта новорожденных, тесно связанных с нарушениями обмена веществ у коров-матерей вследствие неполноценного кормления и нарушения правил содержания, то при инфекционной диарее огромная роль принадлежит рота-, корона-, герпесвирусам и энтеротоксигенным серотипам E.coli, синтезирующим адгезивные антигены K99, A20, K88, и в меньшей степени - парвовирусу к вирусу диареи крупного рогатого скота, хламидиям, некоторым бактериям и криптоспоридиям (Mebus C.A. с сотрудн., 1971, - Canad. Vet. J., V. 12, стр. 69-72; Wood C.N. с сотрудн., 1974, - Res. Vet. Sci. , V. 16, стр. 102-105; Wyn-Jones A.P. с сотрудн., 1978, - Zbl. , Veterinarmed., Bd. 25, стр. 168-170; Koves B., 1979, - Acta microbiol. Acad. Sci. Hung., V. 26, стр. 225-232; Самойлов П.П., Пантелеев Ю.В., Сюрин В.Н., 1982, Вопросы вирусологии, N 1, стр. 61-64; Гоголев М.М. с соавт. , 1983, - Бюллетень ВИЭВ, стр. 49-52; Асташенко Н.Ж., Юденко Е.В., 1988, - Инфекционная патология с.-х. животных и пчел на Дальнем Востоке, стр. 3-7; Сидоров М. А., - Ветеринария, N 2, 1981, с. 41-43; Зароза В.Г., 1991, - Эшерихиоз телят. Москва В.О. "Агропромиздат", стр. 3-235).

Инфекционный процесс усугубляется тем, что эти возбудители действуют на беззащитный организм новорожденного в комбинации друг с другом (вирус + вирус, вирус + бактерии), вызывая смешанную инфекцию, приводящей к более тяжелому заболеванию и чаще с летальным исходом (Zygraich N. с соавт., 1975, - Ann. Med. Veter., 119, 2, стр. 105-113; Mebus C., 1976, - J.Dairy Sci., 59, 6, 1175-1178; Moon H. с соавт., 1978, - J. Am. Vet. Med. Assn., 173, 5p, 577-583; Optenbosch E. с соавт., 1979, - Session Cenerale du Cometede J.O.J. E, Paris., 21-26 Mai, Rapport, N 100, 25; Коромыслов Г.Ф. с соавт., 1980, - "Сельское хозяйство за рубежом", N 6, 51-54; Wetzke T.J. с соавт., 1982, - Tierzucht. , 36, 10, 446-449; Scherrer R., Laporte J., 1983, - Rec. Med. Veter., 159, 3, 173-183).

Диарея новорожденных телят смешанной этиологии характеризуется стационарностью, затяжной и тяжелой формой течения. Новорожденные телята заражаются в инфицированных родильных отделениях в первые минуты жизни с первым вздохом контаминированного воздуха или с первым глотком инфицированного молозива и затем в течение 2-5 дней наступает гибель их на фоне прогрессивно развивающихся необратимых патологических изменений.

Возникновение и развитие инфекционного процесса обусловлены высокой концентрацией поголовья скота, латентным персистированием возбудителей в организме коров и нетелей, но вызывающих острое заболевание у новорожденных телят.

Наиболее распространенным и эффективным способом защиты новорожденных телят от возбудителей, участвующих в патогенезе смешанной инфекции по типу вирус+вирус или вирус+бактерии Э. коли, является повышение специфической резистентности их организма путем скармливания молозива от вакцинированных коров-матерей.

