МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСЫ ПОРФИРИН-КЕТОНОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ЖИДКОЙ ИЛИ ГАЗОВОЙ СРЕДЕ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА

МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСЫ ПОРФИРИН-КЕТОНОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ЖИДКОЙ ИЛИ ГАЗОВОЙ СРЕДЕ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА


RU (11) 2064948 (13) C1

(51) 6 C09B47/00, C07D487/22, G01N33/52, G01N21/64, G01N21/76 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1996.08.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 5055439/04 
(22) Дата подачи заявки: 1992.07.20 
(45) Опубликовано: 1996.08.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. OS Wolfteis biomedical applications of fitre=optic chemical sensors. International I. Optoelectronics, 1991, 6, p.425 - 441. 2. Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors. O.S. Wolfteis (ed), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991, 1, 2. 3. W.Frettnar, O.S.Wolfteis. Filre- optic cholesterol fiosensor with an ohygen optrode as a transducer. Anal. Biochem., 1990, 184, p.124 - 127. 4. M.C.Moreno-Bondi, O.C.Wolfbeis, M.I.P.Leiner, B.P.H.Schaffar. Oxygen optrode for use in a fitre=optic glucose biosensor. Anal. Chem. 1990, 62, p.2377 - 2380. 5. Патент США N 4.810.655, 1989, кл.436 - 138, опубл. 1989. 6. DEastwood, M Gouterman, Porphyrins. xvii. Luminescence of Co., Ni, Pd, Pt-Complexes. I.Mol.Spectrosc., 1970, 35, p.359 - 357. 7. Siemens Optoelectronics Data Book. Siemens AG, Bereich Halbleiter, 1990. 8. D.Dolphin. The Porphyrins Academic Press, Nero=Work, 1979, 1 - 4. 
(71) Имя заявителя: Папковский Дмитрий Борисович 
(72) Имя изобретателя: Папковский Д.Б.; Пономарев Г.В.; Курочкин И.Н.; Чернов С.Ф. 
(73) Имя патентообладателя: Папковский Дмитрий Борисович 

(54) МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСЫ ПОРФИРИН-КЕТОНОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ЖИДКОЙ ИЛИ ГАЗОВОЙ СРЕДЕ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА 

Использование: в аналитической химии, ветеринарии, медицине, биотехнологии и пищевой промышленности при оптическом определении кислорода. Сущность изобретения: платиновые и палладиевые комплексы новых замещенных порфирин-кетонов. Чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде в виде сформованного из полистирола изделия с распределенными в нем платиновыми или палладиевыми комплексами новых замещенных порфирин-кетонов в качестве фосфоресцирующего красителя. Чувствительный элемент выполнен в виде пленки толщиной 1-20 мк. Пленка может быть закреплена на твердой подложке или оптическом элементе. Сформованное изделие может содержать слой кислород-зависимого фермента. Способ определения кислорода посредством такого чувствительного элемента, находящегося в контакте с анализируемым образцом и связанного посредством оптического волокна с детектором фосфоресценции с оптимальной чувствительностью 700-850 нм. Фосфоресценцию чувствительного элемента возбуждают светодиодом в области поглощения красителя и регистрируют ее в импульсном режиме с временным разрешением с переменным временем задержки при возбуждении светодиодом с оптимальной величиной эмиссии в диапазоне 570-630 нм. Концентрацию кислорода рассчитывают по величине интенсивности и/или времени жизни фосфоресценции исходя из одноэкспоненциального характера затухания фосфоресценции. Платиновые и палладиевые комплексы новых замещенных порфирин-кетонов имеют квантовые выходы и времена жизни фосфоресценции, близкие к порфириновым комплексам, и интенсивную полосу поглощения в области 560-620 нм. Величина сдвига видимой полосы поглощения составляет 50-60 нм по сравнению с металлопорфирином. Фосфоресценция смещается в длинноволновую область примерно на 100 нм. Это позволяет упростить процесс оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде и повысить точность определения.10 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области аналитической химии и техники и может быть использовано в медицинской диагностике, клинической медицине, в биотехнологии, пищевой промышленности, ветеринарии, экологических исследованиях.

В тех случаях, когда стоит задача определения или непрерывного мониторинга биологически активных соединений, наиболее эффективным является использование устройств-биосенсоров.

