СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ, АНТИАДГЕЗИВНОЙ И АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ, АНТИАДГЕЗИВНОЙ И АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ


RU (11) 2043772 (13) C1

(51) 6 A61K39/108, A61K39/40 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1995.09.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 93009805/13 
(22) Дата подачи заявки: 1993.02.25 
(45) Опубликовано: 1995.09.20 
(56) Аналоги изобретения: Ветеринария, N 8, 1993, с.5-7. 
(71) Имя заявителя: Малахов Юрий Алексеевич; Тугаринов Олег Алексеевич; Пирожков Михаил Константинович; Солодков Виктор Степанович 
(72) Имя изобретателя: Малахов Юрий Алексеевич; Тугаринов Олег Алексеевич; Пирожков Михаил Константинович; Солодков Виктор Степанович 
(73) Имя патентообладателя: Малахов Юрий Алексеевич; Тугаринов Олег Алексеевич; Пирожков Михаил Константинович; Солодков Виктор Степанович 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ, АНТИАДГЕЗИВНОЙ И АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, антиадгезивная и антитоксичная сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных, способ ее получения и применения. Сущность изобретения: сыворотка содержит комплекс антител против соматических 09, 078, 0141, белковых адгезивных К88, К99, 987Р, F41 и полисахаридных капсульных К30, К80, К87 антигенов, обеспечивающий нейтрализацию патогенного действия эшерихий у животных различных видов. Способ получения сыворотки включает получение поливалентного антигена, гипериммунизацию волов-продуцентов, взятие крови, отделение и консервирование сыворотки. Сыворотку применяют для лечения и профилактики эшерихиоза новорожденных телят, поросят, ягнят и жеребят. 6 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к способам получения гипериммунной сыворотки, содержащей специфические антитела к энтеропатогенным эшерихиям возбудителям эшерихиоза животных, и их адгезивным антигенам К88, К99, 987Р, F41 и к термолабильному и термостабильному энтеротоксинам. Предназначается сыворотка для лечения и специфической профилактики эшерихиоза телят, поросят, ягнят и жеребят.

Эшерихиоз широко распространенная инфекционная болезнь молодняка сельскохозяйственных животных, вызывающая высокую смертность, а также задержку роста и снижение продуктивности у переболевших особей. Возбудителями болезни являются представили рода эшерихий, объединяющего 170 серогрупп и более 10000 серологических вариантов. Однако эшерихиоз сельскохозяйственных животных вызывают сравнительно немногие серовары. Большинство из этих сероваров эшерихий обладают общими факторами патогенности, такими как адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41, термолабильный (ТЛ) и термостабильный (ТС) энтеротоксины. Широкая вариабельность и изменчивость эшерихий, а главное быстрое возникновение у них устойчивости к применяемым антибиотикам и другим лечебным препаратам делает актуальным создание средств специфической профилактики и лечения эшерихиоза.

Для специфической профилактики и лечения эшерихиоза в pазличных странах применяют сыворотку, полученную из крови животных продуцентов (волов, свиней), гипериммунизированных возрастающими дозами энтеропатогенных штаммов эшерихий различных серогрупп, являющихся возбудителями болезни на территории данной страны. Например, в Чехословакии фирма Биовета изготавливает сыворотку против колибациллеза, содержащую антитела к эшерихиям серогрупп 08, 078, 0138, 0139 и 0141; в Германии 08, 09, 015, 026, 055, 078, 086, 0111, 0115, 0117; в Болгарии 08, 020, 045, 0138, 0139, 0147; во Франции 09, 015, 0,78, 086, 0115 и 0117 (проспекты фирм Биовета, Рон-Мерье, института Дессау и др. ). Эффективность полученных гипериммунных сывороток проявляется в основном к эшерихиям тех серогрупп, которые входят в состав антигена.

В Pоссии применяется поливалентная сыворотка против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных, изготавливаемая путем гипериммунизации волов-продуцентов поливалентным антигеном, включающим энтеропатогенные эшерихии следующих серогрупп и сероваров: 08:K43; 09:K30; 015:K14: H30; 020;026:K60: 041; 055; 078:K80; 086; K61:H32; 0115; 0117: K62:H4; 0119: K69: H4; 0101:K99; 0138:K81; 0139:K82; 0141:K87:K88; 0147:K89:K88; 0149:K91: K88.

