СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ


--- Закажите полную версию данного патента ---
RU (11) 2142816 (13) C1

(51) 6 A61K39/12, A61K9/02 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1999.12.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 97110015/14 
(22) Дата подачи заявки: 1997.06.20 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 1997.06.20 
(45) Опубликовано: 1999.12.20 
(56) Аналоги изобретения: US 4774323, 27.09.88. JP B63-32768, 01.07.88. EP 0246680 A1, 25.11.87. Wo 92/02251, 20.02.92. 
(71) Имя заявителя: Баринский Игорь Феликсович; Воробьева Майя Сергеевна; Лазаренко Алла Арнольдовна; Подчерняева Раиса Яковлевна; Алимбарова Людмила Михайловна; Самойленко Игорь Иннокентьевич; Еремян Людмила Константиновна 
(73) Имя патентообладателя: Баринский Игорь Феликсович; Воробьева Майя Сергеевна; Лазаренко Алла Арнольдовна; Подчерняева Раиса Яковлевна; Алимбарова Людмила Михайловна; Самойленко Игорь Иннокентьевич; Еремян Людмила Константиновна 
(98) Адрес для переписки: 123060, Москва, ул.Бирюзова 43, кв.123 Самойленко И.И. 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА НА ЕЕ ОСНОВЕ 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам получения концентрированных вирионных антигерпетических вакцин. Согласно изобретению вирусы простого герпеса типов 1 или 2 выращивают в роллерном аппарате на монослое клеток почек зеленых мартышек Vero, чувствительных к названным вирусам; после адсорбции вирусов на клетках инфицированные таким образом клетки инкубируют в среде поддержки; для высвобождения вирусов из клеток осуществляют цикл замораживания-оттаивания; вирусы инактивируют гамма-излучением, например, кобальта-60; суспензию вирусов, образовавшуюся после отделения остатков разрушенных клеток в результате низкоскоростного центрифугирования, очищают и концентрируют фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,07 мкм. В качестве лекарственной формы вакцины предложена свеча, содержащая помимо самой вакцины также масло какао, гиалуроновую кислоту, -токоферол, L-аскорбиновую кислоту и 2-интерферон. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств для борьбы с вирусной инфекцией. 2 с. и 3 з.п.ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины, а именно к производству противовирусных вакцин, а также к лекарственным формам на их основе.

Известен способ получения вирионной герпетической вакцины исходя из вирусов простого герпеса типов 1 и 2 (ВПГ-1 и ВПГ-2 соответственно), выращиваемых на поверхности стационарного микроносителя при использовании первичной культуры клеток почек кролика (Андонов П. и соавт. "Вопросы вирусологии", 1979, N 6, стр. 665 - 671). Этот способ, однако, не позволяет достичь высоких урожая и концентрации вирусов ввиду использования первично трипсинизированных клеток.

В способе получения вакцины против вируса простого герпеса согласно патенту США N 4816250 (кл. 424/89; опубл. 28.03.89 г.) инфицированные клетки эмбриона человека MRC 5 после инкубирования обрабатывают поверхностно-активным веществом, полипептидные цепи цитоплазматической фракции фиксируют и проводят центрифугирование при 650 g. Метод довольно сложен и включает использование антител, иммобилизованных на сефарозе.

Получение вакцины против вируса простого герпеса согласно заявке ЕВП N 48201 (МКИ5: A 61 K 39/245; опубл. 1985 г.) предполагает экстракцию инфицированных клеток мочевиной в концентрации 2М - 8М, центрифугирование или фильтрацию, воздействие ультразвуком, концентрирование фильтрацией через особые сорбенты, обработку ферментом ДНКазой и очистку гель-хроматографией. Очевидно, что столь сложный метод едва ли приложим к рутинным, крупномасштабным наработкам.