Осуществленные в последние годы разработки позволили создать моно-, бивалентные и ассоциированные вакцины, обеспечивающие эффект невосприимчивости у телят к энтеритам во многих странах мира, в том числе и в Российской Федерации (Snodgrass D.R., 1983, - Ann. Rech. Veter., 14, 4, 519-521; Freitag. с соавт., 1984, - Tierarztl. Umsch., 39, 10, стр. 731-736; Калоянов Ж. с соавт. , 1988, - Bemep. Сб., 86, 5, стр. 40; Гоголев М.М. с соавт., 1987, - Труды ВИЭВ, 64, стр. 13-15; Преображенский Д. с соавт., 1988, бюллетень ВИЭВ, 86, стр. 21-26; Рамишвили Л.Г. с соавт., 1993, - Вопросы вирусологии, N 5, стр. 233-234; Гаффаров Х.З. с соавт., 1998, - Материалы международной научной конференции, посвященной 125-летию академии, Казань, часть 1, стр. 31).

Антитела, полученные с молозивом коров, обеспечивают защиту телят от заболеваний до тех пор, пока у них не разовьются собственные механизмы иммунитета. По различным причинам некоторые телята после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери, несвоевременным и недостаточным получением молозива в первые часы после рождения или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных (Федоров Ю.Н., 1988, - Ветеринария, N 1, стр. 26-29).

Широкая вариабельность и изменчивость эшерихий, а также возникновение у них устойчивости к применяемым антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам, часто сводит до минимума их эффективность.

Следовательно, только антитела, введенные телятам перорально, предохраняют их от заболевания, обеспечивают полную защиту от развития клинически выраженного заболевания и прекращения экскреции вирусов и бактерий.

С учетом этого положения, с целью специфической пассивной профилактики и лечения в различных странах практикуется пероральное и парентеральное введение гипериммунных сывороток или иммуноглобулинов, полученных от гипериммунизированных животных-продуцентов, гамма-глобулина, выделенного из молозива первого сдаивания или из аллогенной сыворотки крупного рогатого скота (Bejric A. с соавт. , 1976, - Veterinaria, Sarajevo, V. 25, N 1/2, стр. 201-206; Snodgrass D. R., Wells P., 1978, - J. Amer. Vet. Met. Assn., 173, 5P11, 565-569, - Vet. Rec. , 1978, 102, 7, 146-148; Chantal J. с соавт., 1984, - Rev. Med. Veter., 135, 12, 754-774; Anon - Ветер. Сб., 1984, 82, 3, 34; De Cregorio R.M., 1991, - Proc. Cornellnutiton Conf. for feed manufact animals, Jthaca, N 4, 102-108).

В России применяется поливалентная антитоксическая сыворотка против паратифа и колибациллеза телят, ягнят, овец и птиц, изготавливаемая путем гипериммунизации волов-продуцентов поливалентным антигеном, включающим 30 штаммов 24 серогрупп и сероваров энтеропатогенных эшерихий; бивалентная антитоксическая сыворотка против паратифа и колибациллеза телят ("Вет. препараты", М.: Колос, с. 226).

Основными недостатками их является недостаточная лечебная и профилактическая эффективность при эшерихиозе, протекающем в формах колидиареи и колиэнтеротоксемии, вследствие низкого титра антител к адгезивным антигенам К88 и К99, термолабильному и термостабильному энтеротоксинам и отсутствия антител к адгезивным антигенам 987Р и Г41.

Предложен "Способ получения сыворотки, адгезивной и антитоксической против эшерихиоза с.-х. животных", обеспечивающей нейтрализацию патогенного действия эшерихий у животных различных видов (Малахов Ю.А., Тугаринов О.А., Пирожков М.К., Солодков В.С., 1993, патент RU 2043772 C1), который выбран в качестве прототипа.

Однако известные биопрепараты, в том числе и прототип, не позволяют получать лечебно-профилактический эффект при смешанных формах инфекционных диарей новорожденных телят (как правило, в 75-85% случаях имеют место сочетанные инфекции), т.к. не обладают специфической активностью в отношении рота-, корона-, герпесвирусов - основных возбудителей этой патологии.

Целью изобретения является разработка технологии производства полиспецифической сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят, обеспечивающей пассивный иммунитет в предельно короткие сроки и экстренное лечение при развившейся болезни.