Основным недостатком сыворотки является недостаточная лечебная и профилактическая эффективность при эшерихиозе, протекающем в формах колидиареи и колиэнтеротоксемии, вследствие низкого титра антител и адгезивным антигенам К88 и К99, термолабильному и термостабильному энтеротоксинам и отсутствия антител и адгезивным антигенам 987Р и F41.

Целью изобретения является разработка способа получения антиадгезивной и антитоксической сыворотки против эшерихиоза, обеспечивающей лечение и специфическую профилактику эшерихиоза сельскохозяйственных животных независимо от региона и серовариантной принадлежности возбудителя.

Поставленная цель достигается гипериммунизацией волов-продуцентов поливалентным антигеном, содержащим соматические и полисахаридные капсульные антигены штаммов эшерихий различных серогрупп, адгезивные антигены К88, К99, 987Р, F41 в фосфатно-мочевинном буфере, термолабильный и термостабильный анатоксины в среде культивирования (бульон Хоттингера) и консервант, при следующем соотношении компонентов в 1 л: Cоматические и полисахаридные капсульные антигены эшерихий (микробные клетки) 9,0 х 1012-1013 Адгезивные антигены К88, К99, 987Р,F41 в фосфатно-мочевинном буфере (титр в РДП 1:8-1: 16) 240-320 см3 Формалин 2,8-3,5 см3

Культуральная

жидкость

(бульон Хоттингера)

с термолабильным и

термостабильным

анатоксинами (титр в РДП 1:4-1:8) до 1 л

Поливалентный антиген содержит бактериальные клетки эшерихий 3 серогрупп 09, 078 и 0141 основных возбудителей эшерихиоза сельскохозяйственных животных, полисахаридные капсульные антигены К30, К80 и К87, белковые адгезивные антигены К88, Е99, 987Р и F41, термолабильный и термостабильный анатоксины.

Предлагаемый набор антигенов позволяет получить высокоэффективную сыворотку против эшерихиоза (коллидиареи, колисепсис, колиэнтеротоксемия) с широким спектром действия, пригодную для применения в различных регионах России и других стран СНГ. Штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов под номерами: 355-37/13 (09:К30); 305-37/11 (078: К80); 334-37/12 (0141:K87:K88); 453-37/17 (0115:K88); 454-37/17 (0141:K99); 397-37/14 (09:K103:987P); 398-37/14 (0101:F41). В качестве продуцентов адгезивных антигенов К88, К99, 987Р и F41 используются соответственно штаммы ВГНКИ N 453-37/17 (0115:K88); ВГНКИ N 454-37/17 (0141:К99); ВГНКИ N 397-37/14 (09:K103:987P) и ВГНКИ N 398-37/14 (0101:F41). Антигены К88, К99, 987Р и F41 представляют собой филаментозные образования на поверхности бактериальных клеток и выделение их из бактериальной массы штаммов-продуцентов осуществляют путем тепловой обработки как описано в примере 1.

Антиген К88 имеет белковую природу и состоит из субъединиц с мол.м. 25000-26200 дальтон, определенной путем электрофореза в SDS 11% полиакриламидном геле (в качестве стандартов использованы бычий альбумин, пепсин, трипсин и лизоцим с молекулярными массами соответственно 68000, 35000, 34000 и 14600 дальтон). В лиофилизированном препарате содержится 95-96% белка; 2-3% липидов и 1-2% углеводов. Антиген К88 термолабилен и денатурируется при 70оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена К88 при рН 3,5. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру следующих размеров: 4,5 нм в диаметре и до 120 нм в длину. Подлинность и серологическую активность адгезивного антигена К88 определяют в РДП с МкАт или моноспецифической анти-К88 сывороткой (титр 1:64). Титр антигена в этой реакции составляет 1:16-1:32. Антигенная активность описана в примере 5.

Антиген К99 представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 18500-22500 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 93-94% белка, 4-5% липидов и 1-2% углеводов. Антиген К99 термолабилен и денатурируется при температуре 70оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена К99 при рН 9,5. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру 8,4 нм в диаметре и до 130 нм длиною с большой склонностью к агрегации. Титр адгезивного антигена К99 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-К99 сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8-1:16. Антигенная активность описана в примере 5.

