СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ХЛОРИНОВ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ХЛОРИНОВ


RU (11) 2144538 (13) C1

(51) 7 C07D487/22, A61K31/40, A61P35/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие, но может быть восстановлен 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2000.01.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 98100545/04 
(22) Дата подачи заявки: 1998.01.22 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1998.01.22 
(45) Опубликовано: 2000.01.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 2054476 C1, 20.02.96. RU 2064948 C1, 10.08.96. US 4977177, 11.12.90. US 5002962, 26.03.91. US 5330741, 19.07.94. US 5378835, 03.01.95. US 4935498, 19.01.90. 
(71) Имя заявителя: Закрытое акционерное общество "Вета" 
(72) Имя изобретателя: Пономарев Г.В.; Решетников А.В.; Гусева-Донская Т.Н.; Швец В.И.; Баум Р.Ф.; Ашмаров В.В. 
(73) Имя патентообладателя: Закрытое акционерное общество "Вета" 
(98) Адрес для переписки: 111395, Москва, Аллея 1-й Маевки, д.15 Закрытое акционерное общество "Вета" 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ХЛОРИНОВ 

Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно к способу получения новых водорастворимых хлоринов, которые могут найти применение в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака. С целью получения устойчивых водорастворимых хлоринов предложен способ, заключающийся во взаимодействии исходного хлорина с раствором основания. Согласно изобретению в качестве исходного хлорина используют соединения общей формулы (1)



или (2)



где R1 = -CH(OAIk)CH3, -CH=CH2, -CHO, -C(О)CH3;

R2 = H или низший алкил;

R3 = -СН3, -СНО,

а в качестве основания - линейный или циклический первичный или вторичный амин, аминокислоту или соль аминокислоты. При этом исходный хлорин предварительно переосаждают путем постепенного прибавления воды к ее ацетоновому раствору, а стехиометрическое количество основания прибавляют непосредственно к влажному осадку хлорина с последующим юстированием 1,5-2%-ного водного раствора целевого продукта концентрированным раствором соответствующего основания или концентрированной НСl до рН 7,5-8,5. Этот способ позволяет получить новые стабильные производные хлоринов, пригодные для приготовления инъекционных растворов. 1 з.п. ф-лы, 4 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно к способу получения новых водорастворимых хлоринов общей формулы (1) и (2).



где R1 = -CH(OAlk)CH3, -CH=CH2, -CHO, -C(O)CH3;

R2 =H или низший алкил;

R3=-CH3, -CHO;

L = объемный лиганд (линейный или циклический первичный или вторичный амин, аминокислота или соль аминокислоты), а n 1.

Указанные соединения могут найти применение в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) рака и флюоресцентных меток.

Известны ФС хлоринового ряда, обладающие высокой тропностью в отношении злокачественных опухолей, например хлорин в виде натриевой соли [Kostenich G. A. , Zhuravkin I.N., Zhavrid E.A., Experimental Grounds for Using Chlorin E(6) in the Photodynamic Therapy of Malignant Tumors, J. Photochem. Photobiol. 1994, v.22, N 3, 211 - 217; Зорина Т.Е. Фотодинамическая активность производных хлорина молекулярные и клеточные аспекты. Дисс. на соиск. уч.ст. канд. биол. наук. Минск, 1992], тетранатриевая соль моно-L-аспартил хлорина [Bommer J.C., Burnham B.F.Tetrapyrrol Polyaminomonocarboxylic Acid Therapeutic Agents. U.S. Cl. 514/410. Pat. No. 4,977,177, 11/1990] , тринатриевая соль лизил-хлорина [Leach M.W., Higgins R.J., Boggan J.E., Lee S. -J., Autry S., Smith K.M. Effectiveness of a Lysylchlorin / Chlorin mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Research 1992, V.52, 1235 -1239]. Имеются сообщения об использовании в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов производных феофорбидов [Nakazato M. Method of Producing Water-soluble Sodium Pheophorbide U.S. Cl.540/145. Pat. N 5378835, 01/1995] и бактериохлоринов [Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll-a derivatives useful in photodynamic therapy. U.S. Cl. 514/410. Pat. N 5173504, 12/1992].

