ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ


--- Закажите полную версию данного патента ---
RU (11) 2083589 (13) C1

(51) 6 C07K14/00, A61K38/10, A61K38/12 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 92016593/04 
(22) Дата подачи заявки: 1992.05.01 
(31) Номер конвенционной заявки: 3/130410 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1991.05.02 
(33) Страна приоритета: JP 
(45) Опубликовано: 1997.07.10 
(56) Аналоги изобретения: Шведер Э., Любке К., Пептиды. - М.: Мир, ч. 1967, с. 398. ЕПВ, 0515681, кл. C 07 K 5/06, 1991. ЕПВ, 0443132, кл. C 07 K 5/06, 1991. T. Muta et al. Tachyplesins isolated from hemocytes of southeast asian horseshoe crabs (carunoscorpius rotundicanda and tachypleus gigas); identification ofa new tachyplesin, tachyplesin III, and w processing intermediate of obs precursor. J. of Biochemistry. 108, N 2, 261 - 266. 
(71) Имя заявителя: Сейкагаку Когио Кабусики Кайся (JP) 
(72) Имя изобретателя: Нобутака Фудзии[JP]; Наоки Ямамото[JP]; Акиеси Матсумото[JP]; Митинори Ваки[JP] 
(73) Имя патентообладателя: Сейкагаку Когио Кабусики Кайся (JP) 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: JP 92/00580 (01.05.92) 

(54) ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ 

Назначение: в медицине в качестве антибактериального и противовирусного агента (например, анти-ВИЧ агент). Сущность изобретения: полипептиды формулы 1: A1-Tгр-Cys-Tyr-A2-Cys-A3-A2-Gly- A3-Cys-Tyr-A2-A2-Cys-A1-NH2 или их соли, где A1=Аргинин, аргиниларгинин; A2=аргинин, лизин; A3=тирозин, фенилаланин, причем остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 4 и 12 могут быть связаны через дисульфидный мостик; фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента эффективного количества от 10 до 5000 мг/кг веса человеческого тела в день полипептида 1, в котором остатки цистеина в положениях 3 и 16, и 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик. 3 с.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к полипептидам или их солям, обладающим сильным средством к липополисахаридам, в частности эндотоксинам.

Такой полипептид можно использовать в фармацевтической композиции в качестве антибактериального или противовирусного агента (например, анти-ВИЧ агента).

2. Предпосылки изобретения

Два семейства противомикробных полипептидов были выделены из камчатского краба (см. например, Shigenaga 1990, j. Biol.chem т. 265, стр. 21350-21354; Kawara и др. 1990, j.Biol.chem, т. 108, стр. 261-266; Открытая патентная публикация N 167230/1990; Открытая патентная публикация N 152987/1990; Открытая патентная публикация N 53799/1990; Опубликованная исследовательская заявка 500194/1990; Miyatfa и др. 1989, j.Biol.chem 106, стр. 663-668; Akaji и др. 1989, chem.Pharm. Bull т. 37, стр. 2661-2664; Taisha (Метаболизм), т. 26, стр. 301-311 (1989); Shieh и др. 1989, FEBS Lett. т. 252, стр. 121-124; и Nakamura и др. 1988, j.Biol. chem. т. 263, стр. 16709-16713). Одно семейство, семейство тачиплезина, было выделено из японского краба Tachypleus. Три тачиплизина I, II и III были идентифицированы, их аминокислотные последовательности приведены на чертеже. Кроме того, производное пептида тачиплезина с карбоксилконцевым продолжением гликолализина было обнаружено в Южно-азиатских видах краба, Carcinoscorpius of undicanda (Muta и др. 1990, j. Biochem. т. 108, с. 261-266). Второе семейство, семейство полуфемузина, было выделено из гемоцитов Американского краба, Limulus polyphemus. Два полифемузина I и II были идентифицированы. Их аминокислотные последовательности приведены также на чертеже. Полипептиды обоих семейств состоят из 17 или 18 аминокислотных остатков и имеют четыре сохраняемые общие области и два дисульфидных мостика (см. чертеж). Было установлено, что как тачиплезины, так и полифемузины ингибируют как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии при низких концентрациях, а также грибы такие, как Candide albicaus и образуют комплексы с бактериальными липополисахаридами (Shigenaga и др. 1990, j. Biol.chem, т. 265, с. 21350-21354, и Muta и др. 1990, j. Biochem. т. 108, с. 261-266).