Штамм продуцент адгезивного антигена 987Р ВГНКИ N 397-37/14 с антигенной формулой С9:K103:987P выделен из поросенка 5-дневного возраста; агглютинируется гомологичный О-коли сывороткой до титра 1:9000, сывороткой 0137 1:200, с О-коли сыворотками других серогрупп не агглютинируется. Эшерихизная анти-987Р сыворотка агглютинирует штамм до титра 1:800; ЛД50 для белых мышей составляет 2,78 х 108 микробных клеток; активно продуцирует адгезивный антиген 987Р при культивировании в производственных условиях в реакторе на среде Хоттингера при аэрации и активном перемешивании.

Антиген 987Р имеет белковую природу и состоит из субъединиц с мол.м. 19400-22500 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 97-98,5% белка; 2-2,5% липидов и 0,5-1% аминосахаров. Антиген 987Р термолабилен и денатурируется при температуре 70оС в течение 30 минут. Изоэлектрическая точка антигена 987Р при рН 3,7. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру следующих размеров: 7 нм в диаметре и до 200 нм в длину. Титр адгезивного антигена 987Р в РДП с мкАт или моноспецифической анти-987Р сывороткой (титр 1:64) составляет 1:8-1:16. Антигенная активность описана в примере 5.

Штамм продуцент адгезивного антигена F41 ВГНКИ N 398-37/14 с антигенной формулой 0101: F41 выделен от теленка 3-дневного возраста; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1:3200 и гетерологичными сыворотками 02 1:100; 09, 015, 0138. 1:200; 04 1:400, 018 1:100 и 0117, 0142 1:50; анти- F41 сывороткой до титра 1:800 ЛД50 для белых мышей составляет 6,12 х 108 микробных тел; активно продуцирует адгезивный антиген F41 на среде Хоттингера при культивировании в производственных условиях в реакторе при аэрации и активном перемешивании.

Адгезивный антиген F41 представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол. м. 28000-29000 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 95,5-96% белка; 3-3,5% липидов и 0,5-1% углеводов. Антиген F41 термолабилен и денатурируется при температуре 70оС в течение 30 мин. Изоэлектрическая точка антигена F41 при рН 4,0. При электронно-микроскопическом исследовании антиген имеет палочковидную структуру 4 нм в диаметре и до 110 нм в длину. Титр адгезивного антигена F41 в РДП с МкАт или моноспецифической анти-F41 сывороткой (титр 1:10) составляет 1:8-1:16. Антигенная активность описана в примере 5.

Адгезивные антигены К88, К99, 987Р и F41 входят в состав поливалентного антигена и обеспечивают выработку антиадгезивных антител, препятствующих прикреплению энтеропатогенных эшерехий к эпителию тонкого отдела кишечника животных, в сыворотке крови волов-продуцентов при гипериммунизации.

Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 397-37/14, ВГНКИ N 453-37/17 и ВГНКИ N 454-37/17 являются активными продуцентами термолабильного токсина. Термолабильный токсин стабильно накапливается в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании данных штаммов. Индекс дилятации на изолированной петле кишечника поросенка составляет: для штамма ВГНКИ N 334-37/12 1,6-2,0; ВГНКИ N 397-37/14 1,0-1,2; ВГНКИ N 453-37/17 1,8-2,4 и ВГНКИ N 454-37/17 1,0-1,6. Оптимальными условиями, при которых наблюдается максимальное накопление ТЛ токсина в культуральной жидкости, являются: рН среды в пределах от 7 до 8 и температура 36-38оС. ТЛ токсин представляет собой белок и состоит из субъединиц с мол.м. 22000-24000 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 97-98% белка; 0,5-1% липидов и 1,5-2% углеводов. ТЛ токсин термолабилен и полностью инактивируется при температуре 60оС в течение 15 мин. Изоэлектрическая точка ТЛ токсина при рН 4,0. Серологическую активность термолабильного токсина, содержащегося в среде культивирования, определяют в РДП с моноспецифической антисывороткой (титр 1:32). Титр ТЛ токсина в этой реакции составляет 1:4-1:8. Термостабильный токсин имеет антигенное родство с токсином холерного вибриона и дает перекрестные реакции с сыворотками, полученными к этому антигену.

Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11, ВГНКИ N 355-37/13 и ВГНКИ N 398-37/14 являются активными продуцентами термостабильного токсина, который стабильно накапливается в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании. Индекс дилятации на изолированной петле кишечника кролика составляет: для штамма ВГНКИ N 305-37/11 1,2-1,5; ВГНКИ N 355-37/13 -1,1-1,4 и ВГНКИ N 398-37/14 1,0-1,2. Оптимальными условиями, при которых наблюдается максимальное накопление ТС токсина в культуральной жидкости, являются: рН среды 8,0-8,5 и температура 36-36,5оС. ТС токсин представляет собой низкомолекулярный белок и состоит из субъединиц с мол.м 4400-5100 дальтон. В лиофилизированном препарате содержится 93-94% белка; 4-5% липидов и 1-2% углеводов. ТС токсин термостабилен и инактивируется при температуре 100оС в течение 15 мин. Изоэлектрическая точка ТС токсина при рН 10. Титр ТС токсина, содержащегося в среде культивирования, в РДП с моноспецифической антисывороткой (титр 1:16) составляет 1:4-1:8.

Термолабильный и термостабильный анатоксины используются в поливалентном антигене для выработки в сыворотке крови гипериммунизироанных волов-продуцентов антитоксичных антител, нейтрализующих энтеротоксическое действие энтеропатогенных эшерихий.

Штамм Eschetichia coli ВГНКИ N 305-37/11 с антигенной формулой 078:К80 выделен от теленка 2-дневного возраста; агглютинируется гомологичной сывороткой 078 до тира 1:10000 и гетерологичными сыворотками 08 1:500; 086 1: 100; 0103; 0127; 0137 1:400; 0139 1:200 и 0141 1:800; высоко вирулентен для белых мышей ЛД 50 составляет 1,2 х 107 микробных клеток при внутрибрюшинном введении. Соматический 078 и полисахаридный капсульный антиген К80 хорошо воспроизводятся в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании штамма.

Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 355-37/13 с антигенной формулой 09:К30 выделен от теленка 5-дневного возраста; агглютинируется гомологичной сывороткой 09 до титра 1:9000 и гетерологичной сывороткой 0137 1:200; ЛД 50 для белых мышей составляет 4,5 х 108 микробных клеток при внутрибрюшинном введении. Соматический антиген 09 и полисахаридный капсульный К30 хорошо воспроизводятся в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании штамма.

Штамм Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 с антигенной формулой 0141:K87: K88 выделен от поросенка 7-дневного возраста; агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1: 3200 и гетерологичными сыворотками 08, 09, 0142, 0147 1:100 и 0103 1:300; анти-К88 сывороткой до титра 1:800; ЛД50 для белых мышей составляет 5 х 108 микробных клеток при внутрибрюшинном введении; вызывает гемолиз типа и гемолизирует с равной интенсивностью эритроциты барана и кролика. Соматический антиген 0141, полисахаридный капсульный К87 и адгезивный антиген К88 хорошо воспроизводятся в бульоне Хоттингера при реакторном культивировании штамма.

П р и м е р 1. Способ изготовления поливалентного антигена для гипериммунизации волов-продуцентов заключается в следующем.

Штаммы эшерихий засевают каждый отдельно по 0,5 см3 в 200 см3 флаконы с 80-100 см3 бульона Хоттингера, содержащего аминный азот 150-200 мг/% триптофан 50-100 мг/% и имеющего рН 7,8-8,0. Штаммы выращивают в течение 8-10 ч при температуре 27-38оС. Выросшие культуры проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Чистые культуры засевают из флаконов отдельно в наполовину заполненные бульоном Хоттингера 10-литровые бутыли и культивируют в течение 8-10 ч при температуре 37-38оС, периодически встряхивая. Полученную расплодку перед засевом в реактор проверяют на чистоту. Штаммы NN 355-37/13 и 305-37/11 выращивают совместно в одном реакторе, остальные штаммы выращивают раздельно. В каждый реактор засевают матровые расплодки в количестве 5-7% от объема среды, выращивают в течение 14-16 ч при непрерывной аэрации, перемешивании и температуре 37-38оС. По окончании выращивания определяют рН, наличие адгезивных антигенов в РА на стекле, концентрацию микробных клеток, чистоту культуры микроскопией и высевом на питательные среды. Адгезивные антигены эшерихий отделяют от бактериальных клеток следующим образом. Выращенные в реакторах штаммы ВГНКИ N 397-37/14; ВГНКИ N ВГНКИ N 398-37/14; ВГНКИ N 453-37/17 и ВГНКИ N 454-37/17 сепарируют или центрифугируют при 4500 об/мин в течение 20 мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость и определяют концентрацию термолабильного и термостабильного токсинов в РДП с моноспецифическими антисыворотками. Титр каждого токсина в культуральной жидкости должен быть не ниже 1:4-1:8.