Молекулярный кислород является одним из важнейших объектов анализа и в то же время субстратом множества ферментативных реакций. Он, как известно, является также эффективным тушителем люминесценции красителей. Эффективность тушения люминесценции кислородом определяется длительностью (или временем жизни) люминесценции, природой красителя и среды, в которой регистрируется тушение. При удачном подборе люминесцирующего красителя, матрицы для него и соответствующих элементов оптоэлектроники возможно создание эффективных оптических кислородных сенсоров, способных осуществлять точное количественное определение кислорода. Соответствующий прибор может быть реализован с использованием компактного, простого и дешевого (волоконно) оптического оборудования [1]

Оптическая детекция кислорода может вестись путем измерения интенсивности люминесценции либо времени жизни люминесценции красителя. Последний подход является более предпочтительный, поскольку он не зависит от концентрации красителя, ее изменении во времени и флуктуаций рабочих характеристик компонентов оптической детектирующей системы [2]

В настоящее время в литературе описан ряд подходов к созданию оптических кислородных сенсоров и ферментных биосенсоров на их основе. В качестве активного кислород-чувствительного элемента в них обычно используются полимерные композиции на основе люминесцирующих красителей, которые проницаемы для молекулярного кислорода, растворенного в анализируемой системе. Он выполняется в виде кислородной мембраны, которая наносится или крепится на конце оптического волокна или в рабочей оптической ячейке.

В качестве люминесцирующих кислород-чувствительных элементов предложено использовать полимерные композиции на основе полиароматических красителей (например, пирена или декациклена [3]), а также на основе флуоресцирующих комплексов рутения (Ru(bpy)3, Ru(phen)3 и др.) [4] Однако полиароматические красители требуют ультрафиолетового возбуждения, что сложно реализуется на волоконно-оптическом оборудовании и светодиодах. Кроме того, короткая длительность люминесценции этих красителей усложняет создание сенсоров основанных на принципе измерения времен жизни. Это связано с быстродействием полупроводниковой электроники (свето- и фотодиодов), которая также обычно составляет порядка 1-2 микросекунд. Комплексы рутения, как правило, обладают сложной координационной химией и фотохимией и плохо растворимы в полимерах, обычно используемых для получения кислород-чувствительных композиций. Это приводит к практическим сложностям при создании простых, компактных и дешевых приборов.

Наиболее близким к изобретению являются фосфоресцирующие красители, чувствительные элементы на их основе и способ определения кислорода, описанные в патенте [5] Его основу составляет использование фосфоресцирующих красителей порфириновой природы Pt- и Pd-комплексов порфиринов. Эти красители имеют полосы поглощения в видимой области спектра и обладают интенсивной фосфоресценцией [6] Показана их эффективность для люминесцентной детекции кислорода.

Однако при создании кислородных сенсоров и биосенсоров на основе этих соединений возникают следующие проблемы. Во-первых, платиновые комплексы порфиринов, которые наиболее удобны для детекции кислорода в физиологическом диапазоне концентраций О-20% в воздухе или 10-250 мМ в воде), плохо совместимы с имеющейся полупроводниковой оптоэлектроникой, главным образом с источниками света. Зеленые и темно-зеленые светодиоды (на основе GaP, с узким спектром испускания и максимумом при 557 и 567 нм, соответственно) оказываются малоэффективными для возбуждения люминесценции Pt-порфиринов (они имеют узкую полосу поглощения с максимумом при 535 нм). В то же время синие светодиоды (на основе SiC с широким спектром испускания и максимумом в области 480 нм) имеют существенно более низкий энергетический выход по сравнению с светодиодами видимого спектра [7] К тому же интеграл перекрывания их эмиссии и поглощения Pt-порфиринов невелик.

Палладиевые комплексы порфиринов имеют более удобные спектральные характеристики и могут возбуждаться зелеными светодиодами. Однако в обычных условиях (насыщение воздухом) их люминесценция в сотни раз потушена кислородом из-за чересчур большого времени жизни, которое составляет порядка 1 миллисекунды. Это делает их малопригодными для измерения кислорода в физиологическом диапазоне концентраций.

При использовании полимерных люминесцирующих композиций на основе металлопорфиринов для оптической детекции кислорода также возникает ряд сложностей. К ним относится, в частности, то, что кинетика люминесценции описанных в патенте [5] полимерных композиций на основе металлопорфиринов (полихлорвинил, полиметилметакрилат с пластификаторами в качестве матриц) имеет многоэкспоненциальный характер. Это существенно затрудняет калибровку, обработку экспериментальных данных и определение концентрации кислорода по люминесценции и может влиять на точность измерений. Невысокая фотохимическая стабильность порфириновых соединений также ограничивает их применение в оптических сенсорах.

В настоящее время не описано создание и использование оптоволоконных устройств для детекции кислорода на базе полупроводниковой электроники и фосфоресцирующих порфириновых красителей, а также ферментных биосенсоров.

Задачей настоящего изобретения является синтез новых, фосфоресцирующих красителей, являющихся производными металлокомплексов порфиринов, главным образом Pt(II)- и Pd(II)-комплексов, которые перспективны, в частности, для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах.

Другой целью изобретения является разработка чувствительных элементов на основе этих новых красителей, главным образом полимерных кислород-чувствительных фосфоресцирующих композиций (кислородных мембран и/или покрытий), а также ферментных мембран на основе вышеуказанных кислород-чувствительных композиций и кислород-зависимых ферментов. Названные чувствительные элементы предназначены для оптической детекции кислорода и/или биологически активных соединений (метаболитов) в образцах.

