СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ГЕМАТИНОВОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗО-САХАРИД И ПОЛУЧЕННЫЙ ПРОДУКТ

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ГЕМАТИНОВОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗО-САХАРИД И ПОЛУЧЕННЫЙ ПРОДУКТ


RU (11) 2259197 (13) C2

(51) 7 A61K31/40, A61K31/7016 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.08.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003116134/15 
(22) Дата подачи заявки: 2001.10.31 
(30) Приоритетные данные: 60/245,269 2000.11.02 пп.1-45 US 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2001.10.31 
(43) Дата публикации заявки: 2005.01.10 
(45) Опубликовано: 2005.08.27 
(56) Аналоги изобретения: Beck R. et al, «Food Production Chemistry and Nutritional Biochemistry», 1985, v.6, p.315-321. «Хелатирующие агенты», Р.Досон и др. Справочник химика. - М.: Мир, 1991, с.410-411. 
(72) Имя изобретателя: БЕК Роберт А. (US); МЭТИР Роберт А. (US) 
(73) Имя патентообладателя: КРОМАСЬЮТИКАЛ ЭДВАНСТ ТЕКНОЛОДЖИЗ, ИНК. (US) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2003.06.02 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: US 01/45205 (31.10.2001) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 02/056826 (25.07.2002) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Г.Б. Егоровой 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО ГЕМАТИНОВОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗО-САХАРИД И ПОЛУЧЕННЫЙ ПРОДУКТ
Изобретение относится к области фармакологии. Сущность изобретения составляет способ выделения и очистки активных гематиновых частиц, присутствующих в комплексах железо-сахарид, включающих в себя комплекс глюконата натрия железа (III) в сахарозе, комплекс гидрат окиси железа (III)-сахароза, комплекс сахарата железа (III). Способ создан на основе отделения комплекса железо-сахарид от одного или нескольких наполнителей и, предпочтительно, лиофилизации. Выделение комплекса железо-сахарид делает возможным его аналитическое количественное определение, дополнительное концентрирование или очистку в виде нового и полезного продукта, приготовление реконструированных препаратов для новых и полезных лекарственных средств. Способность к выделению комплекса железо-сахарид, ответственного за гематиновую функцию, включая его лиофилизированную форму, также обеспечена средствами для приготовления аналитического материала, предназначенными для проверки и доказательства фармакологической целостности, безопасности для пациента и клинических характеристик гематиновых комплексов. Технический результат - обеспечение аналитического мониторинга, стандартизации и проверки качества в течение процессов производства гематина, а также для установления стандартов при их использовании. 9 н. и 36 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 ил. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к терапевтически активным железосодержащим частицам, включая гематиновые фармацевтические препараты для парентерального введения. Для целей настоящего изобретения "гематиновое" обозначает соединение или композицию, содержащую железо в форме, которая стремится к увеличению количества гемоглобина в крови млекопитающего, в частности, человека. Хотя такие соединения могут, в широком смысле, быть охарактеризованы как комплексы железо-углевод, которые могут включать в себя декстраны, настоящее изобретение направлено на общий подкласс, известный как комплексы железо-сахарид, и включает в себя такие вещества, как комплекс глюконата натрия железа(III) в сахарозе (sodium ferric gluconate complex in sucrose, SFGCS), комплекс гидрат окиси железа(III)-сахароза (ferric hydroxide-sucrose complexe, FHSC) и/или другие, характеризуемые как сахараты железа. Для целей настоящего изобретения такие активные железосодержащие вещества упоминаются в целом как комплексы железо-сахарид или активные гематиновые частицы (АГЧ). В данной области термин "комплекс" может иметь разные значения в различных контекстах. В одном аспекте термин «комплекс» может быть использован для описания ассоциации (соединения) между двумя или более ионами с формированием относительно низкомолекулярной неполимерной композиции, которая существует только при данном наборе условий. Этот тип комплекса упоминается как "первичный комплекс". Альтернативный вариант, в котором используется этот термин, предназначается для описания ассоциирования или агломерирования множества первичных комплексов в большую макромолекулу или "вторичный комплекс". Для целей настоящего изобретения такие агломераты также упоминаются здесь как макромолекулы. Для целей настоящего изобретения такие макромолекулы или вторичные комплексы идентифицируются как "комплексы" и упоминаются просто как комплексы. В качестве примера указанных выше различий, глюконат железа(II) представляет собой композицию, содержащую ионы двухвалентного железа и анионы глюконата. Двухвалентный ион железа и два аниона глюконата образуют первичный комплекс с относительно низкой молекулярной массой (около 450 Дальтон), и первичные комплексы этого типа не агломерируются в виде макромолекул, когда они растворяются в водной среде. Поэтому глюконат железа(II) не является композицией, которая попадает в настоящем описании в рамки термина "комплекс". Глюконат железа(III), однако, существует в виде комплекса согласно тому, как этот термин используется здесь, поскольку первичные комплексы ионов трехвалентного железа и анионы глюконата агломерируются с образованием больших макромолекул (и могут иметь молекулярные массы от около 100000 до около 600000 Дальтон или более). Несколько вариантов воплощения терапевтически активных соединений железа(III) являются коммерчески доступными, как будет описано ниже. Для целей настоящего изобретения термин "наполнители" обозначает негематинно активные компоненты, включая побочные продукты реакций синтеза и непрореагировавшие исходные материалы, побочные продукты деградации, разбавители и им подобные компоненты, присутствующие в смеси с терапевтически активными железосодержащими частицами, такими как комплексы железо-сахарид. 