Бактериальную массу каждого штамма ресуспендируют в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации 100-120 млрд/см3 микробных клеток; прогревают при температуре 60-65оС в течение 20-25 мин; супернатант отделяют от бактериальной массы центрифугированием при 10-15 тыс.об/мин в течение 30-35 мин и проверяют на концентрацию адгезивного антигена в РДП с МкАт или моноспецифической антисывороткой. Титр каждого антигена в супернатанте должен быть на меньше чем (1:8)-(1:16). Полученные супернатанты смешивают в равных объемах, консервируют формалином до 0,3%-ной концентрации и используют для получения поливалентного антигена. Бактериальную массу утилизируют. Культуры штаммов NN 355-37/13 и 305-37/11, выращенные в одном реакторе, и N 334-37/12, выращенную в отдельном реакторе, разбавляют культуральной жидкостью, полученной при выращивании штаммов N 397-37/14; 398-37/14; 453-37/17; 454-37/17, до концентрации 12,5-13,0 млрд/см3 микробных клеток. На две части смеси культур штаммов NN 355-37/13 и 305-37/11 добавляют одну часть культуры штамма N 334-37/12, формалин до 0,3% -ной концентрации, выдерживают 15-16 дней при температуре 37-38оС, затем добавляют супернатант, содержащий адгезивные антигены, до 25-30%-ной концентрации.

Содержание компонентов в поливалентном антигене приведено в табл.1.

Пpиготовленный поливалентный антиген проверяют на стерильность путем высева на МПА, МПБ, Сабуро и регенерированную среду Китт-Тароцци, величину рН, на содержание формалина и на безвредность введением под кожу пяти белым мышам по 0,3 см3. Мыши должны оставаться живыми в течение 5, а посевы стерильными в течение 10 сут. Проведенный на стерильность и безвредность антиген используют для гипериммунизации животных. Срок годности полиантигена до шести месяцев, при условии хранения в темном месте при температуре 2-15оС.

П р и м е р 2. Волов, предназначенных для гипериммунизации, карантинируют, подвергают исследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней согласно действующей инструкции о порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов. К эксплуатации допускают животных 2,5-8-летнего возраста, массой не менее 400 кг.

Гипериммунизация животных проводится по схеме, приведенной в табл.2.

Антиген в начале обработки волов вводят в область шеи, а при переходе на большие дозы его вводят в разные места шеи, верхней части туловища, но не более 10-15 см от заднего края лопатки. Очередное введение полиантигена в процессе эксплуатации волов проводят через 3-4 дня после каждого взятия крови: первый раз в половинной дозе; второй раз через 3-4 сут после первой инъекции в полной дозе. Через 8-10 дней после второй инъекции полиантигена производят очередное взятие крови и т.д.

П р и м е р 3. Взятие и обработка крови. Первое пробное крововзятие от продуцентов производят из расчета не более 0,8 л на 100 кг живой массы, в последующие 1,6 л. Кровь берут у продуцентов с нормальной температурой тела после предварительной выдержки на голодной диете в течение 12 ч при неограниченном поении. Сыворотку из крови получают цитратным методом. Для предохранения крови от свертывания применяют антикоагулянт 10%-ный раствор лимонно-кислого натрия, который готовят на дистиллированной воде или физиологическом растворе и стерилизуют в автоклаве при температуре 120оС в течение 30 мин. В стерильные бутыли, в которые берут кровь, наливают раствор лимонно-кислого натрия из расчета 34 мм на л крови. В процессе и после окончания взятия крови раствор антикоагулянта и кровь смешивают, покачиванием бутыли плавными круговыми движениями.