Кроме того, как было установлено, полипептиды в семействе тачиплезина обладают некоторой активностью по ингибированию вируса такого, как вирус гриппа, вирус везикулярного стоматита (marakaui и др. 1991, chemotherapy, т. 37, с. 327-334) или вирус иммунодефицита человека (Morimoto и др. 1991, chemotherapy, т. 37, с. 206-211).

3. Краткое описание изобретения

Изобретение относится к новым полипептидам, которые получают из камчатских крабов и которые обладают некоторой гомологичностью с полипептидами высокого сродства относительно эндотоксина, в частности, тачиплезинами и полифемузинами, но обладают также существенным отличием. В полипептидах камчатских крабов аминокислота в 6-позиции тачиплезинов или в 7-позиции полифемузинов является валином (Val), нейтральными алифатическими аминокислотами. В полипептидах, являющихся предметом изобретения, аминокислотный остаток в 6-позиции является лизином (Lys) или аргинином (Arg); эти основные аминокислотные остатки существенно отличаются по свойствам от валинового остатка. Кроме того, аминокислотный остаток в 11-позиции в полипептидах, являющихся предметом изобретения, является тирозином (Tyr), фенилаланином (Phe) или триптофаном (Trp), ароматическим аминокислотным остатком, обладающим отличными свойствами от изолейцина (Ile) в 11-позиции тачиплезинов.

Новые полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут быть использованы в качестве анти-ВИЧ агентов. Как будет подробно описано в разделе 6, см. ниже, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, обладают анти-ВИЧ активностью, которая значительно выше по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством эндотоксина камчатских крабов.

3.1 Определения

Пептидные последовательности, определяемые здесь, представляются сокращениями из трех букв для аминокислотных остатков следующим образом:

Ala (аланин); Arg (аргинин); Cys (цистеин); Gly (гликокол); Ile (изолейцин); Leu (лейцин); Phe (фенилаланин); Trp (триптофан); Tyr (титрозин) и Val (валин).

Приводимые термины в настоящем патентном описании имеют следующий смысл:

HIY (ВИЧ) вирус иммунодефицита человека (все варианты)

MOI множественность инфекции

S] индекс селективности (отношение CC50 к EC50).

4. Краткое описание чертежей.

На чертеже приведены аминокислотные последовательности Тачиплезина I, Тачиплезина II, Тачиплезина III, Полифемизина и Полифемизина II. Сохраняемые аминокислоты помещены в квадраты. Дисульфидные связи между Cys 3 или -4 и Cys -16 или -17, и Cys -7 или -8 и -12 отмечены жирными линиями.

5. Подробное описание изобретения

Изобретение относится к новому полипептиду, представляемому следующей формулой (I):

или его солям, в которой

A1 независимый аминокислотный или пиптидный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и аргинилагринина;

A2 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина или лизина;

A3 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4=NH2.

В специальном варианте осуществления изобретения цистеиновые остатки в 3- и 16-позициях и/или цистеиновые остатки в 7- и 12-позициях могут быть связаны через дисульфидную связь (-S-S-). А также к фармацевтической композиции для ингибирования ВИЧ-активности у пациента, включающей активный ингредиент и по крайней мере один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество от 10 до 5000 мг/кг веса человеческого тела в день полипептида формулы I, где

A1=Аргинин или аргиниларгинин

A2=аргинин или лизин

A3=тирозин или фенилаланин

A4=NH2,

при этом остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик.

Подобно полипептидам с высоким сродством относительно эндотоксина, выделенным из камчатских крабов, известным в этой области техники, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, обладают антипараллельной бета-листовой структурой из-за существования внутримолекулярных водородных связей и четырех цистеиновых остатков в 3-, 7-, 12-и 16-позициях. Поворачивающаяся позиция с возможно структурой бета-поворота расположена в 9- и 10-позициях. Пептидная часть 3-позиции к 8-позиции и пептидная часть 11-позиции к 16-позиции расположены против друг друга.

Однако в контрасте с известными полипептидами, выделенными из камчатских крабов, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, являются более основными. В частности, аминокислотный остаток в 6-позиции является аргининовым (Arg) или лизиновым (Lys) остатком. Аминокислотный остаток в 6-позиции в полипептидах, выделенных из камчатских крабов, является валиновым остатком.