Анемия, связанная с недостатком железа, представляет собой расстройство кроветворной системы, которое может быть излечено с использованием различных терапевтических препаратов, содержащих железо. Эти препараты включают в себя простые соли железа, такие как сульфат железа(II), глюконат железа(II), фумарат железа(II), оротат железа(II) и им подобные. Если использование таких веществ для перорального введения не приводит к устранению недостатка железа, следующий уровень лечения включает в себя парентеральное введение железа. В зависимости от клинического состояния пациента парентеральное введение железа, связанного с полиглюканом или декстраном, может служить в качестве эффективного терапевтического средства доставки железа. Для введения таких декстранов железа может быть использована внутримышечная инъекция или внутривенное введение; коммерческие примеры таких продуктов включают в себя препараты, имеющие такие торговые наименования, как "Imferon" и "INFeD". Различные клинические состояния, которые требуют парентерального введения железа, показали практическую гематиновую ценность декстранов железа. Использование декстранов железа замедляется из-за идиосинкразий при их синтезе и производстве, а также такими реакциями пациентов, как гиперчувствительность. Эти воздействия могут проявляться в виде острой аллергической реакции, наблюдаемой как анафилаксия или такие симптомы, как небольшие или временные ощущения зуда. Вызываются ли такие аллергенные или другие отрицательные воздействия индивидуальной чувствительностью пациента к активному ингредиенту или к побочным продуктам, примесям или к продуктам деградации в парентеральном растворе, до сих пор не установлено.

В качестве альтернативы декстранам железа, здесь рассматриваются комплексы железо-сахарид как недекстрановые гематиновые соединения. Тогда как декстраны железа содержат полимеризованные моносахаридные остатки, комплексы железо-сахарид по настоящему изобретению характеризуются отсутствием, по существу, таких полимеризованных моносахаридов. Комплексы железо-сахарид являются коммерчески доступными, например, под торговым наименованием Ferrlecit, который идентифицируется как комплекс глюконата натрия железа(III) в сахарозе (SFGCS). Производитель утверждает, что структурная формула продукта должна рассматриваться как [NaFe2О3 (C6H11O7)(C12H 22O11)5]n, где n равно примерно 200, и он имеет видимую молекулярную массу 350000±23000 Дальтон. Однако замечено, что на основе опубликованной структурной формулы, процитированной выше, формульная масса должна быть существенно выше, 417600 (хотя, согласно публикации, точная интерпретация формулы является сложной). Более того, коммерческая гематиновая композиция содержит 20% масс./объем. сахарозы (195 мг/мл) в воде. Химическое наименование говорит о том, что терапевтическое железо (Fe) в этой форме фармакологически вводится в виде окисленной формы железа, т.е. Fe(III), в противоположность восстановленной форме железа, т.е. Fe(II). Благодаря заряженному окисленному состоянию Fe(III), предполагается, что глюконовая кислота (пентагидроксикапроновая кислота, C6H12О7) также существует в растворе сахарозы в форме координационного комплекса или лиганда. Для целей настоящего изобретения необходимо понять, что химия глюконата, содержится ли он в комплексе лиганда с Fe(III) или нет, не предотвращает его взаимодействий с другими углеводами, которые могут присутствовать, такими как сахароза. Таким образом, использование термина комплекс железо-сахарид будет пониматься в качестве указания на существование неописанной и неточной структуры, где ионизированная глюконовая кислота (глюконат) и молекулы сахарозы незначительно ассоциируются с помощью различных взаимодействий связывания с получением молекулярного каркаса, который содержит Fe(III). Другое недекстрановое гематиновое соединение по настоящему изобретению композиционно описывается как комплекс гидрат окиси железа(III)-сахароза (FHSC). Этот гематиновый препарат для парентерального введения является коммерчески доступным под торговым наименованием "Venofer". Как и в случае с SFGCS, это описательное наименование говорит о форме трехвалентного железа, Fe(III), которое присутствует в пространственном комплексе с сахарозой или каким-либо производным сахарозы. По этой причине недекстрановые комплексы железо-сахарид по настоящему изобретению включают в себя SFGCS, FHSC и их смеси. Эти носители или средства для доставки железа включают в себя железосодержащий структурный комплекс, который для целей настоящего изобретения обозначается как активные гематиновые частицы (АГЧ).