Поставленная цель достигается гипериммунизацией волов-продуцентов смесью культуральных вирусных суспензий и инактивированными антигенами E.coli, содержащими соматические, адгезивные (К99, А20) антигены в физиологическом растворе, анатоксины в среде культивирования (бульон Хоттингера) при следующем соотношении их компонентов в двух различных иммуногенах (об.%):

1. Культуральные вирусные суспензии для внутривенной иммунизации:

Ротавирус крупного рогатого скота с титром 107,0 - 107,8 ТЦД50/мл - 30 - 35

Коронавирус крупного рогатого скота с титром 105,0 - 105,8 ТЦД50/мл - 30 - 35

Герпесвирус крупного рогатого скота с титром 107,6 - 108,0 ТЦД50/мл - 30 - 35

2. Эшерихиозные антигены для подкожной иммунизации:

Соматический и адгезивный антигены К99 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3 - 23 - 27

Соматический и адгезивный антигены А20 с концентрацией 10-15 млрд. м.к. в 1 см3 - 23 - 27

Анатоксин К99 + А20 E.coli - 45 - 52

Формалин - 0,4 - 0,5

Предлагаемые наборы антигенов позволяют получить высокоэффективную лечебно-профилактическую сыворотку против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий, пригодную для применения в различных регионах России. Применяемые для гипериммунизации штаммы вирусов изысканы и являются производственными при изготовлении поливалентной сыворотки. В качестве иммунизирующего антигена применяют любые из производственных или местных штаммов E.coli, активно продуцирующие термостабильные и термолабильные токсины, а также адгезивные антигены А20 и К99.

Пример 1. Способ изготовления вирусных антигенов для гипериммунизации волов-продуцентов заключается в следующем.

Ротавирус крупного рогатого скота (штамм "Ш-1") размножают в роллерных трехлитровых бутылях с выросшей однослойной перевиваемой культурой клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ) на комбинированной ростовой среде, состоящей из гидролизата лактоальбумина (ГЛА) - 45%, среды 199 - 45%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 100-120 тыс. клеток на 1 мл среды. Перед внесением в культуры вирус активируют трипсином (0,6 мл 0,25%-ного трипсина на 100 мл вирусной суспензии в течение 30-35 минут при 37-38oC) в соотношении 1: 10 - 1:12 и добавляют его в поддерживающую среду без сыворотки из расчета 5 мл на 500 мл среды, а также 3%-ный раствор глутамина (5 мл на 500 мл среды) и антибиотики.

Ростовую среду сливают, вносят в бутыли с культурой поддерживающую среду в количестве 350-370 мл и инкубируют при 37-38oC в течение 24-49 ч. После выраженного разрушения монослоя культуры клеток титр вируса должен составлять 107,0 - 107,8 ТЦД50/мл. Для освобождения вируса культуру трехкратно замораживают при минус 18-20oC и в дальнейшем быстро оттаивают при 36-37oC. Полученную культуральную суспензию осветляют центрифугированием в течение 40 минут при 3000 об/мин.

Коронавирус крупного рогатого скота (штамм "СМ-1") размножают в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона коров (линия МДВК), выращенные в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной среде, состоящей из среды 199 - 60%, ГЛА - 30% и эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - 10%. Монослой формируется на 3-4-е сутки при посевной концентрации 120-150 тыс. клеток на 1 мл среды.

Для расплодки коронавируса крупного рогатого скота ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду (среда 199 - 50% и ГЛА - 50%) в количестве 350-370 мл, в которую предварительно вносят вирус из расчета 15-20 мл на 500 мл среды, 0,25%-ный трипсин - 3 мл, 3%-ный раствор глутамина - 5 мл и антибиотики. Бутыли инкубируют в роллерной установке при 37-38oC в течение 3-4 дней. Через 72-96 ч выращивания при 37oC проявляется ЦПД 50%. Цитопатогенное действие характеризуется гранулированием цитоплазмы, распадом изолированных клеток, образованием симпластов с последующей дегенерацией. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта. Титр вируса должен составлять не ниже 105,0 - 105,8 ТЦД50/мл.