Наконец, целью изобретения является разработка нового способа определения кислорода, который основан на использовании вышеописанных фосфоресцирующих красителей и чувствительных элементов.

Сущность изобретения и реализации поставленных целей заключаются в следующем.

Синтез новых фосфоресцирующих красителей осуществляют путем направленной химической модификации порфиринового макроцикла, которая проводится таким образом, чтобы, затронув в минимальной степени способность соответствующих металлокомплексов, интенсивно фосфоресцировать при комнатной температуре, изменить при этом спектральные характеристики фосфоресценции. Производные порфиринов получаются селективным окислением определенного фрагмента порфиринового макроцикла, которое приводит к изменению вследствие этого электронных спектров и некоторых физических характеристик. Процесс химической модификации заключается в конечном счете в получении новых соединений - порфирин-кетонов (или оксо-хлоринов), из которых затем получают металлокомплексы с Pt2+ и Pd2+. В результате такой модификации удалось синтезировать ранее не описанный класс соединений, которые отличаются структурой, оптическими и физическими свойствами от соответствующих порфириновых соединений, а также родственным им комплексам хлоринов, дигидрохлоринов и т.п. [8]).

Структура комплексов порфирин-кетонов (I), а также родственных им комплексов порфиринов (II) и хлоринов (III) приведена ниже.

Схема синтеза металлокомплексов порфирин кетонов приведена ниже.

Pt- и Pd-комплексы порфирин-кетонов также интенсивно фосфоресцируют при комнатной температуре, квантовые выходы и времена жизни фосфоресценции близки к соответствующим порфириновым комплексам. Они имеют интенсивную полосу поглощения (возбуждения) в области 580-620 нм, которая на 50-60 нм более длинноволновая по сравнению с соответствующими металлопорфиринами. Спектр фосфоресценции также смещен в длинноволновую область более чем на 100 нм. В частности, Pt-комплексы порфирин-кетонов имеют длинноволновый максимум поглощения 591 нм и максимум фосфоресценции при 758 нм. Благодаря таким свойствами они хорошо совместимы с полупроводниковыми источниками видимого света (например, желтыми светодиодами имеющими оптимум эмиссии при 586 нм) и могут быть эффективно использованы для детекции кислорода вместо соответствующих Pt-порфиринов. Полосы поглощения и фосфоресценции палладиевых комплексов порфирин-кетонов сдвинуты соответственно на 10 и 30 нм в красную область по сравнению с платиновыми комплексами и также эффективно возбуждаются желтыми или оранжевыми и красными светодиодами.

Новые соединения, формально будучи частично окисленными производными порфиринов, помимо более удачных спектральных характеристик, выгодно отличаются от известных еще повышенной устойчивостью к фото- и химическому окислению. Соответствующие экспериментальные данные приведены в дополнительных материалах.

Как отмечалось выше, длинноволновый сдвиг электронных спектров полученных соединений достигается путем снижения ароматичности макроциклической структуры металлокомплекса. Аналогичный эффект известен также и для флуоресцирующих хлоринов, бактериохлоринов и их металлокомплексов (M.Gouterman. The Porphyrins/ed. D.Dolphin, 1979, v. 3, pp.1-165). Однако эти структуры, которые формально можно рассматривать как восстановленные порфирины, сильно подвержены фотоокислению и малоперспективны для применения в аналогичных целях. Высокой нестабильностью к фото- и химическому окислению обладают также порфирин-диоды и их металлокомплексы промежуточные соединения синтеза порфирин-кетонов (см.схему синтеза).

Металлокомплексы различных порфирин-кетонов, полученных из соответствующих порфиринов и различающиеся только боковыми заместителями порфиринового ядра в 1-8 положениях, имеют близкие люминесцентные свойства. Все они с незначительными модификациями методик могут использоваться согласно настоящему изобретению.

На основе вышеописанных металлокомплексов-порфирин-кетонов, главным образом гидрофобных произвольных, а также полистирола, разработаны люминесцирующие кислород-чувствительные композиции (пленки). Новые композиции имеют ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными композициями Pd- и Pt-порфиринов. В частности, их люминесценция описывается одноэкспоненциальным законом затухания, что существенно упрощает процедуру измерений и обработку экспериментальных данных при регистрации кислорода по принципу измерения времени жизни люминесценции. Они имеют быстрые и обратимые отклики на изменение концентрации кислорода. Эти полимерные композиции предназначены для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах и ферментных биосенсорах на их основе в качестве кислород-чувствительных элементов (мембран или покрытий). Композиции могут содержать небольшие добавки пластификаторов для улучшения их механических и адгезионных свойств. Мембраны и/или покрытия на основе вышеописанных композиций позволяют точно и количественно определять содержание кислорода на основании измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции.

Ферментные мембраны получают путем сопряжения соответствующих кислород-зависимых ферментов (или ферментных систем) с вышеописанными кислородными мембранами. Например, для фермента глюкозооксидазы (ГО), который катализирует реакцию:



количественную оценку содержания субстрата можно вести опосредованно по уровню потребления кислорода.