Для целей настоящего изобретения, термин АГЧ используется взаимозаменяемо с терминами «комплекс железо-сахарид», «сахаридный носитель для доставки железа» и «сахарат железа». Термин "сахарат" или "сахаридный" используется для обобщенного описания взаимодействия атома железа с другой индивидуальной молекулой или с ее полимерами, которая имеет сахарозную группу, структурно идентифицируемую так:

-CH(OH)-C(О)-

Самый простой случай существования сахарозной группы представляет собой случай, где две конечные позиции в стандартной молекулярной проекционной модели Фишера для молекулы видны в виде альдо- или кето-группы, соответственно, обозначаемых как:

(-CH(OH)-CHO) или (-CHO-CH2OH)

Этот номенклатурный формат также описан в Zapsalis C. and R.A. Beck, 1985, "Food Product Chemistry and Nutritional Biochemistry," Chapter 6, John Wiley & Sons, pp. 315-321 (включенные сюда в качестве ссылок). Такие группы и продукты их первого окисления или восстановления существуют в молекулах, распознаваемых в качестве моносахаридов, которые содержат атомы углерода с таким же отношением водорода и кислорода, которое встречается в воде. В качестве примера, альдозный сахар, известный как глюкоза, имел бы глюконовую кислоту в качестве продукта первого окисления и глюцитол, также известный как сорбит, в качестве продукта первого восстановления. Как исходный моносахарид, представленный с помощью модели глюкозы, так и его возможные продукты реакции, сохраняют свидетельство существования характерной сахаридной группы в окисленной или восстановленной форме. Хотя эти структурные вариации существуют, обе они остаются распознанными в качестве моносахаридов и углеводов. В практической номенклатуре окисленная версия сахарозной группы демонстрирует карбоксильную группу, которая при соответствующих условиях pH даст ей возможность для ионизации в соответствии с ее уникальной константой ионизации и значением pKа . Когда она ионизирована, окисленная сахарозная группа обозначается как "сахарат", или же она может быть обобщенно описана как сахаридная кислота, где ионизирующийся протон остается вместе с окисленной сахарозной группой. Если ионизированная карбоксильная группа сахарозной группы ассоциируется с катионом, например, натрия, образуется соль сахаридной кислоты. Например, окисление глюкозы дает глюконовую кислоту, и соль натрия этой сахаридной кислоты представляет собой глюконат натрия. Подобным же образом, когда катион двухвалентного железа Fe(II) электростатически ассоциируется с карбоксильной группой глюконовой кислоты, получается глюконат железа(II). Моносахариды, которые являются альдозами, обычно подвергаются окислению с получением их эквивалентов сахаридной кислоты, или же, когда они ионизированы, моносахаратные формы могут взаимодействовать с выбранными катионами, имеющими степень окисления от +1 до +3. Глицеральдегид представляет собой самую простую структуру, которая демонстрирует такую альдо-группу, в то время как дигидроксиацетон служит в качестве соответствующего примера кето-группы. Практические расширения таких структур с шестью атомами углерода принимают во внимание описательную базу из двух классификаций углеводов, где одна из форм представляет собой альдозы, а другая - кетозы. Альдозы и кетозы, соответственно, представлены такими моносахаридами, как глюкоза или фруктоза. При наличии множества возможных продуктов реакций внутри молекул и между молекулами, происходящих из моносахаридов, включая продукт окисления глюкозы, известный как глюконовая кислота, попытки создания комплекса железа с сахаратами могут привести к созданию АГЧ. Для целей настоящего изобретения, АГЧ рассматриваются как более химически сложный вариант воплощения гематинового железа, чем предполагается при использовании обобщенного названия комплекс глюконата натрия железа(III) в сахарозе (SFGCS) или комплекс гидрат окиси железа(III)-сахароза (FHSC), и по этой причине обозначения, включающие в себя комплекс железо-сахарид или носитель для доставки комплекса сахарид-железо или сахарид-железо, используются взаимозаменяемо с АГЧ. Следовательно, внутри- и междумолекулярные реакции или ассоциации при реакциях моносахаридов с железом во время синтеза гематиновых частиц могут случайным образом приводить к получению большого количества структурных разновидностей (видов) частиц с гематиновыми свойствами, которые охватываются настоящим изобретением. 

Как правило, комплексы железо-декстран обеспечивают доставку до 100 мг Fe(III)/2,0 миллилитра (мл) инъектируемой жидкости, при этом комплексы железо-сахарид могут обеспечивать доставку 50-120 мг Fe(III)/5,0 мл объема, как коммерчески приготавливается в стандартной единичной дозе. После изготовления многие из этих продуктов комплексов железо-сахарид содержат 10-40 масс./объем.% негематиновых наполнителей, а также побочных продуктов реакции синтеза.