Освобождение вируса из клеток осуществляют путем замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют путем центрифугирования.

Герпесвирус крупного рогатого скота (штамм "ТКА-ВИЭВ-В2") размножают в перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (ТР), выращенных в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной срде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, среды Игла МЕМ - 40% и сыворотки крупного рогатого скота - 10%. Культуру выращивают в течение 3-4-х суток при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток на 1 мл среды. Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду (среда 199 - 20%, ГЛА - 40% и Игла МЕМ - 40%) в количестве 350-370 мл, в которую предварительно вносят вирус из расчета 10 мл на 500 мл среды, 3%-ный раствор глутамина - 5 мл и антибиотики. Бутыли инкубируют в роллерной установке при 37-38oC в течение 3-4-х дней.

Освобождение вируса из клеток осуществляется путем замораживания и оттаивания, полученную вирусную суспензию осветляют путем центрифугирования.

Полученные рота-, корона-, герпесвирусные суспензии, содержащие не менее 30-35 мг/мл специфического белка, объединяют в равных соотношениях и используют для гипериммунизации волов-продуцентов.

Пример 2. Способ получения эшерихиозных антигенов.

В качестве производственных штаммов при получении гипериммунной сыворотки используют производственные энтеротоксигенные штаммы эшерихий: "КВ-1" - синтезирующий адгезивный антиген К99; "ПЗ-3" - синтезирующий адгезивный антиген А20, которые вызывают гибель белых мышей массой 14-16 г в течение двух суток после внутрибрюшинного заражения в дозе 0,5 см3 суспензии суточной культуры, содержащей 1 млрд. м. к. в 1 см3 по бактерийному или оптическому стандарту мутности.

Соматические адгезивные антигены получают путем посева суточных бульонных культур штаммов E.coli на МПА (синтезирующие адгезивный антиген А20) и среду Минка (синтезирующие адгезивный антиген К99) и выращивания в термостате при 37oC в течение 24 ч. Выросшие культуры эшерихий смываются стерильным физраствором с содержанием 0,4-0,5% формалина в стерильную колбу с концентрацией 15 млрд. м.к. в 1 мл и выдерживаются в термостате при 37oC в течение 3 суток.

Для получения анатоксина энтеротоксигенные штаммы E.coli засеиваются в двухлитровые колбы со средой Хоттингера (pH 7,8), выращиваются 5-7 дней при 37oC. Затем к культуре добавляется формалин до 0,4-0,5% и выдерживается в термостате при 37oC 10-12 дней. Полученный анатоксин осаждают 10% стерильным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета до 1% на весь объем. После отстаивания анатоксина в течение 2-3 дней надосадочную жидкость отсасывают.

Затем полученные анатоксин и соматические адгезивные антигены смешивают в равных объемных соотношениях и используют для гипериммунизации животных.

Пример 3. Гипериммунизация волов-продуцентов.

Волов, предназначенных для гипериммунизации, карантинируют, подвергают исследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней согласно действующей инструкции о порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов. К эксплуатации допускают животных 2-5-летнего возраста, массой не менее 400 кг.

Для гипериммунизации используют полиантигены, состоящие из рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли, содержащих адгезивные антигены К99 и А20.

Гипериммунизация животных проводится по схеме, приведенной в таблице 1. Смесь антигенов рота-, корона-, герпесвирусов вводится внутривенно четырехкратно в нарастающих дозах. Для десенсибилизации организма иммунизируемых животных за 1-1,5 ч до внутривенного введения им подкожно инъецируется смесь вирусных антигенов в десятикратно меньшей дозе. Эшерихиозный антиген вводится подкожно в область шеи в первый раз с неполным адъювантом Фрейнда, в последующем - без адъюванта. Пробное взятие крови проводят из яремной вены в стерильные пробирки на 20-й день после последнего введения антигенов. Полученную сыворотку от каждого продуцента с помощью серологических реакций исследуют на наличие антител. Продуцентам, в сыворотке которых титры антител ниже указанных в примере 4, вводят антиген повторно в дозах согласно последнему введению, а взятие крови не производят.