Известен, далее, выбранный в качестве наиболее близкого аналога-прототипа заявляемого изобретения и описанный в патенте Российской Федерации N 2014084 (МКИ5: A 61 K 39/245; заявл. 28.12.91 г., опубл. 15.06.94 г.) способ получения вирионной герпетической вакцины, согласно которому вирусы выращивают на монослое фибробластов куриных эмбрионов в ростовой среде при перемешивании в биореакторе специальной конструкции, причем сами эти фибробласты предварительно выращены на носителях в форме микрочастиц (размер 100 - 1200 мкм) цитолара - 2 (денатурированного коллагена), цитопола /поливинилового спирта с желатиновым покрытием/ или цитогеля из денатурированного коллагена с размером пор 50 - 80 мкм. Фибробласты, после инфицирования их вирусом, инкубируют в течение 24 - 48 час до проявления вирусом своей цитопатичности на 80 - 90%; содержащую вирусы жидкость сливают, замораживают ее до минус 20oC и оттаивают при (371)oC с целью разрушения клеток и выхода вирусов наружу. Затем вирусы инактивируют формалином при конечном разведении последнего 1: 2000 сначала в течение 72 час при 371oC и затем в течение 10 суток при (41)oC, остатки разрушенных клеток (т.н. детриты) отделяют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин при температуре (41)oC и надосадочную жидкость лиофилизируют.

К недостаткам известного способа-прототипа следует отнести необходимость применения биореакторов специальной конструкции с непрерывным перемешиванием микроносителей, что, при отсутствии необходимых параметров, отрицательно влияет на конечную концентрацию вирусов; кроме того, длительно протекающая стадия инакивации вирусов формалином (13 суток) вызывает снижение антигенной активности целевого препарата и ухудшает иммуногенные характеристики вакцины. Необходимо также отметить, что внутрикожное выведение такой вакцины сопровождается у больных неприятным чувством жжения (из-за присутствия формалина) и требует применения особого шприца.

Целью настоящего изобретения является создание такого способа получения вирионной антигерпетической вакцины, который:

- не требовал бы сложного аппаратурного оформления;

- позволял бы увеличить урожай и концентрацию вирусов;

- давал бы возможность избежать ухудшения иммуногенной активности вакцины;

- обеспечивал бы, в конечном счете, возможность получения антигерпетической вакцины в крупных ("промышленных") масштабах.

Другой целью изобретения является создание новой лекарственной формы вирионной антигерпетической вакцины, в дополнение к уже существующим.

Поставленные цели достигаются благодаря тому, что

- в способе получения вирионной антигерпетической вакцины, включаем: выращивание вирусов простого герпеса типов 1 и 2 на монослое животных клеток, которые помещены в ростовую среду; адсорбцию вирусов на клетках; инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки; высвобождение вирусов из клеток в цикле замораживания-оттаивания; инактивирование вирусов; очистку от остатков разрушенных клеток (детритов) низкоскоростным центрифугированием; концентрирование культуральной жидкости, содержащей инактивированные вирусы, - в качестве животных клеток используют клетки почек зеленых мартышек Vero, чувствительные к вирусам простого герпеса 1 или, соответственно, 2; инактивирование вирусов осуществляют при обработке гамма-излучением, например, кобальта-60 в дозе 15 - 20 кГр в течение 2 часов при (201)oC; суспензию вирусов, после низкоскоростного центрифугирования, очищают и концентрируют в процессе фильтрации через мембраны, имеющие диаметр пор 0,07 мкм, при температуре (41)oC до достижения коэффициента концентрирования 5 и получения в фильтрате целевого продукта, при этом культивирование клеток почек зеленых мартышек осуществляют в роллерном устройстве в течение 24 - 48 часов, в зависимости от типа вируса;

- предложена новая лекарственная форма вакцины, выполненная в виде свечи (суппозитория), содержащей, помимо собственно вакцины (суспензии), также масло какао, гиалуроновую кислоту, -токоферол, L-аскорбиновую кислоту и 2-интерферон, при следующем соотношении компонентов: вакцина - 20 мл (108 бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса); - гиалуроновая кислота - 1 - 2 г; - -токоферол - 1 - 2 г; L-аскорбиновая кислота - 1,5 - 2 г; 2-интерферон - (3 - 5)106 международных единиц; масло какао - до 100 г.

-Токоферол и L-аскорбиновая кислота играют роль мембранопротекторов, а гиалуроновая кислота - роль пролонгатора действия.

