ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ


RU (11) 2083589 (13) C1

(51) 6 C07K14/00, A61K38/10, A61K38/12 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1997.07.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 92016593/04 
(22) Дата подачи заявки: 1992.05.01 
(31) Номер конвенционной заявки: 3/130410 
(32) Дата подачи конвенционной заявки: 1991.05.02 
(33) Страна приоритета: JP 
(45) Опубликовано: 1997.07.10 
(56) Аналоги изобретения: Шведер Э., Любке К., Пептиды. - М.: Мир, ч. 1967, с. 398. ЕПВ, 0515681, кл. C 07 K 5/06, 1991. ЕПВ, 0443132, кл. C 07 K 5/06, 1991. T. Muta et al. Tachyplesins isolated from hemocytes of southeast asian horseshoe crabs (carunoscorpius rotundicanda and tachypleus gigas); identification ofa new tachyplesin, tachyplesin III, and w processing intermediate of obs precursor. J. of Biochemistry. 108, N 2, 261 - 266. 
(71) Имя заявителя: Сейкагаку Когио Кабусики Кайся (JP) 
(72) Имя изобретателя: Нобутака Фудзии[JP]; Наоки Ямамото[JP]; Акиеси Матсумото[JP]; Митинори Ваки[JP] 
(73) Имя патентообладателя: Сейкагаку Когио Кабусики Кайся (JP) 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: JP 92/00580 (01.05.92) 

(54) ПОЛИПЕПТИДЫ ИЛИ ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ 

Назначение: в медицине в качестве антибактериального и противовирусного агента (например, анти-ВИЧ агент). Сущность изобретения: полипептиды формулы 1: A1-Tгр-Cys-Tyr-A2-Cys-A3-A2-Gly- A3-Cys-Tyr-A2-A2-Cys-A1-NH2 или их соли, где A1=Аргинин, аргиниларгинин; A2=аргинин, лизин; A3=тирозин, фенилаланин, причем остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 4 и 12 могут быть связаны через дисульфидный мостик; фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента эффективного количества от 10 до 5000 мг/кг веса человеческого тела в день полипептида 1, в котором остатки цистеина в положениях 3 и 16, и 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик. 3 с.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к полипептидам или их солям, обладающим сильным средством к липополисахаридам, в частности эндотоксинам.

Такой полипептид можно использовать в фармацевтической композиции в качестве антибактериального или противовирусного агента (например, анти-ВИЧ агента).

2. Предпосылки изобретения

Два семейства противомикробных полипептидов были выделены из камчатского краба (см. например, Shigenaga 1990, j. Biol.chem т. 265, стр. 21350-21354; Kawara и др. 1990, j.Biol.chem, т. 108, стр. 261-266; Открытая патентная публикация N 167230/1990; Открытая патентная публикация N 152987/1990; Открытая патентная публикация N 53799/1990; Опубликованная исследовательская заявка 500194/1990; Miyatfa и др. 1989, j.Biol.chem 106, стр. 663-668; Akaji и др. 1989, chem.Pharm. Bull т. 37, стр. 2661-2664; Taisha (Метаболизм), т. 26, стр. 301-311 (1989); Shieh и др. 1989, FEBS Lett. т. 252, стр. 121-124; и Nakamura и др. 1988, j.Biol. chem. т. 263, стр. 16709-16713). Одно семейство, семейство тачиплезина, было выделено из японского краба Tachypleus. Три тачиплизина I, II и III были идентифицированы, их аминокислотные последовательности приведены на чертеже. Кроме того, производное пептида тачиплезина с карбоксилконцевым продолжением гликолализина было обнаружено в Южно-азиатских видах краба, Carcinoscorpius of undicanda (Muta и др. 1990, j. Biochem. т. 108, с. 261-266). Второе семейство, семейство полуфемузина, было выделено из гемоцитов Американского краба, Limulus polyphemus. Два полифемузина I и II были идентифицированы. Их аминокислотные последовательности приведены также на чертеже. Полипептиды обоих семейств состоят из 17 или 18 аминокислотных остатков и имеют четыре сохраняемые общие области и два дисульфидных мостика (см. чертеж). Было установлено, что как тачиплезины, так и полифемузины ингибируют как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии при низких концентрациях, а также грибы такие, как Candide albicaus и образуют комплексы с бактериальными липополисахаридами (Shigenaga и др. 1990, j. Biol.chem, т. 265, с. 21350-21354, и Muta и др. 1990, j. Biochem. т. 108, с. 261-266).