Ферментные мембраны готовят путем иммобилизации фермента или ферментной системы, одним из субстратов которой является кислород, непосредственно на вышеописанной кислород-чувствительной полимерной композиции [1,2] Полученные таким образом мембраны чувствительны к соответствующему второму субстрату фермента. При введении субстрата в насыщенный воздухом анализируемый раствор такая мембрана дает люминесцентный отклик (возгорание люминесценции вследствие снятия тушения кислородом), который пропорционален концентрации субстрата. Мембраны с иммобилизованными глюкозооксидазой, лактатоксидазой, этинолоксидазой, холестериноксидазой, уреказой и т.п. могут использоваться в качестве активных элементов в соответствующих устройствах (биосенсорах) вместо вышеописанных кислородных мембран для определения соответственно глюкозы, лактата, этанола, холестерина, мочевой кислоты и др.

Новый способ определения кислорода основан на использовании вышеописанных чувствительных элементов, содержащих новые кислород-чувствительные фосфоресцирующие красители, а также полупроводниковой оптоэлектроники и электронных схем микросекундной временной логики, которые позволяют вести измерение интенсивности и/или времени жизни люминесценции вышеуказанных композиций.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез Pt-октаэтилпорфин-кетона (гидрофобный, водонерастворимый краситель).

а) 100 мг октаэтилпорфина (ОЭП) растворяют в 30 мл хлороформа. Добавляют 200 мг OsO4 и 3 капли пиридина. Выдерживают 24 часа в темноте и затем пропускают через раствор ток сероводорода в течение 10 мин. Осадок сульфида осмия отфильтровывают. Раствор упаривают в вакууме досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 95/5, Собирают основную фракцию цис-диола октаэтилпорфина, упаривают, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 40%

б) 40 мг цис-диола октаэтилпорфина растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты и выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Затем смесь выливают на тонкоизмельченный лед, нейтрализуют водным аммиаком. Осадок отфильтровывают, сушат, растворяют в 5 мл хлороформа и хроматографируют на колонке с силикагелем в хлороформе. Собирают основную фракцию октаэтилпорфин-кетона. Кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 90%

в) 30 мг октаэтилпорфин-кетона растворяют в 3 мл бензонитрила, добавляют 200 мг K2PtCl4 и кипятят в течение 3 часов. Затем смесь упаривают досуха. Остаток кипятят с 50 мл хлороформа 15 минут, полученный раствор упаривают досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/ацетон 95/5. Собирают основную фракцию платинового комплекса октаэтилпорфин-кетон (Pt-ОЭП-кетон). Упаривают, получают 18 мг основного вещества. Выход около 60%

Данные элементного анализа для Pt-октаэтилпорфин-кетона. Найдено, C - 57,99; H 5,90; N 7,50. C36H44N4OPt. Вычислено, C - 58,07; H 5,96; N 7,53.

Пример 2. Получение Pd-октаэтилпорфин-кетона. 30 мг октаэтилкетона (см. пример 1) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют раствор 100 мг PdCl2 в 10 мл диметилформамида. Нагревают при 110oС в течение 30 минут. Охлаждают до 70-80oС, добавляют по каплям 5 мл воды, охлаждают. Выпавший осадок фильтруют, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Получают 27 мг палладиевого комплекса октаэтилпорфин-кетона. Выход около 90%

Данные элементного анализа для Pd октаэтилпорфин-кетон. Найдено, С - 65,89; H 6,69; N 8,50. C36H44>N4OPd. Вычислено, C - 65,99; H 6,77; N 8,55.

Пример 3. Синтез Pt-копропорфирин I-кетона (водорастворимый краситель) и его тетраэтилового эфира.

а) 100 мг тетраэтилового эфира копропорфирина I обрабатывают аналогично примеру 1а), но выдерживают с OsO4 12 часов. Получают цис-диол тетраэтилового эфира копропорфирина I с выходом 30%

б) 30 мг цис-диола растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты при 0oC при перемешивании, выдерживают 15 минут. Раствор выливают на 100 г льда, нейтрализуют аммиаком. Осадок фильтруют, сушат, хроматографируют. Выход около 75% тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона (ТЭЭ КП-кетон).

в) 20 мг ТЭЭ КП-кетона растворяют в 5 мл бензонитрила, добавляют 150 мг K2PtCl6 и кипятят 1 час. Раствор упаривают досуха. Остаток экстрагируют хлороформом. Хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 10/1. Выход платинового комплекса тетраэтилового эфира копропорфирин I-кетона 75%

Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона ТЭЭ. Найдено, C 59,51; H 5,87; N 6,27. C44H52N4Pd. Вычислено, C - 59,56; H 5,91; N 6,31.