Благодаря своей основной природе, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут образовать соли при помощи присоединения кислоты. Например, полипептид образует соль с неорганической кислотой (хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой и т. п.) или с органической карбоновой кислотой, уксусной кислотой, галоуксусной кислотой такой, как трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, винная кислота, салициловая кислота и мочевая кислота такая, как глюкуроновая кислота или хиалуроновая кислота и т.п. (или органической (моно) сульфокислотой (метан/моно/сульфокислотой, пара-тулоол/моно/сульфокислотой и т.п.), включая сложный эфир сахара (моно/сульфокислоты такой, как сульфаты чондроитина).

5.1. Получение полипептидов

Новый полипептид изобретения может быть получен при помощи известных приемов, например, приемов синтеза в твердой фазе, описанных в книге: "Solid-Plase Peptide Sepethesis" Stew-art u Joung, Pierce chemical Company, Rochford, Illinois (1984).

Полипептид с линейной цепью, являющийся предметом изобретения, имеющий приведенную формулу (I), может быть получен при помощи установления связи карбоксильной группы N-защищенного аргинина в 17-позиции с нерастворимой смолой, имеющей амино-группы, непосредственно присоединенное или альтернативно присоединенное через "промежуток", имеющую функциональную группу, способную связываться с карбоксильной группой (например, группой, способной превратить карбоксильную группу аргинина в паракарбоксиметилбензиловый сложный эфир). Аминовая группа нерастворимой смолы, содержащей аргининовый (Arg) остаток в 17-позиции, после деблокирования -амино (NH2)-защищающей группы способна последовательно связываться при осуществлении процедуры в твердой фазе через соответствующие защищенные аминокислоты в 16-позиции с 1-позицией аминокислотной последовательности, представленной следующей формулой 1:



в которой A1, A2, A3, A4, Cys и Giy уже были определены выше), далее осуществляют исключение (удаление) нерастворимой смолы и защищающих групп аминокислот. В этом случае карбоксильные окончания аминокислотного остатка в 17-позиции могут быть либо свободными (A4 соответствует OH), либо превращены в аминокислоты (A4 соответствует - Nh2). Два цистеина в 3- и 16-позициях и 7- и 12-позициях могут образовывать дисульфидную связь (-S-S-) через меркапто группы при окислении воздухом или дисульфидная связь может быть образована по способу Атертона и др. (Atherton, E. и др. J.chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1985, стр. 2065), а именно через стадии селективной защиты меркапто групп одной из пар цистеинов в 3- и 16-позициях и 7- и 12-позиций защищающей группой, t-Bus (т-бутилтио), или меркапто групп другой пары цистеинов защищающей группой, Acm (ацетамидометил); затем осуществляют удаление t-Bus, частично окисляя меркапто группы; а затем удаляют Acm-защищающую группу, используя приемы, известные в этой области техники.

Любая нерастворимая смола, содержащая аминогруппу, может быть использована для синтеза нового полипептида, являющегося предметом изобретения, если только она может связываться через свои аминогруппы с карбоксильной группой N-защищенного аргинина или лизина на C-окончании, или, в некоторых случаях, с карбоксильной группой "распорки", соединенной с ней, а затем ее можно удалить (исключить). Примеры таких нерастворимых смол включают (но ими не исчерпывается весь список) амино-метиловые смолы (аминометилированный стирол-дивинилбензол, сополимеры), бензгидриламиновые смолы, метилбензгидриламиновые смолы и аминометилфеноксиметиловые смолы и их производные. Когда используют бензгидриламиновую смолу, метилбензгидриламиновую смолу, диметоксибензгидриламиновую (ДМБГА) смолу или аминометилфеноксиметиловую смолу, амид получают непосредственно при помощи расщепления, но амино-метиловая смола предпочтительна с точки зрения выхода.