Хотя некоторые гематиновые агенты имеют установленный компендиальный статус, т.е. внесены перечни, содержащие краткие характеристики лекарственных средств и составленные под эгидой Фармакопеи Соединенных Штатов Америки (USP) или National Formulary (NF), комплексы железо-сахарид не имеют признанных компендиальных ссылок, стандартизованной характеристики молекулярной идентичности или документированной молекулярной специфичности, уникальной для активных гематиновых частиц. Это говорит о том, что носитель для доставки железа в недекстрановых гематиновых соединениях, таких как SFGCS или FHSC, ранее не был адекватно очищен и выделен из наполнителей, сопутствующих производству, с тем, чтобы сделать возможной подробную характеризацию. Как следствие, не был разработан и аттестованный эталонный стандарт или не содержащий наполнителя контрольный показатель аналитического качества, способный к характеризации одного желаемого гематинового агента среди других, имеющих неопределенные характеристики. Со времени объединения усилий USP и NF в 1975 году для создания компендиальных перечней USP-NF лекарственных средств, эталонные стандарты и аналитические протоколы разработаны для более чем 3800 фармацевтических препаратов, хотя 35% имеющихся на рынке фармацевтических препаратов все еще не включены в перечень USP-NF. Гематиновые фармацевтические препараты, такие как SFGCS и FHSC, попадают в эту последнюю категорию. Этой проблеме была посвящена недавно вышедшая публикация "Raising the Bar for Quality Drugs", pp. 26-31, Chemical and Engineering News, American Chemical Society, March 19, 2001. Как и в случае иммунных и анафилактических реакций, вызываемых специфичными антигенами, тонкая линия молекулярной специфичности и композиционной дифференциации может отделить уровень, не вызывающий отрицательных воздействий, для одной гематиновой активной молекулярной структуры и наполнителей от другой, которая может вызывать такие отрицательные реакции. Таким образом, существует необходимость в идентификации особенностей, которые документируют отличия характеристик безопасности и эффективности для одного гематинового соединения от других, когда лишь немногое известно о носителе для доставки железа, наполнителях, представляющих собой избыток исходных реагентов для синтеза или побочные продукты реакций синтеза гематиновых соединений. Более того, не существует долговременных подробных архивов образцов или данных, полученных с использованием современных аналитических инструментов, которые значимо характеризуют химическую природу даже наиболее безопасных комплексов железо-сахарид для парентеральной доставки. Более того, до сих пор не была выявлена корреляция между изменениями нормальных условий производства гематиновых соединений и их последующими эффектами, идентифицируемыми в виде изменений химической структуры выделяемого фармакологического агента. Способы по настоящему изобретению направлены на решение этих задач.

Настоящее изобретение может также обеспечить аналитическую базу для рутинного протокола, предназначенного для получения «отпечатков пальцев», т.е. характеризации комплексов железо-сахарид, таких как SFGCS, FHSC и другие, а также, для выявления различных конкурирующих продуктов и структурных преобразований, проявляемых индивидуальным продуктом.

Необходимость в характеризации АГЧ также отражается в требованиях контроля качества процессов производства, в особенности там, где эндотермические условия и проблемы с переносом тепла могут воздействовать на качество конечного продукта. Каким бы не был патентованный процесс синтеза, возможные побочные продукты реакции, идущей с потреблением тепла или реакции Штрекера, которые присутствуют в некоторых коммерческих недекстрановых продуктах, говорят о том, что образование гематинового продукта является обусловленным по меньшей мере в некоторой степени контролируемым подводом тепла в процессе производства. Такие наполнители не образовывались бы, если бы были не нужны температуры процесса, меньшие, чем приблизительно 50°C. Из этого следует, что качество продукта является до некоторой степени связанным со скоростями переноса тепла и продолжительностью воздействия тепла. Когда продукты являются особенно чувствительными к условиям тепловой обработки, знание «профиля» наполнителей (т.е. их качественного и количественного состава) может также обеспечить значительное представление о качестве продукта активного фармакологического вещества. Другими словами, мониторинг безопасного и эффективного фармакологического агента может также проводиться по природе и постоянству присутствия наполнителя в лекарственном средстве, когда оно появляется на рынке.

Аналитические исследования комплексов железо-сахарид, включающих в себя АГЧ и сосуществующие с ними наполнители, затрудняются такими факторами, как низкая концентрация, молекулярные взаимодействия, перекрывание аналитических сигналов и так далее. Как для SFGCS, так и для FHSC аналитическими проблемами являются высокие концентрации гидрофильных наполнителей, включая избыточные исходные реагенты и побочные продукты реакции, а также постреакционные побочные продукты, от которых соответствующие им АГЧ не были ранее отделены или охарактеризованы в терминах их индивидуальных свойств. Эталонные стандарты для фармацевтических препаратов должны соответствовать практическим протоколам, которые являются доступными при рутинных исследованиях с использованием методов, которые являются аналитически различающими (селективными) и способны подвергаться проверке и сравнению. Необходимость в таких методах все еще существует, и применение настоящего изобретения может облегчить совместимость с такими протоколами, а также проверку постоянства производства и стабильности продукта.