Пример 4. Взятие и обработка крови.

Производственное крововзятие разрешается при наличии антител в сыворотке крови продуцентов к ронавирусу не ниже 1:3200 в ИФА; коронавирусу - не ниже 1: 512 в РТГА; герпесвирусу - не ниже 1:256 в РН; эшерихиям - не ниже 1:1600 в РА и при условии температуры, не превышающей 39,5oC, а также после предварительной выдержки на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном водопое.

Первое крововзятие от продуцентов по объему не должно превышать 0,6 л крови на 100 кг живой массы животного, а в последующем - 1,6 л. На 20-й день после взятия крови продуцентам вводят полиантиген в дозах согласно последнему введению. Ежегодно делают перерыв в продолжении месяца в эксплуатации животных. Волов-продуцентов эксплуатируют в течение 3-5 лет, после чего их реализуют в установленном порядке.

У волов-продуцентов кровь берут из яремной вены. Для предохранения крови от свертывания применяют антикоагулянт - 10%-ный раствор лимонно-кислого натрия, который готовят на 5%-ном растворе хлористого натрия и стерилизуют автоклавированием.

В стерильные бутыли для взятия крови наливают раствор лимонно-кислого натрия из расчета 34 мл на 1 л крови. Внутреннюю поверхность бутылей увлажняют этим раствором, чтобы на ней не оставалось следов конденсационной влаги. В процессе взятия крови и после него раствор антикоагулянта и кровь смешивают, покачивая бутыли плавными круговыми движениями.

Для отделения форменных элементов крови полученную цитрированную кровь подвергают сепарированию (сепаратор марки АС-2Ж). Полученную плазму дефибринируют с целью перевода жидкого белка, фибриногена, в нерастворимое состояние - фибрин. Дефибринирование плазмы крови производят в стерильном дефибринаторе с мешалкой (реакторе). Для дефибринирования в плазму добавляют 30%-ный раствор хлористого кальция из расчета 1,3 мл на 1 л и свежеприготовленную сыворотку, содержащую фермент тромбин, из расчета 10 мл на 1 л. Процесс дефибринирования плазмы обычно длится 25-30 мин. Полученную сыворотку проверяют на полноту перевода фибриногена в фибрин, для чего в пробирку наливают 7-8 мл испытуемой сыворотки и 5-6 мл насыщенного раствора хлористого кальция, смесь тщательно встряхивают и оставляют в покое на 10-15 мин. Прозрачность смеси указывает на полноту перехода фибриногена в фибрин. В полученной сыворотке проверяют содержание кальция, присутствие которого не должно превышать 35 мг %. Далее сыворотку крови консервируют 5%-ным раствором химически чистого фенола до конечной концентрации 0,5% и при помощи вакуумного насоса перекачивают в стерильный отстойник, где ее выдерживают 2 месяца при 4-10oC. По истечении срока отстоя сыворотку подвергают последовательно фильтрации и стерилизации через асбестоцеллюлозные пластины. После завершения фильтрации сыворотку контролируют на активность, стерильность и безвредность, как указано в примере 5. Проверенную сыворотку расфасовывают во флаконы, закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют.

Пример 5. Контроль сыворотки на внешний вид, стерильность, безвредность и активность.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, плесени, неразбивающихся хлопьев, герметичности укупорки все флаконы с сывороткой встряхивают, просматривают в проходящем свете и переворачивают вниз пробками.

Стерильность сыворотки проверяют путем высева на МПА, МПБ, Сабуро, регенерированную среду Китт-Тароцци. Посевы выдерживают при 37-38oC. Через 48 ч из жидких сред делают пересевы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Первичные посевы выдерживают 10, а вторичные - 8 суток. Роста на питательных средах не должно быть.