Известен способ получения тринатриевой соли лизил-хлорина заключающийся во взаимодействии метилового эфира пурпурина-18, полученного по реакции алломеризации метилфеофорбида с водным раствором лизина в хлористом метилене в присутствии пиридина. Смесь перемешивают 12 часов при комнатной температуре и удаляют растворители в высоком вакууме. Полученный сырой продукт очищают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и растворители удаляют лиофильной сушкой. С целью получения инъекционного раствора для ФДТ препарат растворяют в фосфатном буфере, прибавляют 0.1N раствор NaOH, доводят раствор до физиологического значения pH 7.35 с помощью 0.1N NCl и фильтруют через микропористый фильтр [Smith K. M., Lee S.-J. Long-wavelength Water Soluble Chlorin Photosensitizers Useful for Photodynamic Therapy and Diagnosis of Tumors. U. S.Cl. 424/9. Pat. N 5330741, 07/1994].

К недостаткам данного способа следует отнести плохую воспроизводимость, трудоемкость и применение высокотоксичных реагентов, что делает его малопригодным для фармацевтического производства. Кроме того, полученный водорастворимый целевой продукт устойчив в водном растворе только 24 часа при 4oC в темноте, а в твердом виде - до 4-х месяцев при 4oC в темноте [Leach M.W., Higgins R.J., Boggan J.E., Lee S. -J., Autry S., Smith K.M. Effectiveness of a Lysylchlorin / Chlorin mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Research 1992, V.52, 1235 - 1239; Smith K.M., Lee S.-J. Long-wavelength Water Soluble Chlorin Photosensitizers Useful for Photodynamic Therapy and Diagnosis of Tumors. U.S.Cl. 424/9. Pat. N 5330741, 07/1994].

Известен способ получения водорастворимой натриевой соли феофорбида Согласно этому способу феофорбид растворяют в диэтиловом эфире и к раствору медленно, по каплям, при перемешивании прибавляют очень разбавленный раствор щелочи в н-пропаноле, изопропаноле или в смеси этих растворителей. Реакцию проводят до полного выпадения соли феофорбида в осадок, который отделяют центрифугированием и сушат в вакууме. Продукт растворяют в воде, получая раствор с концентрацией 0.5% и pH 9.2 - 9.5, который затем разбавляют фосфатным буфером с pH 7.4 - 7.8 [Nakazato M. Method of Producing Water-soluble Sodium Pheophorbide U.S. Cl.540/145. Pat. N 5378835,01/1995].

Недостатком указанного способа является то, что при физиологических значениях pH невозможно получить достаточно концентрированный (>1%) инъекционный раствор соли феофорбида Дополнительными проблемами являются неустойчивость этих солей при хранении и их неполная растворимость после хранения в твердом виде.

Известен также способ получения водорастворимых тринатриевых и трикалиевых солей хлорина включающий обработку биомассы цианобактерий водно-спиртовым раствором щелочи. Полученный экстракт различных хлориновых производных обрабатывают кислотой, продукт отфильтровывают и промывают гексаном, растворяют в этаноле и подвергают щелочному гидролизу в вакууме с последующей нейтрализацией. Выпавший осадок, содержащий хлорин подвергают обработке раствором NaOH или KOH [Альбицкая О.Н., Ашмаров В.В., Мещерякова А. Л. Способ получения 18-карбокси-20-(карбоксиметил)-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12, 17-тетраметил-21H, 23H-порфин-2-пропионовой кислоты или ее солей. МКИ C 07 D 487/22, заявка N 93-036361/13 (036894) от 07/1993].

Описанный способ является трудоемким, длительным, сопровождается малым выходом и низкой частотой целевого продукта. Получаемое производное характеризуется низкой устойчивостью при хранении как в растворенном состоянии, так и в виде порошка.

В качестве ближайшего аналога выбран способ получения тринатриевой соли хлорина путем взаимодействия раствора триметилового эфира хлорина в тетрагидрофуране с 1N раствором NaOH. Реакционную массу перемешивают 2 суток при комнатной температуре в атмосфере азота и добавляют воду. Органический растворитель экстрагируют хлористым метиленом, удаляя следы последнего барботированием через раствор соли хлорина азота [Pandey R.K., Dougherty T. J. Photosensitizing Agents. U. S. Cl. 514/410. Pat. No. 5, 002, 962, 03/1991(прототип)].

Однако длительность процесса получения целевого продукта и его неустойчивость при хранении как в виде порошка, так и в виде раствора являются препятствием для создания из него лекарственного формы.

Задачей изобретения является обеспечение возможности получения устойчивых водорастворимых хлоринов.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся во взаимодействии исходного хлорина с раствором основания. Согласно изобретению в качестве исходного хлорина используют соединения общей формулы (3) или (4):



где R1 = -CH(OAlk)CH3, -CH=CH2, -CHO, -C(O)CH3;

R2=H или низший алкил;

R3=-CH3, -CHO;

а в качестве основания - линейный или циклический первичный или вторичный амин, аминокислоту или соль аминокислоты.