Для отделения форменных элементов полученную цитратную кровь сепарируют. Полученную плазму дефибринируют. Дефибринирование плазмы крови производят в стерильном дефибринаторе с мешалкой. К плазме, при работе мешалки, через штуцер добавляют 30%-ный раствор хлористого кальция из расчета 1,3 мл на литр плазмы и свежеприготовленную сыворотку, содержащую фермент тромбин, из расчета 10 мл на 1 л. Процесс дефибринирования плазмы обычно длится 25-30 мин. По истечении этого времени берут пробу для проверки на полноту перевода фибриногена в фибрин, для чего в пробирку наливают 7-8 мл испытуемой сыворотки и 5-6 мл насыщенного раствора хлористого кальция, смесь тщательно встряхивают и оставляют в покое на 10-15 мин. Прозрачность смеси указывает на полноту перехода фибриногена в фибрин. Полученную сыворотку проверяют манганометрическим методом на содержание кальция, присутствие которого в сыворотке не должно превышать 35 мг/% Далее сыворотку крови консервируют 5%-ным раствором фенола до концентрации его в общем объеме сыворотки 0,5% После этого сыворотку перекачивают в отстойник и выдерживают 2-2,5 месяца при 2-15оС. Отстаивание сыворотки можно заменить сепарированием. По истечении срока отстаивания составляют серии из сывороток очередных крововзятий. Затем сыворотку подвергают последовательно грубой и стерилизующей фильтрации через пластины марок "Ф2" и "СФ", после чего снова проверяют на стерильность как указано в примере 4. Проверенную на стерильность сыворотку расфасовывают во флаконы, закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют.

П р и м е р 4. Приготовленные серии сыворотки проверяют на внешний вид, стерильность, безвредность и активность.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, плесени, неразбивающихся хлопьев, герметичности укупорки все флаконы с сывороткой встряхивают, просматривают в проходящем свете и переворачивают вниз пробками. Стерильность сыворотки проверяют путем высева на МПА, МПБ, Сабуро, регенерированную среду Китт-Тарацци. Посевы культивируют при температуре 37-38оС. Через двое суток из жидких сред делают пересевы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Первичные посевы выдерживают 10, а вторичные 8 сут. Роста на питательных средах не должно быть. Безвредность сыворотки определяют на 4 белых мышах массой 14-18 г и 4 морских свинках 350-400 г при подкожном введении соответственно 0,5 и 5,0 см3 препарате. Сыворотку считают безвредной, если все животные остаются клинически здоровыми в течение 10 сут. Активность сыворотки проверяют на 40 белых мышах массой 18-20 г, из которых 20 животным вводят подкожно 0,2 см3 препарата, а 20 мышей служат контролем. Через 24 ч после введения сыворотки всех животных заражают внутрибрюшинно подтитрованной смертельной дозой двух контрольных штаммов эшерихий серогрупп 09 и 078, используя на штамм каждой серогрупп 10 иммунизированных и 10 контрольных мышей. Сыворотку считают активной при выживании не менее 7 подопытных и гибели 8-10 контрольных мышей от каждого штамма в течение 3 сут.

П р и м е р 5. Концентрацию антител к соматическим, полисахаридным капсульным, адгезивным антигенам, ТЛ и ТС токсинам в предлагаемой сыворотке против эшерихиозе, полученной согласно описанному способу, в сравнении с известной сывороткой-прототипом определяют в РА и РДП, используя в качестве антигенов производственные и моноплазмидные штаммы (для РА) и коллоидные растворы адгезивных антигенов в фосфатно-мочевинном буфере и культуральные жидкости, содержащие ТЛ и ТС токсины, полученные как описано в примере 1 (для РДП). Результаты приведены в табл.3.

Из приведенных материалов видно, что предлагаемая антиадгезивная и антитоксическая сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных по сравнению с сывороткой-прототипом содержит более высокий титр антител к соматическим и полисахаридным капсульным антигенам 1600-1:6400 против 1:50-1: 400; к адгезивным антигенам К88 и К99 1:640-1:6400 против 1:50-1:200 в РА и 1: 4-1:16 против 1:1 в РДП и к ТЛ токсину 1:2-1:4 против 1:1. В предлагаемой сыворотке дополнительно выявляются убедительные титры антител к адгезивным антигенам 987Р, F41 и ТС токсину, которых нет в сыворотке-прототипе.