Безвредность сыворотки проверяют на 10 белых мышах, которым препарат вводят подкожно в дозе 0,5 см3. Сыворотку считают безвредной, если все животные остаются клинически здоровыми в течение 10 суток.

Активность сыворотки проверяют на 40 белых мышах массой 15-18 г, из которых 20 животным вводят подкожно 0,5 см3 препарата, а другие 20 мышей служат контролем. Через 24 ч после введения сыворотки всех животных заражают внутрибрюшинно подтитрованной смертельной дозой культур вирусов и эшерихий, продуцирующих адгезивные антигены А20 и К99. Сыворотку считают активной при выживании не менее 15 подопытных и гибели 18-20 контрольных мышей в течение 2 суток.

Оценку эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки проводят в остром опыте на новорожденных телятах.

Профилактические свойства сыворотки испытывают на 5 телятах, разделенных на 2 группы. Животным опытной группы (3 гол.) с профилактической целью сразу после рождения вводят двукратно с интервалом 12 часов полиспецифическую сыворотку перорально в дозе 2,5 см3 на 1 кг живой массы. Телятам контрольной группы (2 гол.) в те же сроки и в тех же дозах выпаивают нормальную сыворотку крупного рогатого скота, серонегативную по отношению к возбудителям диареи. Спустя 30-36 ч после рождения телят обеих групп заражают перорально смесью культуральной рота-, корона-, герпесвирусной суспензий, а также энтеропатогенными штаммами эшерихий (К99 и А20).

Лечебные свойства сыворотки изучают на 5 телятах, разделенных также на 2 группы. С этой целью телят обеих групп в первые 1,5-2 ч после рождения перорально заражают культуральными взвесями рота-, корона-, герпесвирусов и энтеропатогенных штаммов эшерихий (А20, К99). С появлением первых клинических признаков диареи телятам опытной группы (3 гол.) вводят внутривенно полиспецифическую сыворотку в дозе 2 см3 на 1 кг живой массы. Телятам контрольной группы (2 гол.) при появлении признаков болезни вводят внутривенно нормальную сыворотку крупного рогатого скота в той же дозе, что и полиспецифическая.

Результаты испытания лечебно-профилактических свойств сыворотки в остром опыте на новорожденных телятах представлены в таблице 2.

Пример 6. Производственное испытание экспериментальных серий полиспецифической гипериммунной сыворотки.

За 1994-1998 гг. в лаборатории эпизоотологии ВНИВИ изготовлено 9 серий сыворотки общим объемом 750 л. Результаты испытания показали, что все серии сыворотки были стерильны, безвредны, ареактогенны и обладали выраженными превентивными свойствами. Показатели специфической активности отдельных экспериментальных серий сыворотки представлены в таблице 3.

Оценка лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки проводилась в неблагополучных по рота-, корона-, герпесвирусным и эшерихиозным диареям хозяйствах Республики Татарстан. С профилактической целью сыворотку вводили перорально в дозе 60-80 см3 на прием до первой порции молозива и повторное введение осуществляли не позднее 24-30 ч после первого в той же дозе.

С лечебной целью сыворотку применяли внутривенно при выраженной интоксикации в дозе 60-80 см3, при слабой - в дозе 40-60 см3. При необходимости сыворотку вводили повторно через 24 часа подкожно в дозе 50 см3.

Для повышения лечебных свойств сыворотки препарат вводят внутривенно в смеси с 40%-ным раствором глюкозы в равных объемах с добавлением 2-3 мл раствора кофеин-натрия бензоата.

Результаты оценки лечебно-профилактической эффективности сыворотки представлены в таблицах 4 и 5, из которых следует, что предлагаемая полиспецифическая гипериммунная сыворотка обладает выраженным лечебно-профилактическим действием.