Сущность изобретения

Предложен способ мониторинга продукта комплекса железо-сахарид, содержащего по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, причем такой мониторинг осуществляется в течение времени, выбранного из группы, состоящей из: (a) во время процесса производства комплекса; (b) при завершении процесса производства комплекса и (c) после производства комплекса, при этом способ включает в себя сравнение аналитического отклика по меньшей мере одного вида активных гематиновых частиц на стандарт, соответствующий указанному по меньшей мере одному виду частиц. Такой стандарт может быть получен, например, путем очистки гематиновой композиции, содержащей комплекс железо-сахарид в разбавителе, как правило в воде, при этом комплекс содержит по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц и по меньшей мере один наполнитель. Способ очистки включает в себя: (1) отделение указанного по меньшей мере одного вида активных гематиновых частиц от указанного по меньшей мере одного наполнителя; и, при необходимости, (2) сушку вымораживанием указанного по меньшей мере одного вида активных гематиновых частиц. Отделение может производиться, например, путем использования хроматографической колонки. К очищенному стандарту могут быть применены различные сложные и мощные аналитические инструменты, тем самым давая возможность для мониторинга процессов производства и стабильности получаемого продукта, а также для облегчения разработки новых и усовершенствованных гематиновых соединений. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает комплекс железо-сахарид, выбранный из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III) в сахарозе, комплекса глюконата натрия железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III), где указанный комплекс, по существу, не содержит наполнителей. После производства по существу не содержащий наполнителя комплекс в виде композиции для парентерального введения или в виде продукта, полученного сушкой вымораживанием, может быть стабильным при хранении в течение длительных периодов, например, до пяти лет или более.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 демонстрирует хроматографическую характеристику, полученную для выделенных (отделенных) и очищенных АГЧ или первичного эталонного стандарта комплекса железо-сахарид, выделенного в виде фракции 1.

Фиг.2 демонстрирует хроматографическую характеристику, полученную для четырех выделенных наполнителей во фракции 2, включающей в себя добавленное малое количество АГЧ или первичного эталонного стандарта.

Фиг.3 демонстрирует аналитические результаты показателя преломления (ПП) и рассеяния лазерного света (РЛС) для образца комплекса железо-сахарид, разделенного на фракцию 1 (АГЧ) и фракцию 2 (наполнители) с использованием жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД).

Фиг.4 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные на основе анализа с помощью ЖХВД для коммерческого образца комплекса железо-сахарид и указывающие на структурные отклонения от АГЧ или от первичного эталонного стандарта, показываемые в виде пика агрегатов активных гематиновых частиц (АГЧАП).

Фиг.5 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные путем анализа с помощью ЖХВД для второго коммерческого образца комплекса железо-сахарид и указывающие на структурные отклонения от АГЧ или первичного эталонного стандарта, показываемые в виде пика агрегатов активных гематиновых частиц (АГЧАП).

Фиг.6 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные на основе анализа с помощью ЖХВД для образца комплекса железо-сахарид и показывающие пик агрегатов железа (АГЧАПВПП1) через интервал времени 1 после его производства.

Фиг.7 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные на основе анализа с помощью ЖХВД для образца комплекса железо-сахарид и показывающие пик агрегатов железа (АГЧАПВПП2) через интервал времени 2 после его производства. 

Фиг.8 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные на основе анализа с помощью ЖХВД для образца комплекса железо-сахарид и показывающие пик агрегатов железа (АГЧАПВПП3) через интервал времени 3 после его производства.

Фиг.9 демонстрирует данные РЛС и ПП, полученные на основе анализа с помощью ЖХВД для образца комплекса железо-сахарид и показывающие пик агрегатов железа (АГЧАПВПП4) через интервал времени 4 после его производства.

Фиг.10 демонстрирует хроматографическую характеристику для комплекса железо-сахарид, выделенного в виде фракции 1, лиофилизированного, растворенного повторно и проанализированного с использованием ЖХВД для получения ПП и РЛС.

Подробное описание

До момента раскрытия настоящего изобретения АГЧ, ответственные за парентеральную доставку железа, не были выделены из их наполнителей соответствующим образом с контролируемой, воспроизводимой чистотой. Такое смешивание наполнителей с АГЧ затрудняет разработку улучшенных гематиновых продуктов, а также характеризацию АГЧ. С точки зрения усовершенствованных способов, описанных здесь, обеспечиваются возможности для аналитического мониторинга комплекса железо-сахарид, проводимого для выяснения соответствия продукта спецификациям производства, для определения показателей стабильности при хранении и для сравнения свойств продукта от партии к партии с использованием аттестованного эталонного стандарта. Такой аттестованный эталонный стандарт не был доступен ранее, в частности, потому, что АГЧ не были до сих пор выделены. Способы по настоящему изобретению дают возможность для эффективного выделения терапевтически активных АГЧ из смеси с наполнителями и их концентрирования, а затем, по желанию, для сушки или лиофилизации. Настоящее изобретение предусматривает информацию, способы и аналитические детали для приготовления, характеризации и использования комплекса глюконата натрия железа(III) в сахарозе (SFGCS), комплекса гидрат окиси железа(III)-сахароза (FHSC) и сахаратов железа. Эти материалы упоминаются в целом как комплексы железо-сахарид или гематиновые соединения. Оно также предусматривает способы создания эталонных стандартов для этих материалов, которые до этого не существовали. Настоящее изобретение также предусматривает аналитическую базу для рутинного распознавания (установления различий) в сочетании с производством и непрерывным мониторингом этих продуктов после их выделения (получения). Аналитические и другие способы, описанные здесь, являются, в целом, применимыми к комплексам железо-сахарид, включая коммерческие и непатентованные комплексы железо-сахарид, а также современные коммерческие комплексы железо-сахарид для парентерального введения, которые осуществляют гематиновую функцию. 