г) 15 мг тетраэтилового эфира Pd-копропорфирин I-кетона растворяют в 10 мл диоксана, добавляют 100 мг КОН в 1 мл воды. Нагревают при 70oC в течение 4 часов. Добавляют 50 мл воды, нейтрализуют до рН 5 соляной кислотой. Осадок отфильтровывают, сушат. Выход Pt-копропорфирин I-кетона около 100%

Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона. Найдено, C - 55,71; H 4,63; N 7,20. C36H36N4O9Pd. Вычислено, C 55,78; H 4,68; N 7,23.

Пример 4. Синтезы других комплексов порфирин-кетонов.

Pd комплексы копpопорфирин I-кетона и его тетраэтилового эфира синтезируются исходя из ТЭЭ копропорфирин I-кетона и PdCl2 идентично комплексам октаэтилпорфин-кетону (см.пример 2).

Комплексы этиопорфирин-кетона (R1= R3= R5= R7=CH3, R2=R4=R6=R8=CH2CH3) синтезируются полностью аналогично соответствующим комплексам октаэтилпорфина (см. примеры 1, 2 описания).

Синтез Pd и Pt комплексов копропорфирина III-кетона и их тетраэтиловых эфиров. Копропоpфирин III (R1= R3= R5= R8= CH3, R2=R4R6R7 CH2CH2COOCH2CH3 окисляют OsO4 с последующей инкубацией с серной кислотой и очисткой аналогично примеру 1. При этом ввиду ассиметричной структуры исходного порфирина получается смесь четырех основных изомеров копропорфирин-кетона, которые спектрально неразличимы (т.е. идентичны) используется для получения Pt и Pd комплексов, методика полностью аналогична описанным в примерах 2, 3.

Пример 5. Люминесцентные свойства металлокомплексов порфирин-кетонов. Корректированные спектры возбуждения и некорректированные спектры эмиссии (фосфоресценции) снимали на люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer, Англия) для разбавленных растворов красителей (0,1-1,0 мМ) в соответствующем растворителе (толуол или водный буфер). Спектры Pt-октаэтилпорфина и синтезированного Pt-октаэтилпорфин-кетона приведены на рис.1. Спектры аналогичных Pd-производных приведены на рис.2. Как видно, химическая модификация приводит к значительному длинноволновому смешению в спектрах возбуждения и эмиссии новых красителей.

Спектры возбуждения и эмиссии металлокомплексов различных производных порфирин-кетонов (например Pt-ОЭП-кетон, Pt-капропорфирина I-кетона и тетраэтилового эфира Pt-копропорфирина I-кетона) практически идентичны вышеописанным (рис.1, 2).

Сравнительные свойства комплексов порфирин-кетонов приведены в таблице.

Времена жизни фосфоресценции Pt-октаэтилпорфин-кетона и Pd-октаэтилпорфинкетона в обескислороженных растворах (мицеллярный 1% раствор Тритона Х-100, содержащий 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7,0) при комнатной температуре составляют 60 и 450 микросекунд соответственно (25oС). Для соответствующих металлопорфиринов эти значения составляют порядка 95 и 1100 микросекунд. Для производных различной структуры временные характеристики также оказываются близкими.

Пример 6. Получение и свойства полимерных композиций на основе Рt-порфирин-кетонов.

10 мг Pt-ОЭП-кетона растворяют в 1 мл хлороформа. Полученный раствор смешивают с 10 мл 5% раствора полистирола в толуоле. Полученный раствор полимерной композиции хранят при комнатной температуре в темноте.

Для получения кислород-чувствительных покрытий и мембран раствор полимерной композиции наносят тонким слоем на горизонтальную поверхность оптического элемента (стеклянная пластина, прозрачная полиэфирная пленка или торец оптического волокна) и высушивают на воздухе в течение 1-12 часов. Полученные таким образом элементы с нанесенной пленкой полимерной композиции толщиной 1-20 микрон имеют удовлетворительные механические свойства и могут использоваться для оптической детекции кислорода в водной и газовой фазах. Высокая концентрация красителя в пленке обеспечивает эффективное поглощение возбуждающего света (оптическая плотность на длине волны 595 нм составляет 0,1-2 единиц) и высокие уровни люминесцентного сигнала.

На рис.3 показаны кинетики затухания люминесценции полимерных композиций Pt- и Pd-октаэтилпорфин-кетонов в полистироле и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону. Характер зависимостей не изменяется при различных концентрациях кислорода и при изменении концентрации красителя в полимере в диапазоне 0,1-50 мМ последнего. Времена жизни люминесценции красителей в композиции в отсутствии тушителя (кислорода) составляют 63,0 мкс и 450 мкс для Pt- и Pd-комплекса соответственно, при 25oC.

На рис. 4 приведена калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием полимерной кислород-чувствительной композиции на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона. Она представлена в шкале времен жизни фосфоресценции (микросекунды), а также в линеаризованном виде в координатах Штерна-Фольмера (to/t [Q]). Амплитуда изменения времени жизни для обескислороженных и насыщенных воздухом сред составляет около 4 раз при 25oС. Изменения интенсивности люминесценции и их характер аналогичны изменениям времени жизни люминесценции, что свидетельствует об истинно динамическом типе тушения люминесценции красителей в полимерных композициях.