Кроме того, как было установлено, полипептиды в семействе тачиплезина обладают некоторой активностью по ингибированию вируса такого, как вирус гриппа, вирус везикулярного стоматита (marakaui и др. 1991, chemotherapy, т. 37, с. 327-334) или вирус иммунодефицита человека (Morimoto и др. 1991, chemotherapy, т. 37, с. 206-211).

3. Краткое описание изобретения

Изобретение относится к новым полипептидам, которые получают из камчатских крабов и которые обладают некоторой гомологичностью с полипептидами высокого сродства относительно эндотоксина, в частности, тачиплезинами и полифемузинами, но обладают также существенным отличием. В полипептидах камчатских крабов аминокислота в 6-позиции тачиплезинов или в 7-позиции полифемузинов является валином (Val), нейтральными алифатическими аминокислотами. В полипептидах, являющихся предметом изобретения, аминокислотный остаток в 6-позиции является лизином (Lys) или аргинином (Arg); эти основные аминокислотные остатки существенно отличаются по свойствам от валинового остатка. Кроме того, аминокислотный остаток в 11-позиции в полипептидах, являющихся предметом изобретения, является тирозином (Tyr), фенилаланином (Phe) или триптофаном (Trp), ароматическим аминокислотным остатком, обладающим отличными свойствами от изолейцина (Ile) в 11-позиции тачиплезинов.

Новые полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут быть использованы в качестве анти-ВИЧ агентов. Как будет подробно описано в разделе 6, см. ниже, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, обладают анти-ВИЧ активностью, которая значительно выше по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством эндотоксина камчатских крабов.

3.1 Определения

Пептидные последовательности, определяемые здесь, представляются сокращениями из трех букв для аминокислотных остатков следующим образом:

Ala (аланин); Arg (аргинин); Cys (цистеин); Gly (гликокол); Ile (изолейцин); Leu (лейцин); Phe (фенилаланин); Trp (триптофан); Tyr (титрозин) и Val (валин).

Приводимые термины в настоящем патентном описании имеют следующий смысл:

HIY (ВИЧ) вирус иммунодефицита человека (все варианты)

MOI множественность инфекции

S] индекс селективности (отношение CC50 к EC50).

4. Краткое описание чертежей.

На чертеже приведены аминокислотные последовательности Тачиплезина I, Тачиплезина II, Тачиплезина III, Полифемизина и Полифемизина II. Сохраняемые аминокислоты помещены в квадраты. Дисульфидные связи между Cys 3 или -4 и Cys -16 или -17, и Cys -7 или -8 и -12 отмечены жирными линиями.

5. Подробное описание изобретения

Изобретение относится к новому полипептиду, представляемому следующей формулой (I):

или его солям, в которой

A1 независимый аминокислотный или пиптидный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и аргинилагринина;

A2 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина или лизина;

A3 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4=NH2.

В специальном варианте осуществления изобретения цистеиновые остатки в 3- и 16-позициях и/или цистеиновые остатки в 7- и 12-позициях могут быть связаны через дисульфидную связь (-S-S-). А также к фармацевтической композиции для ингибирования ВИЧ-активности у пациента, включающей активный ингредиент и по крайней мере один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, содержащей в качестве активного ингредиента эффективное количество от 10 до 5000 мг/кг веса человеческого тела в день полипептида формулы I, где

A1=Аргинин или аргиниларгинин

A2=аргинин или лизин

A3=тирозин или фенилаланин

A4=NH2,

при этом остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик.