Соответствующие аминокислоты, используемые в твердой фазе синтетического метода, могут находиться в L- или D-формах. Защищенной аминокислотой является аминокислота, чьи функциональные группы могут быть защищены защитной группой, используя приемы, известные в этой области техники, или различные защищенные аминокислоты, могут быть получены от фирм-производителей. Любому специалисту в этой области техники известно, что полипептидные синтетические методы требуют использования защищенной группы, чтобы стабилизировать неустойчивую боковую цепь аминокислоты, чтобы предохранить боковую цепь от химического изменения в процессе синтеза. Защищающую группу для -аминогруппы аминокислоты выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Boc(т-бутилоксикарбонил) или Fmoc(9-флюоренилметилоксикарбонил). Защищающую группу для гуанидино группы аргинина (Arg) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Tos (толилсульфонил), NO2 (нитро), Mtr (4-метокси-2,3,6-триметилбензол-сульфонил) или Imc (2,3,5,7,8-пентаметилхроман-5-сульфонил). Защищающая группы для меркапто группы цистеина (Cys) может быть выбрана из группы, включающей (но ими не исчерпывается весь список), Bzl (бензил), MBzl (4-метоксибензил), 4-MeBzl (4-метилбензил), Acm (ацетамидометил), Trt (тритил), Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил), t-Bu (т-бутил) или t-Bus (т-бутилтио) и MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm и Npys используют в предпочтительном варианте. Защищающие группы для гидроксильной группы тирозина (Tyr) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Bzl, Cl2Bzl (2,6-хлорбензил) или t-Bu. Защищающую группу для e -амино группы лизина (Lys) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список (z) бензилоксикарбонил), Clz (2-хлор-бензилоксикарбонил), Boc или Npys.

Сцепление защищенных аминокислот может быть осуществлено в соответствии с различными приемами конденсации, известными в этой области техники, такими, как, например, метод ДЦК (дициклогексилкарбодимида), метод ДИПКДИ (диизопропилкарбодиимида Tartar, А. и др. 1979, J.Org. chem. т. 44, стр. 5000), метод активного сложного эфира, метод смешанных или симметричных ангидридов кислот, метод карбонилдиимидазола, метод ДЦК-НОВ t (1-оксибензотриазола) (konig W. и др. 1970, Chem. Ber т. 103, с. 788, 2024-2034) или метод дифенилфосфорил азида, но в предпочтительном варианте используют ДЦК-метод, ДЦК-НОВ t-метод, ДИПКДИ-НОВ t-метод или метод симметричного ангидрида кислоты. Реакцию конденсации можно осуществить в органическом растворителе таком, как дихлорметан или диметил формамид, или их смеси. Деблокирующий реагент такой, как трифторуксусная кислота (дихлорметан, HCl) диоксан, пиперидин/диметилформамид (ДМФ используют для того, чтобы деблокировать защищающую группу для -аминогруппы. Степень развития реакции конденсации на каждой стадии синтеза определяют при помощи процедуры E.Kaiser и др. [Anal. Biochem. т. 34, с. 595 (1970)] (метод реакции нингидирина).

Когда производное аминометиловой смолы используют в качестве нерастворимой смолы, защищенный полипептид удаляют из смолы, например, при помощи обработки защищенной пептидной смолы аммиаком в соответствующем растворителе. Полученный в результате защищенный пептид затем обрабатывают фтористым водородом, чтобы получить амид полипептида, представленный приведенной выше формулой, и освобождают от всех защищающих групп. Когда бензгидриламиновую смолу, метилбензигидриламиновую смолу, аминометилфеноксиметиловую смолу или ДМВНА-смолу (Funa-Koshi. S. и др. J.Chem. Soc. chem. Commun, 1988, 382) используют в качестве нерастворимой смолы, полипептид может быть удален из смолы и защищающие группы могут быть удалены одновременно из полипептида при помощи обработки защищенной пептидной смолы фтористым водородом, МФМСК (трифторметан) моно/сульфокислотой) (опубликовано издательством Academie Press под редакцией E. Gross Jajima H. и др. "The Peptides", том 5, с. 65 (1983)), ТМСОТФ (триметилсилил трифталатом) (Fuji. N. и др. J.Chem. Soc. Chem. Commun. т. 1987, 274) или ТМСБР (триметилсилил бромидом (Fujii. N. и др. Chem. Pharm. Bull. т. 35, с. 3880 (1987) и т.п.)

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полученный в результате полипептид восстанавливают 2-меркаптоэтанолом, ДТТ (дитиотрейтолом) и т. п. чтобы гарантировать, что меркапто группы цистеинов находятся в восстановленном виде. Меркапто группы могут быть затем окислены для того, чтобы получить циклический полипептид. Обработку с целью окисления можно осуществить при помощи известных приемов. В общем случае, используют такой окисляющий агент, как воздух или феррицианат (например, феррицианид калия).