До разработки описанных здесь способов не было доступных стандартов для комплексов железо-сахарид, поскольку не было способа для выделения, очистки и характеризации АГЧ без излишнего воздействия на АГЧ или их разрушения. Однако неразрушающая характеризация АГЧ с использованием жидкостной хроматографии высокого давления в сочетании с рассеянием лазерного света создает аналитический метод для безопасной и точной характеризации таких комплексов сахарид-железо. В соединении с процессом выделения и очистки, рассмотренным здесь, теперь существует способ для создания эталонных стандартов АГЧ, при этом с дополнительной возможностью использования таких материалов при описании продуктов.

В соответствии с настоящим изобретением, способ для характеризации АГЧ в отсутствие их наполнителей включает в себя разделение АГЧ и ассоциированных наполнителей по меньшей мере на две фракции. Поскольку АГЧ, как правило, присутствуют в очень низких концентрациях, то после выделения является также предпочтительным концентрирование АГЧ с тем, чтобы предоставить возможность для их подробного аналитического исследования. Хотя АГЧ подвержены деградации, они могут быть сконцентрированы при условии, что гидрофильные наполнители, по существу, удаляются из композиции перед концентрированием или во время его. Концентрирование может осуществляться путем сушки и, предпочтительно, путем лиофилизации, но могут быть использованы и другие способы. Взаимодействия со слабой связью между электронами, такие как водородная связь между водой и наполнителями, доставляет проблемы при выделении и сушке АГЧ. После получения, например в форме, пригодной для парентерального введения, АГЧ, как правило, присутствуют в водной системе, которая имеет более низкую активность воды (Aw), чем вода, не содержащая растворенных веществ, то есть чистая вода. Как правило, принимается, что не содержащая растворенных веществ вода имеет значение Aw, равное 1,0 или близкое к нему. Активность воды представляет собой параметр, соответствующий доступности воды, присутствующей в веществе или в композиции, для участия в физических, химических и биологических процессах. Активность воды понижается вследствие присутствия растворимых в воде или гидрофильных веществ, в особенности таких, которые имеют низкую молекулярную массу. Другими словами, часть присутствующей воды, соответствующая той доле воды, которая служит для связывания или растворения веществ, является в других случаях недоступной. Как следствие, активность воды уменьшается, когда увеличивается число и/или концентрация растворенных или связанных веществ. Как это часто бывает в пищевой и фармацевтической промышленности, повышенные значения активности воды ассоциируются с химической и биологической деградацией, так что водорастворимые или гидрофильные вещества добавляются для уменьшения значения Aw. В настоящем изобретении растворенные вещества и/или коллоиды, включая материалы, суспендированные или диспергированные в водной композиции, а также включая сахаридные наполнители, сопутствующие АГЧ, взаимодействуют с водой, например, они являются гидрофильными или они могут образовывать водородную связь. Такие вещества уменьшают значение Aw присутствующей воды до значения, меньшего, чем 1,0. Пока гидрофильные наполнители присутствуют в воде, в которой присутствуют АГЧ, часть воды остается связанной с такими наполнителями, и удаление воды из композиции, содержащей АГЧ, сопровождающееся ее (композиции) концентрированием, не может достигнуть приемлемого значения. Как следствие, выделение гидрофильных наполнителей из АГЧ увеличивает значение Aw до 1,0 в фазе или фракции, содержащей АГЧ, и облегчает концентрирование, сушку и анализ этих предпочтительных частиц.