Подобно полипептидам с высоким сродством относительно эндотоксина, выделенным из камчатских крабов, известным в этой области техники, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, обладают антипараллельной бета-листовой структурой из-за существования внутримолекулярных водородных связей и четырех цистеиновых остатков в 3-, 7-, 12-и 16-позициях. Поворачивающаяся позиция с возможно структурой бета-поворота расположена в 9- и 10-позициях. Пептидная часть 3-позиции к 8-позиции и пептидная часть 11-позиции к 16-позиции расположены против друг друга.

Однако в контрасте с известными полипептидами, выделенными из камчатских крабов, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, являются более основными. В частности, аминокислотный остаток в 6-позиции является аргининовым (Arg) или лизиновым (Lys) остатком. Аминокислотный остаток в 6-позиции в полипептидах, выделенных из камчатских крабов, является валиновым остатком.

Благодаря своей основной природе, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут образовать соли при помощи присоединения кислоты. Например, полипептид образует соль с неорганической кислотой (хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой и т. п.) или с органической карбоновой кислотой, уксусной кислотой, галоуксусной кислотой такой, как трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, винная кислота, салициловая кислота и мочевая кислота такая, как глюкуроновая кислота или хиалуроновая кислота и т.п. (или органической (моно) сульфокислотой (метан/моно/сульфокислотой, пара-тулоол/моно/сульфокислотой и т.п.), включая сложный эфир сахара (моно/сульфокислоты такой, как сульфаты чондроитина).

5.1. Получение полипептидов

Новый полипептид изобретения может быть получен при помощи известных приемов, например, приемов синтеза в твердой фазе, описанных в книге: "Solid-Plase Peptide Sepethesis" Stew-art u Joung, Pierce chemical Company, Rochford, Illinois (1984).

Полипептид с линейной цепью, являющийся предметом изобретения, имеющий приведенную формулу (I), может быть получен при помощи установления связи карбоксильной группы N-защищенного аргинина в 17-позиции с нерастворимой смолой, имеющей амино-группы, непосредственно присоединенное или альтернативно присоединенное через "промежуток", имеющую функциональную группу, способную связываться с карбоксильной группой (например, группой, способной превратить карбоксильную группу аргинина в паракарбоксиметилбензиловый сложный эфир). Аминовая группа нерастворимой смолы, содержащей аргининовый (Arg) остаток в 17-позиции, после деблокирования -амино (NH2)-защищающей группы способна последовательно связываться при осуществлении процедуры в твердой фазе через соответствующие защищенные аминокислоты в 16-позиции с 1-позицией аминокислотной последовательности, представленной следующей формулой 1:



в которой A1, A2, A3, A4, Cys и Giy уже были определены выше), далее осуществляют исключение (удаление) нерастворимой смолы и защищающих групп аминокислот. В этом случае карбоксильные окончания аминокислотного остатка в 17-позиции могут быть либо свободными (A4 соответствует OH), либо превращены в аминокислоты (A4 соответствует - Nh2). Два цистеина в 3- и 16-позициях и 7- и 12-позициях могут образовывать дисульфидную связь (-S-S-) через меркапто группы при окислении воздухом или дисульфидная связь может быть образована по способу Атертона и др. (Atherton, E. и др. J.chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1985, стр. 2065), а именно через стадии селективной защиты меркапто групп одной из пар цистеинов в 3- и 16-позициях и 7- и 12-позиций защищающей группой, t-Bus (т-бутилтио), или меркапто групп другой пары цистеинов защищающей группой, Acm (ацетамидометил); затем осуществляют удаление t-Bus, частично окисляя меркапто группы; а затем удаляют Acm-защищающую группу, используя приемы, известные в этой области техники.