Аналогичным образом получают полимерные композиции исходя из Pt-, Pd-комплексов тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона и других гидрофобных порфирин-кетонов. Люминесцентные и кислород-чувствительные свойства полученных композиций аналогичны вышеописанным.

Содержание люминесцирующего красителя в полимерной композиции диктуется практическими соображениями. Нижний предел обусловлен чувствительностью детектирующей системы, поскольку величина фосфоресцентного сигнала прямо связан с концентрацией красителя. Верхний предел обусловлен, с одной стороны, растворимостью красителя в полимере, а с другой эффективностью поглощения возбуждающего света данной композицией. Если эффективность поглощения близка к 100% то практически весь возбуждающий свет трансформируется в фосфоресценцию и дальнейшее увеличение концентрации красителя не имеет смысла. В частности, для системы Pt-октаэтилпорфин-кетон-полистирол в описании указан исследованный диапазон концентраций красителя 0,1-50 мМ, который и соответствует весовому диапазону, приведенному затем в формуле: верхний предел составляет 5% (в/в). При более высоком соотношении при испарении растворителя (толуола) краситель в полимерной пленке агрегирует и/или выпадает в осадок, и удельный фосфоресцентный сигнал не растет. При 5% весовом содержании красителя эффективность поглощения возбуждающего света 3-микронной пленкой композиции составляет около 50% что близко к теоретическому пределу и вполне удовлетворяет практическим задачам.

Сравнение фотостабильности комплексов порфиринов и порфирин-кетонов проводили следующим образом. По одинаковым методам (см.выше) были изготовлены кислород-чувствительные элементы на основе pt-ОЭП и Pt-ОЭП-кетона, которые затем были подвергнуты интенсивному облучению полихроматическим светом в одинаковых условиях. Через 18-часов остаточный люминесцентный сигнал (интенсивность) составлял соответственно 34% и 95% т.е. фотохимическая стабильность кислород-чувствительных мембран на основе Pt-ОЭП-кетона примерно в 10 раз лучше, чем для аналогичных на основе Pt-ОЭП. Эти свойства также делают использование новых соединений более предпочтительным по сравнению с известными.

Пример 7. Определение кислорода с использованием полимерных композиций на основе платиновых комплексов порфирин-кетонов.

Для этого был сконструирован прототип волоконно-оптического кислородного сенсора, изображенный в общем виде на рис.5. Основной его компонент - погружной активный элемент, который представляет собой кислород-чувствительную мембрану на основе вышеописанных полимерных композиций, закрепленную на конце раздвоенного волоконно-оптического жгута. Жгут обеспечивает эффективную оптическую связь между кислородной мембраной и оптоэлектронным детектором.

Люминесцентный детектор оптимизирован под измерении люминесценции вышеописанных композиций. В нем используется импульсный режим измерения длительной люминесценции, который основан на согласованной модуляции интенсивности источника света (светодиода) и фотоприемника (фотодиода). Такой режим позволяет определять световые сигналы через определенное время (время задержки) после короткой вспышки источника света. Время задержки может быть переменной величиной, ее величина сравнима с временем затухания люминесценции композиции. Это позволяет определить по нескольким точкам кинетику затухания свечения, а также опорный сигнал (т.е. когда время задержки существенно превосходит время затухания), и рассчитать, таким образом, время жизни специфического сигнала (люминесценции).

Блок-схема оптического кислородного сенсора, в состав которого входит оптоэлектронный люминесцентный детектор и кислородная мембрана на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона, приведена на рис.6. В него входят:

люминесцирующая мембрана на основе Pt-комплекса порфирин-кетона;

(волоконно)оптический узел (раздвоенный световой жгут);

полупроводниковой импульсный источник света (светодиод или лазер) с оптимумом эмиссии в области 550-650 нм;

фотоприемник (фотодиод) с оптимумом чувствительности в области 700-850 нм;

электрическая схема модуляции интенсивности источника света;

электрическая схема модуляции напряжения на фотоприемнике;

электрическая схема согласования двух схем модуляции, обеспечивающая их обратную связь и переменное время задержки;

блок предусиления и/или усиления электрического сигнала с фотодиода;

блок обработки сигнала и вывода сигнала (аналоговый и/или цифровой);

блок питания постоянного тока.

Устройство функционирует следующим образом.