Воздействия растворенных веществ на воду в системах, содержащих SFGCS и FHSC, непосредственно влияет на поведение этих частиц при сушке, включая лиофилизацию, поскольку понижение концентраций уходящих из них гидрофильных веществ и наполнителей сопровождается повышением давления паров воды и связанным с этим увеличением Aw. Концепция активности воды, выражаемой как Aw, находит свое наиболее значительное использование в области науки о пищевых продуктах (смотри, например, "Principles of Food Science", edited by O.R. Fennema, "Part II, Physical Principles of Food Preservation", M. Karel et al., pp. 237-263, Marcel Dekker, Inc. 1975; Encyclopedia of Food Science, edited by M.S. Peterson et al., "Water Activity in Relation Food", D.H. Chou, pp.852-857, Avi Publ. Co., Inc., 1978, каждая из них включается сюда во всей их полноте). Предположение заключается в том, что существует взаимосвязь между химическими и физическими процессами, которые могут происходить при хранении пищевых продуктов, и количеством и состоянием воды в пищевых продуктах. Такие же принципы могут быть применены к другим веществам или композициям, в которых присутствует вода и которые могут подвергаться воздействию воды. Вода, присутствующая в композиции в виде растворителя, разбавителя или чего-то иного, может характеризоваться как свободная (несвязанная), или связанная до различной степени с другими соединениями, например, в данном случае с наполнителями или АГЧ. Различные способы могут быть использованы для определения степени, до которой вода является связанной, включая определение количества незамерзшей воды в водосодержащей композиции при температуре ниже 0°C, измерение с помощью ядерного магнитного резонанса, определение диэлектрических свойств и измерение давления паров; последняя методика является предпочтительной благодаря ее простоте. В этом способе активность воды определяется как отношение парциального давления воды в (над) композиции или соединении, в котором присутствует вода, к давлению паров чистой воды при данной температуре. Это следует из закона Рауля, где давление (Р) паров воды, присутствующей в растворе, сравнивается с давлением (P0) паров чистой воды (не содержащей растворенных веществ). Поскольку отношение P/P0 все больше опускается ниже 1,0, значение A w становится меньше, энтропия состояния для такой воды уменьшается, давление ее паров понижается, предположительно, вследствие увеличения взаимодействий связывания вода - растворенное вещество, и удаление паровой фазы из воды становится более трудным. Эти условия влияют на процессы сушки, такие как лиофилизация. Кроме того, в сложных смесях, другими словами, в тех смесях, где химические соединения или комплексы могут не быть полностью растворенными или не присутствовать в форме истинного раствора, могут происходить значительные отклонения от выражения закона Рауля для идеальных растворов, и, кроме того, активность воды для компонентов, составляющих композицию, может различаться. Это также наблюдается в многофазных композициях, где перенос или диффузия воды от компонента, в котором Aw выше, к тому, где она ниже, может происходить противоположным образом по отношению к тому, что может ожидаться в другом случае, основывающемся на концентрационных движущих силах (M. Karel et al., page 251). Необходимо также заметить, что когда сложная композиция сушится, концентрация растворенных веществ, имеющих различные уровни взаимодействия с водой, например, различные уровни водородной связи, может воздействовать сложным и изменчивым образом на способность к удалению воды. Это представляет собой еще одну важную причину для, по существу, отделения или выделения активных гематиновых частиц от/из их наполнителей таким образом, что соответствующие условия процесса сушки могут определяться и контролироваться. Вода может сильно связываться с конкретными активными центрами на соединениях, включая гидроксильные группы полисахаридов, карбонильные и аминогруппы, а также с другими группами, на которых вода может удерживаться с помощью водородной связи, с помощью связей ион-диполь или с помощью других сильных взаимодействий. По этой причине в настоящем случае вода может связываться с конкретными активными центрами на АГЧ и наполнителях, например, в виде монослоя. Такая вода может присутствовать в виде незамерзающей воды, если только температуры не опускаются значительно ниже 0°C; кроме того, она может присутствовать в виде нерастворяющей воды. В данных композициях вода, как известно, сильно связывается с сахарозой, так что значение Aw в сахароза-содержащей композиции понижается. По этой причине на сушку, в особенности на сушку вымораживанием (подробно описанную ниже), может оказываться отрицательное воздействие. 

Независимо от того, получен ли продукт лиофилизацией (сушкой вымораживанием) или нет, способность к приготовлению очищенного АГЧ в виде отдельного вещества обеспечивает значительные возможности для определения химических и структурных особенностей, которые характеризуют такие гематиновые продукты. При установлении проверяемых и воспроизводимых параметров для такого гематинового соединения является возможным установление рамок контроля качества, например, однородности АГЧ от партии к партии. Отклонения от проверенной структурной однородности в АГЧ может быть использовано в качестве показателя стабильности при хранении и для способствования идентификации причинно-следственных связей между параметрами процессов производства. Способность к выделению и аналитической характеризации этих агентов с использованием современной технологии, в частности, рассеяния лазерного света, помогает при определении свойств таких комплексов железо-сахарид.

Очень немногое известно о синтезе комплексов железо-сахарид для использования в качестве гематиновых соединений, поскольку такие процессы синтеза, как правило, основываются на патентованных способах. Подобным же образом, существует только небольшая аналитическая информация, доступная для таких комплексов. Активные фармакологические гематиновые частицы или носитель для доставки железа в гематиновом соединении, как предполагается, составляет менее чем пять процентов от общего количества твердого продукта в соответствии с измерениями массы к объему, и его содержание может не превышать 1,0 процента. Таким образом, в коммерческих продуктах измерение характеристик АГЧ после получения, как правило, осуществляется в присутствии большого процентного содержания гидрофильных наполнителей. Такие низкие концентрации уникального носителя для доставки железа(III) в присутствии больших количеств наполнителей представляют собой проблему при характеризации АГЧ. Кроме того, не существует эталонных стандартов, установленных для АГЧ, поскольку, как предполагается, они настолько нестабильны, что не могут быть выделены для анализа. При эффективном выделении АГЧ из их наполнителей на основе способов, описывающихся здесь, такие способы могут быть расширены с тем, чтобы разрабатывать усовершенствованные гематиновые агенты сами по себе или в смеси с другими фармакологическими агентами. Например, очищенные АГЧ могут быть объединены с эритропоэтином или другими полезными лекарственными средствами.