Любая нерастворимая смола, содержащая аминогруппу, может быть использована для синтеза нового полипептида, являющегося предметом изобретения, если только она может связываться через свои аминогруппы с карбоксильной группой N-защищенного аргинина или лизина на C-окончании, или, в некоторых случаях, с карбоксильной группой "распорки", соединенной с ней, а затем ее можно удалить (исключить). Примеры таких нерастворимых смол включают (но ими не исчерпывается весь список) амино-метиловые смолы (аминометилированный стирол-дивинилбензол, сополимеры), бензгидриламиновые смолы, метилбензгидриламиновые смолы и аминометилфеноксиметиловые смолы и их производные. Когда используют бензгидриламиновую смолу, метилбензгидриламиновую смолу, диметоксибензгидриламиновую (ДМБГА) смолу или аминометилфеноксиметиловую смолу, амид получают непосредственно при помощи расщепления, но амино-метиловая смола предпочтительна с точки зрения выхода.

Соответствующие аминокислоты, используемые в твердой фазе синтетического метода, могут находиться в L- или D-формах. Защищенной аминокислотой является аминокислота, чьи функциональные группы могут быть защищены защитной группой, используя приемы, известные в этой области техники, или различные защищенные аминокислоты, могут быть получены от фирм-производителей. Любому специалисту в этой области техники известно, что полипептидные синтетические методы требуют использования защищенной группы, чтобы стабилизировать неустойчивую боковую цепь аминокислоты, чтобы предохранить боковую цепь от химического изменения в процессе синтеза. Защищающую группу для -аминогруппы аминокислоты выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Boc(т-бутилоксикарбонил) или Fmoc(9-флюоренилметилоксикарбонил). Защищающую группу для гуанидино группы аргинина (Arg) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Tos (толилсульфонил), NO2 (нитро), Mtr (4-метокси-2,3,6-триметилбензол-сульфонил) или Imc (2,3,5,7,8-пентаметилхроман-5-сульфонил). Защищающая группы для меркапто группы цистеина (Cys) может быть выбрана из группы, включающей (но ими не исчерпывается весь список), Bzl (бензил), MBzl (4-метоксибензил), 4-MeBzl (4-метилбензил), Acm (ацетамидометил), Trt (тритил), Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил), t-Bu (т-бутил) или t-Bus (т-бутилтио) и MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm и Npys используют в предпочтительном варианте. Защищающие группы для гидроксильной группы тирозина (Tyr) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список) Bzl, Cl2Bzl (2,6-хлорбензил) или t-Bu. Защищающую группу для e -амино группы лизина (Lys) выбирают из группы, включающей (но ими не исчерпывается полный список (z) бензилоксикарбонил), Clz (2-хлор-бензилоксикарбонил), Boc или Npys.

Сцепление защищенных аминокислот может быть осуществлено в соответствии с различными приемами конденсации, известными в этой области техники, такими, как, например, метод ДЦК (дициклогексилкарбодимида), метод ДИПКДИ (диизопропилкарбодиимида Tartar, А. и др. 1979, J.Org. chem. т. 44, стр. 5000), метод активного сложного эфира, метод смешанных или симметричных ангидридов кислот, метод карбонилдиимидазола, метод ДЦК-НОВ t (1-оксибензотриазола) (konig W. и др. 1970, Chem. Ber т. 103, с. 788, 2024-2034) или метод дифенилфосфорил азида, но в предпочтительном варианте используют ДЦК-метод, ДЦК-НОВ t-метод, ДИПКДИ-НОВ t-метод или метод симметричного ангидрида кислоты. Реакцию конденсации можно осуществить в органическом растворителе таком, как дихлорметан или диметил формамид, или их смеси. Деблокирующий реагент такой, как трифторуксусная кислота (дихлорметан, HCl) диоксан, пиперидин/диметилформамид (ДМФ используют для того, чтобы деблокировать защищающую группу для -аминогруппы. Степень развития реакции конденсации на каждой стадии синтеза определяют при помощи процедуры E.Kaiser и др. [Anal. Biochem. т. 34, с. 595 (1970)] (метод реакции нингидирина).