Кислородная мембрана (диск диаметром 8 мм, закрепленный на общем конце раздвоенного волоконно-оптического жгута) имеет диффузионный контакт с анализируемым объектом (жидкость или газ), а также (волоконно)оптическую связь с детектором люминесценции. Оптический канал: светодиод мембрана фотодиод также оснащен оптическими фильтрами для эффективной дискриминации возбуждающего света и фосфоресценции. Светодиод обеспечивает возбуждение люминесценции композиции в области поглощения красителя, фотодиод - регистрацию фосфоресценции, испускаемой красителем, в соответствующей спектральной области. Электрический сигнал с фотодиода проходит схему предусиления и усиления и при необходимости преобразуется из аналогового в цифровой. Схемы модуляции, работающие в согласованном режиме с основной частотой порядка 1 кГц, необходимы для измерения рабочего и опорного сигналов. Рабочий сигнал с фотодиода измеряется спустя определенное время после затухания светодиода (время задержки), которое сравнимо с длительностью люминесценции красителя: диапазон 10-100 микросекунд. При работе в режиме измерения времен жизни рабочий сигнал измеряется при нескольких значениях времени задержки. Опорный сигнал измеряется при времени задержки значительно больше длительности люминесценции: порядка 300-1000 микросекунд. Время интегрирования единичного сигнала (ворота счета) сравнимо с временем затухания красителя и составляет порядка 100 микросекунд. Время накопления сигнала эквивалентно времени 100-1000 вспышек источника света. Принципиальная схема измерения времени жизни люминесценции приведена на рис.7. Схемы обработки и вывода информации с учетом величины опорного сигнала рассчитывают интегральные специфические сигналы (в единицах интенсивности люминесценции или времен жизни) и соответствующие им содержание кислорода в анализируемой среде. Устройство предусматривает проведение начальной калибровки по кислороду по крайней мере по двум точкам и периодических подкалибровок.

Вышеописанное устройство позволяет измерять интенсивность и/или время жизни люминесценции вышеописанных кислородных мембран или покрытий, помещенных на конец раздвоенного оптического волокна, и по результатам этих измерений рассчитывать содержание кислорода в анализируемом образце.

На рис.8 показана типичная кривая люминесцентного отклика пленки на изменение концентрации кислорода в системе (водный раствор). Время 95% отклика составляет порядка 10 сек, включая время переноса активного элемента из раствора насыщенного воздухом в обескислороженный раствор.

Пример 8. Получение чувствительных элементов с использованием ферментов-оксидаз.

а) Чувствительный элемент для определения глюкозы.

Полимерную композицию получают и наносят на полиэфирную подложку аналогично примеру 3. На полученной таким образом кислородной мембране иммобилизуют фермент глюкозоксидазу. Это осуществляют следующим образом. 50 мг фермента растворяют в 1 мл дистиллированной воды и добавляют раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,2% (в/в). Полученный раствор наносят на горизонтальную поверхность кислородной мембраны, равномерно распределяя его по площади примерно равной 25 см2 и высушивают досуха на воздухе (1-3 часа). Полученную таким образом глюкозооксидазную мембрану хранят при +4oC в сухом виде или в фосфатном буфере, рН 7,0 с 0,1% азида натрия.

Для детекции глюкозы используют вышеописанный кислородный датчик (см. пример 6), активный элемент которого оснащен вышеописанной глюкозооксидазной мембраной, а не кислородной мембраной. Измерения проводят в 0,05 М фосфатном буфере. Волоконно-оптический активный элемент последовательно погружают в растворы с различным содержанием глюкозы (в промежутках промывают чистым буфером) и контролируют изменением интенсивности люминесценции. Характерный вид кривой люминесцентного отклика волоконно-оптического глюкозного биосенсора погружного типа показан на рис.9. Величина конечного отклика в образце глюкозы (стационарный сигнал) после стабилизации люминесцентного сигнала (характерное время 2-10 мин) служит для количественной оценки содержания анализируемого вещества. По величине этого отклика (интенсивности или времени жизни) определяют соответствующее ему содержания глюкозы в образце, используя предварительно полученную калибровку.

б) Чувствительный элемент для определения холестерина.

Ферментную мембрану на основе кислород-чувствительной композиции pt-ОЭП-кетон-полистирол и холестериноксидазы (из Pseudomonas fluorescens) получали аналогично методике из примера 7. К 0,2 мл фермента (3 мг/мл, 100 Ед/мл) добавляли глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,2% наносили на поверхность кислородной мембраны (площадь 10 см2) и инкубировали 1 час при комнатной температуре (не высушивать досуха). Затем мембрану промывали и хранили в буфере при 4oС.

На рис. 10 показан отклик ферментной мембраны на холестерин, 3 мг/мл. Условия: 0,05 М К-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мг/мл холата натрия, 23oC. Методика измерений аналогична примеру 7.

Таким образом, в патенте описан новый класс фосфоресцирующих красителей, имеющих длинноволновые спектральные характеристики и высокую фотохимическую стабильность, которые перспективны для ряда практических применений. В частности, чувствительные элементы, разработанные на их основе, а также способ определения кислорода позволяют осуществлять точную количественную детекцию кислорода и спектра важнейших метаболитов с использованием несложной реагентной, методической и инструментальной базы.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pt-октаэтилпорфина (____) и Pt-октаэтилпорфин-кетона Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25oС.