В качестве альтернативы полипептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть получены с использованием техники рекомбинантной ДНК. В соответствии с ней, нуклеотидные кодирующие последовательности для полипептидов могут быть клонированы и экспрессированы с использованием приемов, хорошо известных в этой области техники (см. например, Maniatis и др. Molecular cloniny, a Laboratory manual, Cold spoig Harbor Laboratory, Cold Spoig Harbor, N.y. 1991).

Полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут быть выделены и очищены при помощи средств, хорошо известных в области полипептидов, например, при помощи экстрагирования, рекристаллизации, различных методов хромотографии (гель-проникающей, ионообменной, распределительной, адсорбционной, обращенно-фазовой), электрофореза, распределения при противотоке и т.д. а обращенно-фазовая, высокоэффективная жидкостная хроматография является наиболее эффективной.

5.2. Использование полипептидов

Полипептиды настоящего изобретения, представленные формулой (1), обладают способностью связываться с эндотоксинами, антибактериальной активностью и активностью относительно гемолитизирования чувствительных к эндоксину гемоцитов. Кроме того, полипептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, обладают противовирусной активностью. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды по изобретению обладают анти-ВИЧ активностью. Как будет подробно описано в Разделе 6, см. ниже, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, проявляют существенно более высокую анти-ВИЧ активность по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством относительно эндотоксина (например, Тачиплезины I, II или III, или Полифемизины I или II).

Полипептиды, являющиеся предметом изобретения, таким образом, могут быть использованы в фармацевтических композициях, содержащих полипептиды по изобретению или их соли и приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель, выбранный в соответствии со способом применения и формой применения фармацевтической композиции. Фармацевтическими носителями могут быть такие физиологически совместимые буферы, как раствор Хенка или Рингера, физиологический соляной раствор, смесь, состоящая из соляного раствора и глюкозы, и обработанный гепарином раствор цитрата натрия-лимонной кислоты-дексторозы. Эту фармацевтическую композицию применяют стоматически или перентерально в соответствии с объектом обработки, и ее можно приготовить в такой форме, как порошок, гранулы, раствор для инъекции или стоматического применения, таблетки, суппозитории, пессарии, мази, кремы или аэрозоль, используя соответствующие носители в соответствии со способом применения.

Когда фармацевтическую композицию применяют непосредственно в форме инъекций к пациенту, полипептид или его соль, являющиеся предметом изобретения, могут быть применены непрерывно или через некоторые промежутки времени в количестве от 10 до 5000 мг на кг массы человеческого тела в день, и при помощи внутривенной капельницы в форме раствора в физиологическом соляном растворе.

6. Примеры.

В примерах, приводимых ниже, описан синтез полипептида (I). Кроме того, описаны результаты анализов на анти-ВИЧ активность полипептидов, являющихся предметом настоящего изобретения, и известных полипептидов с высоким сродством к эндотоксину. Полипептиды по изобретению обладают существенно более высокой анти-ВИЧ активностью по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством к эндотоксину.

В приводимых ниже примерах используют следующие аппараты и реагенты:

Аппарат для ВЭЖХ: фирмы Waters Co. США, Модели 600.

Колонна для этого аппарата: типа Asahipar ОДР-90 (фирмы Asahi Chemical Industry Co. Ltd).

Аминокислота Fmoc: производится фирмой Kokusan Kagaku Co.

Амино смола и конденсирующий агент: производятся фирмой Peptide Ken kyusho Co.Ltd

FAB-MS (FAB-масс-спектрограф): фирмы VC Co, США, модели ZAB-SE.

6.1. Пример 1: Синтез полипептида (I). Синтез полипептида (I), который имеет формулу, приведенную ниже, описан в Разделах 7.1.1-6.1.7, см. ниже. Полипептиды (2-33) (см. табл. 1 выше по поводу структур) синтезировали с использованием аналогичных процедур.



Cys-остатки в 3- и 16-позициях, и в 7- и 12-позициях связаны, соответственно, через дисульфидную связь.

6.1.1. Введение в аминометиловую смолу соединения Fmoc ДМВНА-CH2CH2COOH [(3-) -Fmoc-амино-4-метоксибензил)-4-метоксифенил)пропионовая кислота]

270 мг (0,2 ммолей) аминометиловой смолы (0,74 мэкв/г) и 268,5 мг (0,5 ммолей, 2,5 экв) Fmoc-ДМВНА-CH2CH2COOH (ММ 537) помещали в колонну синтеза в твердой фазе и реакцию конденсации осуществляли в течение 2 ч при помощи процедуры ДИПКДИ-НОВ в ДМФ в соответствии с процедурой, предложенной guo L. и др. [Chem. Pharm. Bull. т. 36, с. 4989, 1988).