Когда производное аминометиловой смолы используют в качестве нерастворимой смолы, защищенный полипептид удаляют из смолы, например, при помощи обработки защищенной пептидной смолы аммиаком в соответствующем растворителе. Полученный в результате защищенный пептид затем обрабатывают фтористым водородом, чтобы получить амид полипептида, представленный приведенной выше формулой, и освобождают от всех защищающих групп. Когда бензгидриламиновую смолу, метилбензигидриламиновую смолу, аминометилфеноксиметиловую смолу или ДМВНА-смолу (Funa-Koshi. S. и др. J.Chem. Soc. chem. Commun, 1988, 382) используют в качестве нерастворимой смолы, полипептид может быть удален из смолы и защищающие группы могут быть удалены одновременно из полипептида при помощи обработки защищенной пептидной смолы фтористым водородом, МФМСК (трифторметан) моно/сульфокислотой) (опубликовано издательством Academie Press под редакцией E. Gross Jajima H. и др. "The Peptides", том 5, с. 65 (1983)), ТМСОТФ (триметилсилил трифталатом) (Fuji. N. и др. J.Chem. Soc. Chem. Commun. т. 1987, 274) или ТМСБР (триметилсилил бромидом (Fujii. N. и др. Chem. Pharm. Bull. т. 35, с. 3880 (1987) и т.п.)

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полученный в результате полипептид восстанавливают 2-меркаптоэтанолом, ДТТ (дитиотрейтолом) и т. п. чтобы гарантировать, что меркапто группы цистеинов находятся в восстановленном виде. Меркапто группы могут быть затем окислены для того, чтобы получить циклический полипептид. Обработку с целью окисления можно осуществить при помощи известных приемов. В общем случае, используют такой окисляющий агент, как воздух или феррицианат (например, феррицианид калия).

В качестве альтернативы полипептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть получены с использованием техники рекомбинантной ДНК. В соответствии с ней, нуклеотидные кодирующие последовательности для полипептидов могут быть клонированы и экспрессированы с использованием приемов, хорошо известных в этой области техники (см. например, Maniatis и др. Molecular cloniny, a Laboratory manual, Cold spoig Harbor Laboratory, Cold Spoig Harbor, N.y. 1991).

Полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут быть выделены и очищены при помощи средств, хорошо известных в области полипептидов, например, при помощи экстрагирования, рекристаллизации, различных методов хромотографии (гель-проникающей, ионообменной, распределительной, адсорбционной, обращенно-фазовой), электрофореза, распределения при противотоке и т.д. а обращенно-фазовая, высокоэффективная жидкостная хроматография является наиболее эффективной.

5.2. Использование полипептидов

Полипептиды настоящего изобретения, представленные формулой (1), обладают способностью связываться с эндотоксинами, антибактериальной активностью и активностью относительно гемолитизирования чувствительных к эндоксину гемоцитов. Кроме того, полипептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, обладают противовирусной активностью. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептиды по изобретению обладают анти-ВИЧ активностью. Как будет подробно описано в Разделе 6, см. ниже, полипептиды, являющиеся предметом изобретения, проявляют существенно более высокую анти-ВИЧ активность по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством относительно эндотоксина (например, Тачиплезины I, II или III, или Полифемизины I или II).

Полипептиды, являющиеся предметом изобретения, таким образом, могут быть использованы в фармацевтических композициях, содержащих полипептиды по изобретению или их соли и приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель, выбранный в соответствии со способом применения и формой применения фармацевтической композиции. Фармацевтическими носителями могут быть такие физиологически совместимые буферы, как раствор Хенка или Рингера, физиологический соляной раствор, смесь, состоящая из соляного раствора и глюкозы, и обработанный гепарином раствор цитрата натрия-лимонной кислоты-дексторозы. Эту фармацевтическую композицию применяют стоматически или перентерально в соответствии с объектом обработки, и ее можно приготовить в такой форме, как порошок, гранулы, раствор для инъекции или стоматического применения, таблетки, суппозитории, пессарии, мази, кремы или аэрозоль, используя соответствующие носители в соответствии со способом применения.