П р и м е р 6. Превентивную активность предлагаемой сыворотки проверяют в сравнении с сывороткой-прототипом в остром опыте на 70 поросятах. С этой целью клинически здоровых поросят непосредственно после рождения изолируют от свиноматок и вводят внутримышечно 30 поросятам предлагаемую сыворотку, 30 сыворотку-прототип в дозах 2,0; 4,0; 8,0 см3, используя по десять животных на дозу, и 10 служат контролем. Иммунизированных поросят заражают через 3 ч перорально смесью контрольных штаммов эшерихий, продуцирующих адгезивные антигены, ТС и ТЛ-токсины, в дозе 50 млрд. микробных клеток, а еще через 3 ч после заражения помещают к свиноматкам. Результаты опыта представлены в табл.4.

Материалы таблицы свидетельствуют, что 50%-ная иммунизирующая доза для поросят антиадгезивной и антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных составляет 3,25 см3, что в 2,5 раза ниже ИД50 поливалентной сыворотки против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных.

П р и м е р 7. Сыворотку применяют с лечебной и профилактической целью в хозяйствах, неблагополучных по эшерихиозу молодняка сельскохозяйственных животных. Сыворотку вводят с соблюдением правил асептики внутримышечно в дозах, приведенных в табл.5.

Суточную лечебную дозу сыворотки следует вводить в 2-3 приема с интервалом 3-4 ч, что обеспечивает лучший терапевтический эффект. При тяжелом течении болезни сыворотку вводят повторно через 1-3 дня в тех же дозах внутрибрюшинно. С профилактической целью сыворотку выпаивают новорожденным телятам с молозивом при первых трех выпойках по 10-15 см3.

П р и м е р 8. Сравнительная оценка лечебной эффективности предлагаемой сыворотки и сыворотки-прототипа осуществлена в неблагополучных по эшерихиозу хозяйствах Московской, Липецкой и Ульяновской областей. Лечение заболевших животных проводили в течение трех дней, используя дозы, указанные в примере 7. Результаты приведены в табл.6.

Результаты испытания в хозяйствах трех областей указывают, что предлагаемая сыворотка обладает более высоким терапевтическим эффектом по сравнению с прототипом.

Таким образом, антиадгезивная и антитоксическая сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных содержит необходимое количество специфических антител, способных полностью нейтрализовать патогенетическое действие энтеропатогенных эшерихий у животных различных видов. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ, АНТИАДГЕЗИВНОЙ И АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий гипериммунизацию волов-продуцентов поливалентным антигеном эшерихий, последующее взятие крови, отделение и консервирование сыворотки, отличающийся тем, что для гипериммунизации используют поливалентный антиген, содержащий адгезивный антиген К88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 25000 26200 Д, палочковидной структуры, 4,5 нм в диаметре и до 120 нм в длину и изоэлектрической точкой 3,5, адгезивный антиген К99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 454-37/17, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 18500 22500 Д, палочковидной структуры, 8,4 нм в диаметре и до 130 нм в длину и изоэлектрической точкой 9,5, адгезивный антиген 987Р в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 19400 22500 Д, палочковидной структуры, 7 нм в диаметре и до 200 нм в длину и изоэлектрической точкой 3,7, адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 28000 - 29000 Д палочковидной структуры, 4 нм в диаметре и до 110 нм в длину и изоэлектрической точкой 4,0, термолабильный анатоксин в культуральной среде с титром в РДП 1 4 1 8, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 397-37/14, ВГНКИ 453-37/17 и ВГНКИ N 454-37/17, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 22000 24000 Д и изоэлектрической точкой 4,0, термостабильный анатоксин в культуральной среде с титром в РДП 1 4 1 8, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 355-37/13, ВГНКИ N 305-37/11 и ВГНКИ N 398-37/14, представляющий собой белок из субъединиц с мол.м. 4400 5100 Д и изоэлектрической точкой 10,0, суспензию клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 355-37/13 в культуральной среде, суспензию клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде и суспензию клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде при следующем соотношении компонентов на 1 л полиантигена:

Суспензия штамма ВГНКИ N 355-37/13 в культуральной среде, 1012 м.к. 3,0 3,3

Суспензия штамма ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде, 1012 м.к. 3,0 3,3

Суспензия штамма ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, 1012 м.к. 3,0 3,3

Адгезивный антиген К 88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, см3 60 80

Адгезивный антиген К 99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, см3 60 80

Адгезивный антиген 987Р в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, см3 60 80

Адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 8 1 16, см3 60 80

Формалин, см3 2,8 3,5

Термолабильный и термостабильный анатоксины в культуральной среде с титром в РДП 1 4 1 8, л До 1