После завершения реакции связывание осуществляли с целью защиты свободных амино-групп, используя уксусный ангидрид (ДМВНА-смолу).

6.1.2. Введение аргинина в 17-позицию в ДМВНА-смолу.

После удаления Fmoc-групп из ДМВНА-смолы, полученной в разделе 6.1.1. см. выше. 20: пиперидином (ДМФ, добавляли 2,5 эквивалента (экв) Fmoc Arg (Mtr)-OH, в пересчете на ДМВНА-смолу, и реакцию конденсации осуществляли в ДМФ в соответствии с ДИПКДИ-НОВt-процедурой.

Степень развития реакции конденсации контролировали при помощи измерения в соответствии с тестом на нингидрин, предложенным в Kaiser e и др. [Anal. Biochem, т. 34, с. 595, (1970)]

6.1.3. Введение цистеина в 16-позицию.

После удаления Fmoc-групп из ДМВНА-смолы при помощи 20% пиперидина (ДМФ, добавляли 2,5 экв Fmoc-Cys (MBzl)-JH, на базе ДМВНА-смолы, и реакцию конденсации осуществляли в ДМФ при помощи ДИПКДИ-НОВt-процедуры. Степень развития реакции конденсации контролировали по аналогии с 6.1.2. см. выше, при помощи измерения в соответствии с испытанием на нингидрин.

6.1.4. введение аминокислот от 15- до 1 позиции.

По аналогии с приведенным описанием, Lys (Boc), Arg (Mtr), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Tyr [t-Bu] GIy, Lys (Boc), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Lys (Boc), Arg (Mzl), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Trp, Arg (Mtr) и Arg (Mtr) последовательно вводили в ДМВНА-смолу, чтобы получить смолу защищающая группа защищенный полипептид (I).

Реакцию конденсации каждой аминокислоты при синтезе в твердой фазе осуществляли в соответствии с условиями функционирования из табл. 2

6.1.5. Получение полипептида (I) при помощи удаления защищающих групп, удаления полипептида (I) из смолы и частичная очистка.

Защищенную полипептидную (I) смолу подвергали обработке 20% пиперидином (ДМФ, чтобы удалить группу Fmoc, а затем подвергали реакции при температуре 25oC в течение 2 ч в системе 1 М ТМСОТФ-тиоанизол (ТФК) трифторуксусная кислота) (10 мл трифторуксусной кислоты в присутствии м-крезола (100 экв) и) тандитиола (300 экв) на 100 мг смолы. Смолу отделяли фильтрацией из реакционной смеси и дважды промывали 1 мл трифторуксусной кислоты. В смесь фильтрата и промывочной жидкости добавляли последовательно 100 мл охлажденного льдом сухого простого эфира. Образовавшийся осадок центрифугировали и остаток отделяли от верхнего слоя декантированием. Полученный в результате остаток промывали холодным простым эфиром, растворяли в 10 мл 4н. раствора AcOH, добавляли 830 мг, 80 экв дитиотрейтола и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи.

Реакционный раствор центрифугировали, верхний слой обрабатывали Сефадексом Г-10 (sephadex G-10, 3,7х5 см), подвергали гель-проникающей фильтрации с 4н. раствором уксусной кислоты (AcOH), а вытекающий поток собирали в виде основной части элюата и подвергали лиофилизации, чтобы получить порошок частично очищенного нециклизованного полипептида (I).

6.1.6. Получение полипептида (I) окислением воздухом.

У половины вытекшей фракции pH обеспечивали на уровне 7,5 при помощи концентрированного водного раствора аммиака, и ее подвергали окислению воздухом при помощи аэрации, чтобы осуществить реакцию циклизации. После завершения окисления воздухом циклизованный полипептид (I) адсорбировали на 10 г смолы HP-20, а затем элюировали 60% CH3CN (в 1н. растворе AcOH). Элюат концентрировали при комнатной температуре при пониженном давлении, чтобы удалить CH3CN, а затем подвергали лиофилизации, чтобы получить порошок. Порошок растворяли в небольшом количестве воды и раствор сливали на Asahipak и подвергали очистке при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ Модель 600, производимая фирмой Waters Co), используя градиентное элюирование при помощи CH3CN, чтобы получить полипептид (I) с единственным пиком с выходом 27% (величина, рассчитанная на основе смолы защищающая группа защищенный полипептид (I).