При этом исходный хлорин предварительно переосаждают путем постепенного прибавления воды к его ацетоновому раствору, а стехиометрическое количество основания прибавляют непосредственно к влажному осадку хлорина с последующим юстированием 1.5 - 2%-ного водного раствора целевого продукта концентрированным раствором соответствующего основания или концентрированной HCl до pH 7.5 - 8.5.

В качестве оснований могут быть использованы, например, 4-аминобутанол, N-метилглюкозамин, глюкозамин, аргинин, лизин, гистидин, натриевые или калиевые соли аргинина, лизина или гистидина и другие объемные молекулы, взаимодействующие как с карбоксигруппами хлорина, так и с сопряженной системой тетрапиррольного макроцикла.

Используемый диапазон значений pH обусловлен тем, что его нижняя граница pH 7.5 является нижним пределом растворимости хлоринов в водных растворах с получением концентраций, природных для использования в фармацевтике, без добавления солюбилизаторов. Верхняя граница этого диапазона pH 8.5 является пределом биологической переносимости концентраций гидроксид-ионов, [OH-].

Интервал концентраций хлорина 1.5 - 2% обусловлен тем, что использование более разбавленных растворов сопряжено с необходимостью вводить в организм большие объемы раствора препарата, что нежелательно. Концентрация около 2.5% является верхним пределом растворимости.

Свободные от примесей исходные хлорины общей формулы (3) и (4) могут быть получены исходя из хлорофилла или бактериохлорофилла быстро и с высоким выходом [Lotjonen S. , Hynninen P.H., An improved method for the preparation of (10R)- and (10S)-pheophytins and Synthesis. 1983, 705 - 708; Hynninen P. H. , Lotjonen S., Preparation of phorbin derivatives from chlorophyll mixture utilizing the principle of selective hydrolysis. Synthesis. 1980, 539 - 541; Lotjonen S., Hynninen P.H., A convenient method for the preparation of chlorin and rhodin g7 trimethyl esters. Synthesis, 1980, 541 - 543].

Предлагаемый способ позволяет получить стабильные производные хлоринов не только в безводном состоянии (например, после лиофилизации), но и в виде растворов, готовых к инъекции, в то время как классические K+ и Na+ соли хлоринов не являются стабильными производными. Использование стабилизации при помощи объемного лиганда для хлоринов до настоящего времени не было известно. Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Хлорофилл из биомассы микроводоросли Spirulina Platensis превращают в хлорин согласно стандартным методикам [Lotjonen S., Hynninen P.H., An improved method for the preparation of (10R)- and (10S)-pheophytins and Synthesis. 1983, 705 - 708; Hynninen P.H., Lotjonen S., Preparation of phorbin derivatives from chlorophyll mixture utilizing the principle of selective hydrolysis. Synthesis. 1980, 539 - 541; Lotjonen S., Hynninen P.H. , A convenient method for the preparation of chlorin and rhodin g7 trimethyl esters. Synthesis, 1980, 541 - 543] с общим выходом более 50% на исходный хлорофилл а затем продукт переосаждают путем постепенного прибавления воды к его ацетоновому раствору. Выпавший осадок центрифугируют и 3 раза промывают водой. К осадку хлорина прибавляют 2 г-экв. N-метилглюкозамина и воды столько, чтобы получить 1.7%-ный раствор по хлорину. Растворяют без остатка, для чего при контроле по pH-метру доводят раствор N-метилглюкозамином до pH 8.5 и фильтруют через пористый стеклянный фильтр N 4. Выход водорастворимого комплекса хлорина - количественный. Электронный спектр продукта см. в Табл.1.

ПМР-спектры хлорина ("Brucker", 360 MHz; , м.д.):

(в CDCL3 + 5% CF3COOD, конц. раствор) 9.67 (с, -мезо, 9.23 (с, -мезо), 8.22 (с, -мезо), 7.58, 7.62 (2д, =CH2), 6.25, 6.13 (2д, CH= ), 4.80 (м, протонир. 8), 4.45 (м, 7), 4.04 (м, протонир. 7), 3.96 (м, 8), 3.90 (т, 8), 3.86 (с, -мезоCOOH), 3.83 (к, 4CH3), 3.26 (с, 5), 3.09 (с, 1), 3.03 (с, 3), 2.43, 2.20 (2м, 7COOH), 1.47 (т, 4-CH2C);

(в (CD3)2SO, конц. раствор) 9.75 (с, -мезо), 9.67 (с, -мезо, 9.07 (с, -мезо), 8.29, 8.24 (2д, =CH2), 6.43, 6.16 (2д, CH=), 5.405, 5.29 (2с, -мезо-CCOOH), 4.60 (м, 7), 4.45 (м, 8), 3.79 (к, 4CH3 ), 3.58 (с, 5), 3.51 (с, 1-

), 3.28 (с, 3), 2.44, 2.28 (2м, 7CH2COOH), 2.60, 2.14 (2м, 7-CH2COOH), 2.08 (д. 8), 1.68 (т, 4-CH2), -1.63, -1.91 (2с, ).