Выше отмечалось, что при подкожном введении вакцин нередко возникают нежелательные побочные реакции (жжение, опухание, отек, покраснение и т.п.). По этой причине не раз предпринимались попытки найти иной путь введения вакцин, отличный от инъекции. Так, например, в заявке ЕВП N 640347 (МКИ5: A 61 K 39/00; опубл. 01.03.95 г.) описана композиция антигенов для перорального введения, содержащая фосфатидилсерин и маннозу; в заявке ЕВП N 242205 (МКИ5: A 61 K 39/00; опубл. 06.10.93 г.) предложена вакцинная композиция, включающая масло и сапонин и применяемая перорально в виде эмульсии вода в масле. Вакцины для интраназального (через нос) введения описаны в патентах США N 4800078 (кл, 424/86; опубл. 24.01.89 г.) и N 5124148 (кл. 424/86; опубл. 23.06.92 г.). Использование вакцины в виде спрея (в ветеринарии, для борьбы с чумкой собак) предложено в патенте США N 3420934 (кл. 424/89; 1968 г.). Неожиданным образом в настоящем изобретении открыта возможность использовать антигерпетическую вакцину в виде свечи, что расширяет терапевтические перспективы применения вакцин.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Путем серийного пассирования вирусы простого герпеса, шпаммы "Ус" (ВПГ-1) и "ВН" (ВПГ-2), адаптируют к культуре перевиваемых клеток почек зеленых мартышек Vero, которые аттестованы в соответствии с нормативными указаниями РД 42-28-10-89 "Аттестация перевиваемых клеточных культур-субстратов производства и контроля медицинских и иммунобиологических препаратов" и разрешены Государственным институтом стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Минздрава Российской Федерации для производства вакцин. Названную культуру, с посевной концентрацией 100 клеток/мл, выдерживают в роллерных матрицах при (371)oC в течение 48 час до образования плотного монослоя клеток. Затем вносят инфицирующий материал в дозе 0,05 бляшкообразующей единицы на клетку (0,05 БОЕ/клетку) в случае ВПГ-2 или 0,1 БОЕ/клетку в случае ВПГ-1, проводят абсорбцию вирусов в течение 1 часа и инкубируют в течение 24 часов/дня ВПГ-1) или 48 часов (для ВПГ-2) до полного разрушения монослоя клеток в результате цитопатического действия вирусов, после чего роллеры с содержимым подвергают однократному замораживанию при температуре минус (201)oC и оттаиванию при комнатной температуре для полного высвобождения вирусов из клеток и их перехода в культуральную жидкость. Низкоскоростным центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин, (41)oC) отделяют остатки разрушенных клеток-детриты-, и полученную суспензию вирусов очищают и концентрируют на фильтрационно-мембранном аппарате с диаметром пор 0,07 мкм, производства НИИ особо чистых препаратов, г. Санкт-Петербург, при температуре (41)oC до достижения коэффициента концентрирования 5, вслед за чем вирусы инактивируют гамма-излучением от источника кобальт-60 при дозе 15 - 20 кГр и температуре (201)oC в течение 2 часов. Полученную суспензию, взятую в количестве 20 мл (что отвечает 108 БОЕ), смешивают с 1 - 2 г гиалуроновой кислоты, 1 - 2 г -токоферола, 1,5 - 2 г L-аскорбиновой кислоты, (3 - 5)106 международных единиц 2-интерферона и с маслом какао до общей массы 100 г, из полученной массы изготавливают известным способом свечи массой 1,5 - 2 г каждая. Свеча содержит 500 мкг/г белка, имеет остаточную влажность 2,5% и физиологическое значение pH 7,50,2, нетоксична и способна индуцировать у крыс синтез антител, нейтрализующих вирусы, при индексе нейтрализации, равном 3,0 lg ТЦД50/мл по ВПГ-2 и 2,0 lg ТЦД50/мл по ВПГ-2, где ТЦД50 означает дозу, вызывающую цитопатический эффект в 50% инфицированных вирусом пробирок с монослоем клеток.

Пример 2 (сравнительный). Поступают, как описано в примере 1, но опускают стадию концентрирования на фильтрационно-мембранном аппарате; в этом случае полученная вакцина индуцирует у крыс синтез нейтрализующих вирусы антител с индексом нейтрализации для ВПГ-1, равном 2,0 lg ТЦД50/мл, а в случае вируса ВПГ-2 равном 1,5 lg ТЦД50/мл, при этом достоверно ниже оказывается иммуногенность вакцины.