Когда фармацевтическую композицию применяют непосредственно в форме инъекций к пациенту, полипептид или его соль, являющиеся предметом изобретения, могут быть применены непрерывно или через некоторые промежутки времени в количестве от 10 до 5000 мг на кг массы человеческого тела в день, и при помощи внутривенной капельницы в форме раствора в физиологическом соляном растворе.

6. Примеры.

В примерах, приводимых ниже, описан синтез полипептида (I). Кроме того, описаны результаты анализов на анти-ВИЧ активность полипептидов, являющихся предметом настоящего изобретения, и известных полипептидов с высоким сродством к эндотоксину. Полипептиды по изобретению обладают существенно более высокой анти-ВИЧ активностью по сравнению с известными полипептидами с высоким сродством к эндотоксину.

В приводимых ниже примерах используют следующие аппараты и реагенты:

Аппарат для ВЭЖХ: фирмы Waters Co. США, Модели 600.

Колонна для этого аппарата: типа Asahipar ОДР-90 (фирмы Asahi Chemical Industry Co. Ltd).

Аминокислота Fmoc: производится фирмой Kokusan Kagaku Co.

Амино смола и конденсирующий агент: производятся фирмой Peptide Ken kyusho Co.Ltd

FAB-MS (FAB-масс-спектрограф): фирмы VC Co, США, модели ZAB-SE.

6.1. Пример 1: Синтез полипептида (I). Синтез полипептида (I), который имеет формулу, приведенную ниже, описан в Разделах 7.1.1-6.1.7, см. ниже. Полипептиды (2-33) (см. табл. 1 выше по поводу структур) синтезировали с использованием аналогичных процедур.



Cys-остатки в 3- и 16-позициях, и в 7- и 12-позициях связаны, соответственно, через дисульфидную связь.

6.1.1. Введение в аминометиловую смолу соединения Fmoc ДМВНА-CH2CH2COOH [(3-) -Fmoc-амино-4-метоксибензил)-4-метоксифенил)пропионовая кислота]

270 мг (0,2 ммолей) аминометиловой смолы (0,74 мэкв/г) и 268,5 мг (0,5 ммолей, 2,5 экв) Fmoc-ДМВНА-CH2CH2COOH (ММ 537) помещали в колонну синтеза в твердой фазе и реакцию конденсации осуществляли в течение 2 ч при помощи процедуры ДИПКДИ-НОВ в ДМФ в соответствии с процедурой, предложенной guo L. и др. [Chem. Pharm. Bull. т. 36, с. 4989, 1988).

После завершения реакции связывание осуществляли с целью защиты свободных амино-групп, используя уксусный ангидрид (ДМВНА-смолу).

6.1.2. Введение аргинина в 17-позицию в ДМВНА-смолу.

После удаления Fmoc-групп из ДМВНА-смолы, полученной в разделе 6.1.1. см. выше. 20: пиперидином (ДМФ, добавляли 2,5 эквивалента (экв) Fmoc Arg (Mtr)-OH, в пересчете на ДМВНА-смолу, и реакцию конденсации осуществляли в ДМФ в соответствии с ДИПКДИ-НОВt-процедурой.

Степень развития реакции конденсации контролировали при помощи измерения в соответствии с тестом на нингидрин, предложенным в Kaiser e и др. [Anal. Biochem, т. 34, с. 595, (1970)]

6.1.3. Введение цистеина в 16-позицию.

После удаления Fmoc-групп из ДМВНА-смолы при помощи 20% пиперидина (ДМФ, добавляли 2,5 экв Fmoc-Cys (MBzl)-JH, на базе ДМВНА-смолы, и реакцию конденсации осуществляли в ДМФ при помощи ДИПКДИ-НОВt-процедуры. Степень развития реакции конденсации контролировали по аналогии с 6.1.2. см. выше, при помощи измерения в соответствии с испытанием на нингидрин.

6.1.4. введение аминокислот от 15- до 1 позиции.