6.1.7. Анализ полипептида.

Ценность аминокислотной композиции определяли при помощи переваривания леукции аминопептидазой полипептида, очищенного, как это делали в Разделе 6.1.6, см. выше, при этом получали, что оно согласуется с рассчитанным значением для композиции, основанной для аминокислотной последовательности формулы (1).

Специфическое вращение []2D0 полученного полипептида составляло +8,4o (C=0,1,1н. раствор уксусной кислоты).

6.2. Пример 2: Противовирусная активность против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Противовирусная активность относительно ВИЧ полипептида (I), синтезированного в примере 1, а также полипептидов (2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) и (26) испытывали и оценивали в соответствии со следующей процедурой.

ВИЧ-инфицированные клетки МТ-4 (2,5104 клеток) углубление, множественность инфекции (MOI):0,001) сразу же после инфицирования добавляли вместе с испытываемым материалом с различными изменениями концентрации в микротитрованный планшет с 96 углублениями. После инкубирования при температуре 37oC в течение 5 дней в CO2-инкубаторе измеряли число живых клеток при помощи МТТ-метода (Pouwels и др. J. Virol. methods т. 20, с. 309-321 (1988). Противовирусная активность выражается в виде концентрации, при которой гибель клеток, вызванная ВИЧ-инфекцией, ингибирована на 50% (EC50:50% эффективная концентрация). С другой стороны, для того, чтобы определить цитотоксичность испытываемого материала на МТ-4-клетках, инкубировали не инфицированные вирусом клетки так же, как это описано выше, вместе с испытываемым соединением при различных изменениях концентрации. Цитотоксичность выражается в виде 50% цитотоксичной концентрации (TC50), свойственной испытуемому материалу. Кроме того, грубое отношение CC50 к EC50/CC50/EC50 выражается как эффективное отношение (SI=показатель селективности).

В табл. 3 приведены значения EC50, CC50 и SI для полипептидов (1), (2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) и (26) и известных полипептидов, имеющих высокое сродство с эндотоксинами, в частности, Тачиплезинов I и II и Полифемузинов I и II, и известного Анти-ВИЧ-агента A T.

В табл. 4 приведены физические свойства полипептидов (1), (3), (13), (20) и (21).

Примеры составления фармацевтических композиций.

Пример 1. Капсула для орального применения

полипептид (гидрохлорид примера 1, табл. 3) данного изобретения (активный ингредиент) 100 мг

Зерновой крахмал (разбавители и связующие) 200 мг

Стеарат магния (смазочные материалы) 20 мг

Макрокристаллическая целлюлоза (растворители) 680 мг

1000 мг

Перечисленные компоненты смешивают до однородной массы и заполняют твердые желатиновые капсулы, 200 мг смеси в каждой капсуле.

Пример 2. Композиция для инъекции.

Полипептид (13, табл. 3) данного изобретения 10 мг

Сульфат хондроитин натрия 10 мг

Указанные компоненты растворяют в 2 мл 5%-ного водного раствора маннитола (для внутривенного вливания) и этот получившийся раствор стерильно фильтруют.

Затем фильтрат растворяют в 200 мл 5%-ного водного раствора маннитола (для внутривенного вливания) и получившийся раствор используют для внутривенного капельного вливания.

Результаты, приведенные в табл. 3, указывают на то, что полипептиды, синтезированные в примере 1, обладают существенно более высокой анти-ВИЧ активностью, которую определяли эффективной концентрацией. Соединения (1), (3), (12), (13), (14) и (26), в частности, были особенно селективными при подавлении (уничтожении) ВИЧ-инфицированных клеток. Показатель селективности соединений (1), (3), (12), (13), (14) и (26) был по крайней мере в 7 раз выше по сравнению с любым известным соединением с высоким сродством к эндотоксину. ж 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Полипептиды общей формулы I A1 Тгр Cys Tyг A2 - A2 Cys A3 A2 Gly A3 Cys Tуг A2 A2 Cys A1 A4,

где A1 независимая аминокислота или пептидный остаток, выбранные из группы, состоящей из аргинина и аргиниларгинина;

A2 независимый аминокислотный отстаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и лизина;

A3 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4 NH2,

или их соли.