Предлагаемый способ обеспечивает стабильное накопление вирусов, а также многократное (в 100 раз!) увеличение концентрации вакцинных штаммов вирусов, что является перспективным с точки зрения уменьшения кратности применения препарата у больных, страдающих герпесом. Кроме того, благодаря инактивации вирусов гамма-излучением и отказу от химических агентов инактивации (формалина), сохраняются антигенность и стабильность препарата при надежном подавлении инфекционности штаммов вирусов, а недостатки инъекционного способа введения вакцины устраняются при использовании вакцины в форме свечи. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины, включающий культивирование чувствительных к избранному вирусу перевиваемых животных клеток; внесение инфицирующего материала и его адсорбирование на клетках; инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки; высвобождение вирусов из клеток в результате цикла замораживания - оттаивания; отделение остатков разрушенных клеток низкоскоростным центрифугированием; очистку и концентрирование суспензии вирусов и их последующее инактивирование, отличающийся тем, что в качестве перевиваемых животных клеток используют клетки почек зеленых мартышек Vero, чувствительные к вирусам простого герпеса типов 1 или 2; культивирование осуществляют в роллерном устройстве в течение 24 - 48 ч в зависимости от типа вируса; для очистки и концентрирования проводят фильтрацию через пористые мембраны с размером пор 0,07 мкм, а вирусы в полученном в виде фильтрата целевом продукте инактивируют действием гамма-излучения.

2. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины по п.1, отличающийся тем, что процесс фильтрационной очистки и концентрирования через пористые мембраны осуществляют при (4 1)oС до достижения коэффициента концентрирования 5.

3. Способ получения вирионной антигерпетической вакцины по п.1, отличающийся тем, что при проведении инактивирования вирусов в качестве источника гамма-излучения используют кобальт-60 при дозе 15 - 20 кГр в течение 2 ч при (20 1)oС.

4. Лекарственная форма вирионной антигерпетической вакцины, полученной по п.1, отличающаяся тем, что она выполнена в виде свечи (суппозитория).

5. Лекарственная форма вирионной антигерпетической вакцины по п.4, отличающаяся тем, что она содержит помимо собственно вакцины также гиалуроновую кислоту, -токоферол, L-аскорбиновую кислоту, 2-интерферон и масло какао при следующих соотношениях компонентов: вакцина - 20 мл (~108 бляшкообразующих единиц вируса простого герпеса); гиалуроновая кислота - 1 - 2 г; -токоферол - 1 - 2 г; L-аскорбиновая кислота - 1,5 - 2 г; 2-интерферон - (3 - 5) 106 международных единиц; масло какао - до 100 г.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал

Подборка патентов изобретений и технологий относящихся к медицине, а именно:
  • Все от зачатия и до рождения ребенка. Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология

  • Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология

  • Дерматология и дерматовенерология

  • Иммунология. Способы диагностики и лечения (ВИЧ) и приобретенного иммунодефицита (СПИД)

  • Кардиология и кардиохирургия

  • Фармацевтика. Лекарственные и косметические средства и композиции

  • Медицинская техника

  • Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей

  • Неврология, невропатология и неонатология

  • Онкология и радиология

  • Оториноларингология

  • Офтальмология

  • Вирусология, паразитология и инфектология

  • Педиатрия и неонатология

  • Психиатрия, психотерапия

  • Пульмонология и фтизиатрия

  • Стоматология

  • Способы диагностики функционального состояния организма человека

  • Травматология, артрология и ортопедия

  • Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия

  • Урология, нефрология и андрология

  • Физиотерапия

  • Хирургия

  • Эндокринология

  • Косметология. Санитария и гигиена


Медицина






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "лечение бесплодия" будет найдено словосочетание "лечение бесплодия". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("лечение" или "бесплодия").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+лечение -бесплодия".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "бесплодие" будут найдены слова "бесплодия", "бесплодию" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "бесплодие!".

Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология | Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология | Дерматология и дерматовенерология | Иммунология. Вирусология. Способы лечения синдрома приобретенного иммунного дефицита (спид) | Кардиология и кардиохирургия | Лекарственные и косметические средства и композиции | Медицинская техника | Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей | Неврология, невропатология и неонатология | Онкология и радиология | Оториноларингология | Офтальмология | Вирусология, паразитология и инфектология | Педиатрия и неонатология | Психиатрия, психотерапия и психофизиология | Пульмонология и фтизиатрия | Стоматология | Травматология. Артрология и ортопедия | Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия. Диагностика заболеваний и функционального состояния организма человека | Урология, нефрология, андрология | Хирургия | Эндокринология | Косметология


Rambler's Top100 Webalta Уровень доверия Цитирование