По аналогии с приведенным описанием, Lys (Boc), Arg (Mtr), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Tyr [t-Bu] GIy, Lys (Boc), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Lys (Boc), Arg (Mzl), Tyr (t-Bu), Cys (MBzl), Trp, Arg (Mtr) и Arg (Mtr) последовательно вводили в ДМВНА-смолу, чтобы получить смолу защищающая группа защищенный полипептид (I).

Реакцию конденсации каждой аминокислоты при синтезе в твердой фазе осуществляли в соответствии с условиями функционирования из табл. 2

6.1.5. Получение полипептида (I) при помощи удаления защищающих групп, удаления полипептида (I) из смолы и частичная очистка.

Защищенную полипептидную (I) смолу подвергали обработке 20% пиперидином (ДМФ, чтобы удалить группу Fmoc, а затем подвергали реакции при температуре 25oC в течение 2 ч в системе 1 М ТМСОТФ-тиоанизол (ТФК) трифторуксусная кислота) (10 мл трифторуксусной кислоты в присутствии м-крезола (100 экв) и) тандитиола (300 экв) на 100 мг смолы. Смолу отделяли фильтрацией из реакционной смеси и дважды промывали 1 мл трифторуксусной кислоты. В смесь фильтрата и промывочной жидкости добавляли последовательно 100 мл охлажденного льдом сухого простого эфира. Образовавшийся осадок центрифугировали и остаток отделяли от верхнего слоя декантированием. Полученный в результате остаток промывали холодным простым эфиром, растворяли в 10 мл 4н. раствора AcOH, добавляли 830 мг, 80 экв дитиотрейтола и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи.

Реакционный раствор центрифугировали, верхний слой обрабатывали Сефадексом Г-10 (sephadex G-10, 3,7х5 см), подвергали гель-проникающей фильтрации с 4н. раствором уксусной кислоты (AcOH), а вытекающий поток собирали в виде основной части элюата и подвергали лиофилизации, чтобы получить порошок частично очищенного нециклизованного полипептида (I).

6.1.6. Получение полипептида (I) окислением воздухом.

У половины вытекшей фракции pH обеспечивали на уровне 7,5 при помощи концентрированного водного раствора аммиака, и ее подвергали окислению воздухом при помощи аэрации, чтобы осуществить реакцию циклизации. После завершения окисления воздухом циклизованный полипептид (I) адсорбировали на 10 г смолы HP-20, а затем элюировали 60% CH3CN (в 1н. растворе AcOH). Элюат концентрировали при комнатной температуре при пониженном давлении, чтобы удалить CH3CN, а затем подвергали лиофилизации, чтобы получить порошок. Порошок растворяли в небольшом количестве воды и раствор сливали на Asahipak и подвергали очистке при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ Модель 600, производимая фирмой Waters Co), используя градиентное элюирование при помощи CH3CN, чтобы получить полипептид (I) с единственным пиком с выходом 27% (величина, рассчитанная на основе смолы защищающая группа защищенный полипептид (I).

6.1.7. Анализ полипептида.

Ценность аминокислотной композиции определяли при помощи переваривания леукции аминопептидазой полипептида, очищенного, как это делали в Разделе 6.1.6, см. выше, при этом получали, что оно согласуется с рассчитанным значением для композиции, основанной для аминокислотной последовательности формулы (1).

Специфическое вращение []2D0 полученного полипептида составляло +8,4o (C=0,1,1н. раствор уксусной кислоты).

6.2. Пример 2: Противовирусная активность против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Противовирусная активность относительно ВИЧ полипептида (I), синтезированного в примере 1, а также полипептидов (2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) и (26) испытывали и оценивали в соответствии со следующей процедурой.