Пример 2. Аминокислоту суспендируют в смеси хлороформ/этанол 1 : 1 (50 мл смеси на 1 г аминокислоты) и прибавляют стехиометрическое количество этилата натрия (калия). При этом образующая соль целиком переходит в раствор. Этот раствор нагревают при 50 - 60oC с обратным холодильником 1 час, растворители удаляют в вакууме и добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить раствор известной концентрации. Этот раствор, содержащий 2 г-экв. основания, прибавляют к влажному осадку хлорина до полного растворения последнего, после чего доводят водный раствор целевого продукта при помощи конц. раствора данного основания или конц. HCl до pH 8.3 и разбавляют дистиллированной водой до необходимой концентрации по хлорину (2%). Характеристики продуктов см. в Табл.1.

Пример 3. Готовят концентрированный водный раствор аминокислоты или иного органического аминопроизводного с известным содержанием основания. Этот раствор, содержащий 2 г-экв. основания, прибавляют к влажному осадку хлорина до полного растворения последнего, после чего доводят водный раствор целевого продукта при помощи конц. HCl до pH 7.5 и разбавляют дистиллированной водой до необходимой концентрации по хлорину (1.5%). Характеристики продуктов см. в Табл.1.

Пример 4. Для сравнения были получены калиевые и натриевые соли хлорина . Раствор, содержащий 2 г-экв. щелочи (112 мг, 2 ммоль KOH или 80 мг, 2 ммоль NaOH) в воде (на 1 мг хлорина 0.2 мл воды), прибавляют к влажному осадку хлорина (625 мг, 1 ммоль) и перемешивают при 40oC 12 часов, добиваясь максимального растворения хлорина, после чего смесь доводят при помощи конц. HCl до pH 8.3 и фильтруют. Количество растворившегося хлорина определяют по весу остатка. Характеристики продуктов см. в Табл.1.

Пример 5. Растворяют 2-дезвинил-2-[(1-этокси)этил] хлорин (R1 = CH(OC2H5)CH3, R2 = -H и R3 = -CH3) в водном растворе, содержащем 2 г-экв. N-метил-D-глюкозамина, как в примере 3. Характеристики продукта см. в Табл. 4.

Пример 6. Растворяют моноэтиловый эфир хлорина (R1 = -CH=CH2, R2 = -C2H5 и R3 = -CH3) в водном растворе, содержащем 2 г-экв. N-метил-D-глюкозамина, как в примере 3, за исключением того, что разбавляют дистиллированной водой до концентрации 0.5% по хлорину. Характеристики продукта см. в Табл.4.

Пример 7. Растворяют родин g7 (R1 = -CH=CH2, R2 = -H и R3 = -CHO) в водном растворе, содержащем 2 г-экв. N-метил-D-глюкозамина, как в примере 3. Характеристики продукта см. в Табл.4.

Пример 8. Растворяют 2-дезвинил-2-формил-3,4-дигидроксихлорин (R1 = -CHO, R2 = -H и R3 = -CH3) в водном растворе, содержащем 2 г-экв. N-метил-D-глюкозамина, как в примере 3. Характеристики продукта см. в Табл.4.

Пример 9. Растворяют бактериохлорин (R1 = -C(O)CH3, R2 = -H и R3 = -CH3) в водном растворе, содержащем 2 г-экв. N-метил-D-глюкозамина, как в примере 3. Характеристики продукта см. в Табл.4.

Устойчивость полученных соединений изучалась на примере N-метилглюкозаминового комплекса хлорина 

Растворы определенной концентрации хранили в темноте в герметически укупоренных склянках при трех температурных режимах: морозильной камеры (-15 - 20oC), холодильника (0 + 5oC) и комнаты (+20 + 25oC). Каждые 2 месяца отбирали аликвоты 0.1 мл в 50 мл боратного буферного раствора (с pH 9.18) и измеряли оптическую плотность на длинах волн 502, 532 и 654 нм. Измерения производились на пишущем спектрофотометре Hitachi 557. Соотношение 502/532 для чистого N-метилглюкозаминового комплекса хлорина в воде составляет 3. При распаде хлоринового макроцикла до линейных тетрапирролов уменьшается величина поглощения на длине волны 654 нм (н, соответственно, уменьшается удельная экстинкция) и одновременно уменьшается соотношение 502/532 за счет одновременного роста поглощения на обеих длинах волн (растет фоновое поглощение в этом диапазоне длин волн). Изменение данных контрольных величин за 2 мес. и за год представлено в Табл.2.