Рис. 2. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pd-октаэтилпорфина (____) и Pd-октаэтилпорфин-кетона Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25oС.

Рис. 3. Кинетики затухания фосфоресценции композиций Pt-октаэтилпорфинкетона (А) и Pd-октаэтилпорфин-кетона (Б) и полистирола и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону затухания. Условия: 25oС, соотношение полимер/краситель 100/1.

Рис.4. Калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием композиции Pt-октаэтилпорфин-кетон - полистирол. Кривая 1 в координатах (tq, P), кривая 2 линеаризация в координатах Штерна-Фольмера (to/t, P). Условия аналогичны рис.3.

Рис 5. Принцип работы волоконно-оптического кислородного (био)сенсора.

Рис. 6. Блок-схема оптоэлектронного люминесцентного детектора кислородного сенсора. 1 волоконно-оптический выход с детектора на мембрану; 2 - светодиод; 3 фотодиод; 4 схема модуляции светодиода; 5 схема модуляции фотодиода; 6 схема синхронизации и задачи времени задержки; 7 - предусилитель и/или усилитель; 8 процессор для обработки и вывода информации.

Рис. 7. Схема модуляции напряжения на источнике света и фотоприемнике, используемая в оптоэлектронном детекторе для измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции полимерных композиций.

Рис.8. Стабильность интегрального люминесцентного сигнала (интенсивности, А), и кривая отклика волоконно-оптического кислородного сенсора на изменение концентрации кислорода в анализируемом водном растворе (Б). Изменение интенсивности (и соответственно времени жизни люминесценции) на кривой Б в области 40 сек отражает процесс переноса активного элемента из насыщенного воздухом раствора в обескислороженную среду.

Рис. 9. Отклик погружного волоконно-оптического глюкозного биосенсора мембранного типа на различные концентрации глюкозы.

Рис. 10. Отклик погружной ферментной мембраны на основе кислород-чувствительной полимерной композиции и холестериноксидазы на наличие холестерина (3 мг/мл) в анализируемом образце. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Металлокомплексы порфирин-кетонов общей формулы



где R1-R8 водород, низший алкил или -CH2-CH2COOR9;

R9 водород или алкил;

М Pt2+ или Pd2+,

в качестве фосфоресцирующих красителей.

2. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R1-R8 означают этил.

3. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R1, R3, R5 и R7 означают метил, а R2, R4, R6 и R8 означают СН2СН2СООН.

4. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R1, R3, R5 и R7 означают метил, а R2, R4, R6 и R8 означают СН2СН2СООСН3.

5. Чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде, представляющий собой сформованное изделие из кислородопроницаемого полимера с распределенным в нем фосфореcцирующим красителем, отличающийся тем, что он выполнен в виде изделия, сформованного из полистирола, содержащего в качестве красителя металлкомплексы порфирин-кетонов общей формулы



где R1-R8 -водород, низший алкил или -СН2СН2СООR9;

R9 водород или алкил;

М Pt2+ или Pd2+.

6. Элемент по п.5, отличающийся тем, что он содержит в качестве красителя металлкомплексы октаэтилпорфирин-кетонов в количестве 5% от массы полистирола.

7. Элемент по пп.5 и 6, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки толщиной 1-20 мк.

8. Элемент по пп.5 и 7, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки, закрепленной на твердой подложке или оптическом элементе.

9. Элемент по пп.5 и 8, отличающийся тем, что сформованное изделие дополнительно содержит слой кислородзависимого фермента.

10. Способ определения кислорода, включающий использование чувствительного элемента на основе проницаемого для кислорода полимера с распределенным в нем фосфоресцирующим красителем, находящегося в контакте с анализируемым образцом и связанного посредством оптического волокна с детектором фосфоресценции, возбуждение фосфоресценции чувствительного элемента светодиодом в области поглощения красителя, регистрацию фосфоресценции и расчет концентрации кислорода по величине интенсивности и/или времени жизни фосфоресценции, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полистирол, в качестве фосфоресцирующего красителя металлокомплексы общей формулы



где R1-R8 относятся к радикалам из группы водород, низший алкил или СН2-СН2-COO-R9;

R9 водород или алкил;

М Pt2+, Pd2+,

регистрацию флуоресценции ведут в импульсном режиме с временным разрешением с переменным временем задержки при возбуждении светодиодом, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии в диапазоне 570 630 нм, при этом используют детектор с оптимальной чувствительностью при 700 850 нм, а расчет времени жизни ведут исходя из одноэкспоненциального характера затухания фосфоресценции.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве фосфоресцирующего красителя используют Pt-октаэтилпорфин-кетон, характеризующийся оптимальным значением фосфоресценции при длинах волн возбуждения и фосфоресценции 591 и 790 нм соответственно, а возбуждение осуществляют желтым светодиодом CaAs, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии при 586 нм.