ВИЧ-инфицированные клетки МТ-4 (2,5104 клеток) углубление, множественность инфекции (MOI):0,001) сразу же после инфицирования добавляли вместе с испытываемым материалом с различными изменениями концентрации в микротитрованный планшет с 96 углублениями. После инкубирования при температуре 37oC в течение 5 дней в CO2-инкубаторе измеряли число живых клеток при помощи МТТ-метода (Pouwels и др. J. Virol. methods т. 20, с. 309-321 (1988). Противовирусная активность выражается в виде концентрации, при которой гибель клеток, вызванная ВИЧ-инфекцией, ингибирована на 50% (EC50:50% эффективная концентрация). С другой стороны, для того, чтобы определить цитотоксичность испытываемого материала на МТ-4-клетках, инкубировали не инфицированные вирусом клетки так же, как это описано выше, вместе с испытываемым соединением при различных изменениях концентрации. Цитотоксичность выражается в виде 50% цитотоксичной концентрации (TC50), свойственной испытуемому материалу. Кроме того, грубое отношение CC50 к EC50/CC50/EC50 выражается как эффективное отношение (SI=показатель селективности).

В табл. 3 приведены значения EC50, CC50 и SI для полипептидов (1), (2), (3), (4), (7), (12), (13), (14), (20), (21) и (26) и известных полипептидов, имеющих высокое сродство с эндотоксинами, в частности, Тачиплезинов I и II и Полифемузинов I и II, и известного Анти-ВИЧ-агента A T.

В табл. 4 приведены физические свойства полипептидов (1), (3), (13), (20) и (21).

Примеры составления фармацевтических композиций.

Пример 1. Капсула для орального применения

полипептид (гидрохлорид примера 1, табл. 3) данного изобретения (активный ингредиент) 100 мг

Зерновой крахмал (разбавители и связующие) 200 мг

Стеарат магния (смазочные материалы) 20 мг

Макрокристаллическая целлюлоза (растворители) 680 мг

1000 мг

Перечисленные компоненты смешивают до однородной массы и заполняют твердые желатиновые капсулы, 200 мг смеси в каждой капсуле.

Пример 2. Композиция для инъекции.

Полипептид (13, табл. 3) данного изобретения 10 мг

Сульфат хондроитин натрия 10 мг

Указанные компоненты растворяют в 2 мл 5%-ного водного раствора маннитола (для внутривенного вливания) и этот получившийся раствор стерильно фильтруют.

Затем фильтрат растворяют в 200 мл 5%-ного водного раствора маннитола (для внутривенного вливания) и получившийся раствор используют для внутривенного капельного вливания.

Результаты, приведенные в табл. 3, указывают на то, что полипептиды, синтезированные в примере 1, обладают существенно более высокой анти-ВИЧ активностью, которую определяли эффективной концентрацией. Соединения (1), (3), (12), (13), (14) и (26), в частности, были особенно селективными при подавлении (уничтожении) ВИЧ-инфицированных клеток. Показатель селективности соединений (1), (3), (12), (13), (14) и (26) был по крайней мере в 7 раз выше по сравнению с любым известным соединением с высоким сродством к эндотоксину. ж 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Полипептиды общей формулы I A1 Тгр Cys Tyг A2 - A2 Cys A3 A2 Gly A3 Cys Tуг A2 A2 Cys A1 A4,

где A1 независимая аминокислота или пептидный остаток, выбранные из группы, состоящей из аргинина и аргиниларгинина;

A2 независимый аминокислотный отстаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и лизина;

A3 независимый аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4 NH2,

или их соли.

2. Полипептиды общей формулы A1 Тгр Cys Туг A2 - A2 Cys A3 A2 Gly A3 Cys Tуг A2 A2 Cys A1 A4,

где A1 независимый аминокислотный или пептидный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и аргиниларгинина;

A2 независимый аминокислотный отстаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина и лизина;

A3 аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из тирозина и фенилаланина;

A4 NH2,

при этом остатки цистеина в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связаны через дисульфидный мостик,

или их соли.

3. Фармацевтическая композиция для ингибирования ВИЧ-активности у пациента, включающая активный ингредиент и по крайней мере один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит эффективное количество 10 5000 мг/кг массы человеческого тела в день полипептида по п.2.