Известно, что уменьшение экстинкции при хранении примерно на 10% в год для лекарственных субстанций допустимо. В данном примере хранение в условиях морозильной камеры ведет к уменьшению обоих показателей примерно на 5% за год, а в условиях холодильника - примерно на 13% за год. При этом сохраняется фильтруемость соединений (не образуется осадка), что важно для фармацевтики.

Данные по устойчивости 2%-ного водного раствора хлорина при хранении в различных температурных условиях в зависимости от времени приведены в Таблице 3.

Наряду с измерением оптических свойств растворов N-метилглюкозаминового комплекса хлорина в процессе хранения проводили анализ образцов методом тонкослойной хроматографии. Для этого брали аликвоты 0.1 мл, нейтрализовали 1 N соляной кислотой до pH 5 - 6, выпавший хлорин экстрагировали диэтиловым эфиром, экстракт сушили 1 час безводным сульфатом магния и хлорин этерифицировали диазометаном, получая хроматографически подвижный эфир. ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 "Merck" в системе хлороформ/ацетон 20 : 1. Согласно этому анализу, во всех образцах за первые 4 месяца хранения значительно уменьшилось количество примесного феофорбида и несколько увеличилось количество пурпурина, а в последующие 6 месяцев уменьшалось количество пурпурина и возрастало количество хлорина Заметное образование полярных продуктов желтого или желто-зеленого цвета началось с 4-го месяца хранения и в наибольшей степени отмечалось в образцах, хранение которых осуществлялось при комнатной температуре. Этот процесс коррелирует с падением экстинкции.

Не все из полученных комплексов способны давать 2%-ный раствор по хлорину при физиологических значениях pH (Таблица 1). Так, только комплексы с лизатом натрия и аргинатом натрия дают такой раствор при pH 8.3, и это не предел их растворимости. 4-Аминобутанол, глюкозамин и N-метилглюкозамин способны образовывать насыщенный 2%-ный раствор только при pH 8.5.

Для сравнения были получены калиевые и натриевые соли хлорина При pH 8.3 предельная концентрация калиевой соли в воде составила 1.25%, а натриевой - 0.97% причем эти значения являются одними из наименьших (см. Таблицу 1), наряду с солями нейтральных аминокислот и свободными основаниями малоосновных аминокислот.

Следовательно, такие соли непригодны для получения лекарственных форм по причине, во-первых, низких предельных концентраций, во-вторых, из-за повышенной склонности к агрегации и образованию нерастворимых в воде продуктов.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что целевые продукты - водорастворимые комплексы хлоринов -получаются в устойчивой форме и с высоким выходом за счет упрощения условий выделения. Он позволяет получить ранее не описанные химические соединения. Предлагаемый нами вариант стабилизации хлорина открывает путь к получению эффективного и доступного ФС. Предполагается использование полученных новых соединений в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ рака и при фотодеструкции запустелых сосудов роговицы глаза. Предложенный способ будет реализован при промышленном производстве лекарственных средств "Хлорин" и "Фотодитазин". 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения водорастворимых хлоринов путем взаимодействия исходного хлорина с раствором основания, отличающийся тем, что в качестве исходного хлорина используют соединение общей формулы (1)



или (2)



где R1 = -CH(OAIk)CH3, -CH=CH2, -CHO, -C(O)CH3;

R2 = H или низший алкил;

R3 = -CH3, -CHO,

а в качестве основания - линейный или циклический первичный или вторичный амин, аминокислоту или соль аминокислоты, при этом исходный хлорин предварительно переосаждают путем постепенного прибавления воды к его ацетоновому раствору, а стехиометрическое количество основания прибавляют непосредственно к влажному осадку исходного хлорина с последующим юстированием 1,5 - 2%-ного водного раствора целевого продукта концентрированным раствором соответствующего основания или концентрированной HCl до pH 7,5 - 8,5.

2. Способ получения водорастворимых хлоринов по п.1, отличающийся тем, что в качестве основания используют 4-аминобутанол, N-метилглюкозамин, глюкозамин, аргинин, лизин, гистидин, натриевые или калиевые соли аргинина, лизина или гистидина.