2. Полипептиды общей формулы A1 Тгр Cys Туг A2 - A2 Cys A3 A2 Gly A3 Cys Tуг A2 A2 Cys A1 A4,

где A1 независимый аминокислотный или пептидный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и аргиниларгинина;

A2 независимый аминокислотный отстаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и лизина;

A3 аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4 NH2,

при этом остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик,

или их соли.

3. Фармацевтическая композиция для ингибирования ВИЧ-активности у пациента, включающая активный ингредиент и по крайней мере один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит эффективное количество 10 5000 мг/кг массы человеческого тела в день полипептида по п.2.




ПРОЧИТАТЬ НУЖНО ВСЕМ !
Судьба пионерских изобретений и научных разработок, которым нет и не будет аналогов на планете еще лет сорок, разве что у инопланетян



Независимый научно технический портал

Подборка патентов изобретений и технологий относящихся к медицине, а именно:
  • Все от зачатия и до рождения ребенка. Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология

  • Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология

  • Дерматология и дерматовенерология

  • Иммунология. Способы диагностики и лечения (ВИЧ) и приобретенного иммунодефицита (СПИД)

  • Кардиология и кардиохирургия

  • Фармацевтика. Лекарственные и косметические средства и композиции

  • Медицинская техника

  • Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей

  • Неврология, невропатология и неонатология

  • Онкология и радиология

  • Оториноларингология

  • Офтальмология

  • Вирусология, паразитология и инфектология

  • Педиатрия и неонатология

  • Психиатрия, психотерапия

  • Пульмонология и фтизиатрия

  • Стоматология

  • Способы диагностики функционального состояния организма человека

  • Травматология, артрология и ортопедия

  • Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия

  • Урология, нефрология и андрология

  • Физиотерапия

  • Хирургия

  • Эндокринология

  • Косметология. Санитария и гигиена


Медицина






СОВЕРШЕННО БЕСПЛАТНО!
Вам нужна ПОЛНАЯ ВЕРСИЯ данного патента? Сообщите об этом администрации портала. В сообщении обязательно укажите ссылку на данную страницу.


ПОИСК ИНФОРМАЦИИ В БАЗЕ ДАННЫХ


Режим поиска:"и" "или"

Инструкция. Ключевые слова в поле ввода разделяются пробелом или запятой. Регистр не имеет значения.

Режим поиска "и" означает, что будут найдены только те страницы, где встречается каждое из ключевых слов. Например, при запросе "лечение бесплодия" будет найдено словосочетание "лечение бесплодия". При использовании режима "или" результатом поиска будут все страницы, где встречается хотя бы одно ключевое слово ("лечение" или "бесплодия").

В любом режиме знак "+" перед ключевым словом означает, что данное ключевое слово должно присутствовать в найденных файлах. Если вы хотите исключить какое-либо слово из поиска, поставьте перед ним знак "-". Например: "+лечение -бесплодия".

Поиск выдает все данные, где встречается введенное Вами слово. Например, при запросе "бесплодие" будут найдены слова "бесплодия", "бесплодию" и другие. Восклицательный знак после ключевого слова означает, что будут найдены только слова точно соответствующие запросу "бесплодие!".

Акушерство, гинекология, сексология и сексопатология | Гастроэнтерология, гепатология и панкреатология | Дерматология и дерматовенерология | Иммунология. Вирусология. Способы лечения синдрома приобретенного иммунного дефицита (спид) | Кардиология и кардиохирургия | Лекарственные и косметические средства и композиции | Медицинская техника | Наркология. Средства выявления и профилактики различного вида зависимостей | Неврология, невропатология и неонатология | Онкология и радиология | Оториноларингология | Офтальмология | Вирусология, паразитология и инфектология | Педиатрия и неонатология | Психиатрия, психотерапия и психофизиология | Пульмонология и фтизиатрия | Стоматология | Травматология. Артрология и ортопедия | Терапия. Мануальная терапия. Физиотерапия. Рефлексотерапия. Биотерапия и фитотерапия. Диагностика заболеваний и функционального состояния организма человека | Урология, нефрология, андрология | Хирургия | Эндокринология | Косметология


Rambler's Top100 Webalta Уровень доверия Цитирование