Пример 7. Назначение, общие сведения и порядок применения полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли (К99 и А20).

Полиспецифическая гипериммунная сыворотка предназначена для специфической иммунотерапии и пассивной профилактики смешанных форм инфекционной диареи новорожденных телят, обусловленных рота-, корона-, герпесвирусами и энтеротоксигенными штаммами эшерихий, продуцирующими факторы адгезии А20 и К99.

Сыворотка изготавливается путем гипериммунизации полиантигенами клинически здоровых волов-продуцентов, свободных от лейкоза.

Сыворотка представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую жидкость желтовато-красноватого цвета. На дне флаконов, особенно при длительном хранении, выпадает незначительный белковый осадок, который при встряхивании легко разбивается в равномерную взвесь.

Сыворотка пригодна для применения в течение 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения в темном, сухом месте и при температуре не выше 8oC. Флаконы с сывороткой должны быть плотно закрыты резиновыми пробками и обкатаны металлическими колпачками. При встряхивании и переворачивании флакона сыворотка не должна просачиваться через пробку. Перед применением флаконы с сывороткой необходимо тщательно встряхивать и подогревать на водяной бане до 37-38oC. При наличии в сыворотке посторонних примесей, неразбивающихся хлопьев, плесени, при нарушении целостности флакона, отсутствии этикетки, а также при неиспользовании в день открытия флакона сыворотка подлежит выбраковыванию.

Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и эшерихий коли (К99 и А20) новорожденных телят применяется с профилактической и лечебной целью против смешанной рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи в хозяйствах, где эти заболевания подтверждены вирусологическими и бактериологическими или серологическими исследованиями.

С профилактической целью сыворотку вводят перорально в дозе 60-80 мл на прием до первой порции молозива (первые 1-1,5 ч жизни теленка) и повторное введение осуществляют не позднее 24-30 ч после первого в той же дозе.

С лечебной целью сыворотку применяют:

а) при выраженной интоксикации - внутривенно в дозе 60-80 мл в смеси с 40%-ным раствором глюкозы в равных объемах с добавлением 2-3 мл раствора кофеин-натрия бензоата и подкожно в дозе 50 мл;

б) при слабой интоксикации - внутривенно в дозе 40-60 мл.

Пассивный иммунитет у животных сохраняется в течение 10-15 дней.

За период 1994-1998 гг. изготовлено 750 литров сыворотки и использовано в 22 хозяйствах Республики Татарстан, неблагополучных по инфекционным диареям новорожденных телят, с положительными результатами (таблица 6). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и E.coli (К 99, А 20) для локальной защиты и иммунотерапии смешанных форм диареи новорожденных телят, отличающаяся тем, что содержит антитела в титрах: к ротавирусу - не менее 1 : 3200 (в ИФА), к коронавирусу - не менее 1 : 512 (в РПГА), к герпесвирусу - 1 : 256 (в РН), к эшерихиям, имеющим адгезины К 99 и А 20 - не менее 1 : 1600 (в РА), к термостабильному энтеротоксину E.coli - не менее 1 : 2 (в РДП), к термолабильному энтеротоксину E.coli - не менее 1 : 4 (в РДП), полученная гипериммунизацией волов-продуцентов поливалентным вирусным антигеном, содержащим смесь культуральных вирусных суспензий ротавируса крупного рогатого скота с титром 107,0 - 107,8 ТЦД50/мл, коронавируса крупного рогатого скота с титром 105,0 - 105,8 ТЦД50/мл, герпесвируса крупного рогатого скота с титром 107,6 - 108 ТЦД50/мл, внутривенно и поливалентным антигеном эшерихий, содержащим инактивированные суспензии клеток E. coli с адгезинами К 99 и А 20 с концентрацией каждого штамма 10 - 15 млрд. кл. в 1 мл физиологического раствора, и анатоксины в среде культивирования с титром в РДП 1 : 4 - 1 : 8 подкожно с последующим взятием крови и консервированием сыворотки.