Доступ к не содержащим наполнителей АГЧ делает возможным более точный аналитический мониторинг АГЧ и их фармацевтических характеристик. Более того, для тех фармацевтических препаратов, в которых наполнители занимают высокий процент от общей массы твердых продуктов, способность к независимому мониторингу таких наполнителей является, подобным же образом, важной для таких задач, как контроль качества, рабочие характеристики при производстве и клинические характеристики. Неожиданные клинические воздействия могут быть следствием ранее незамеченных или изменившихся распределений и типов наполнителей, которые появляются во время производства. Для пищевых систем возникновение соединений побочных продуктов из-за термических воздействий на сахариды обеспечивает существенное понимание адекватности и контроля стадий процесса производства. Таким проблемам для других продуктов посвящен патент США №5254474, H.-J. Kim, в то время как другие сосредотачиваются на термически генерируемых альдегидах в биотехнологических применениях, смотри C.M. Smales, D.S. Pepper, and D.C. James, 2000, "Mechanisms of protein modification during model antiviral heat-treatment bioprocessing of beta-lactoglobulin variant A in the presence of sucrose", Biotechnol. Appl. Biochem., Oct., 32 (Pt. 2) 109-119. Детектирование соединений, обусловленных термическими воздействиями на сахариды, при производстве фармацевтических препаратов может быть важным также в том случае, когда тепло является фактором синтеза. В самом деле, идентификация номинальных уровней наполнителей и их распределений в таких комплексах, как FHSC и SFGCS, может показать, что используются соответствующие условия для синтеза.

Настоящее изобретение предусматривает способы разделения гематиновых соединений, включая SFGCS, FHSC и сахараты железа, по меньшей мере на две различные фракции. Кроме того, эти способы являются в целом применимыми к продуктам, в которых железо поставляется в виде комплекса железо-сахарид или носителя для доставки железа, где железо удерживается в ассоциации с отрицательно заряженными карбоксильными группами, полученными из углеводов. Изначально, одна фракция гематиновых соединений, идентифицируемая здесь как фракция 1, содержит комплекс железо-сахарид или активные гематиновые частицы для доставки железа (АГЧ). Другая фракция, идентифицируемая здесь как фракция 2, содержит смесь по существу всех наполнителей, которые сосуществуют с АГЧ в исходной композиции, например, после синтеза или получения. Наполнители во фракции 2 могут представлять собой, например, гидрофильные органические или ионные соединения.

Растворенные вещества или суспендированные или диспергированные компоненты, присутствующие в жидких фракциях 1 или 2, могут быть использованы для целей подробного аналитического исследования или характеризации и могут быть дополнительно сконцентрированы или использованы в качестве исходных материалов при разработке новых продуктов. Настоящее изобретение описывает отдельные, но взаимосвязанные аналитические роли, которые эти фракции могут играть, с тем, чтобы облегчить разработку аттестованных эталонных стандартов, которые характеризуют (отличают) комплекс глюконата натрия железа(III) в сахарозе (SFGCS) и комплекс гидрат окиси железа(III)-сахароза (FHSC) среди (от) их наполнителей. Кроме того, настоящее изобретение описывает способы приготовления концентрированных, лиофилизированных и при необходимости повторно растворенных АГЧ. Разделение различных компонентов достигается сначала путем обеспечения наличия гематинового соединения, свеже синтезированного или коммерчески доступного, в виде АГЧ и наполнителей, объединенных в водной композиции (воде), а затем путем селективного перемещения или экстрагирования наполнителей таким образом, что они оказываются в, по существу, отдельной водной фазе. После появления этих двух фракций каждая из них может подвергаться подробной аналитической характеризации, дальнейшей очистке, если это желательно, и концентрированию с тем, чтобы достигнуть аналитических синтетический или производственных целей. 

Гематиновое соединение представляет собой класс фармацевтических препаратов, созданных для переноса гематопоэтически полезного железа; при этом фракция 1 содержит по меньшей мере от около 75 до менее чем около 100 масс.%, предпочтительно по меньшей мере от около 80 масс.% до около 99,9 масс.%, более предпочтительно по меньшей мере от около 90 масс.% до около 99,9 масс.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере от около 95 масс.% до около 99,9 масс.% АГЧ, предназначенных для парентеральной доставки, в то время как фракция 2 содержит, соответственно, низкие уровни АГЧ, например, менее около 0,1 масс.%, и по существу все наполнители, изначально присутствующие в гематиновой композиции.

1. Отделение АГЧ от сосуществующих с ними наполнителей.

По меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, АГЧ, может быть выделен из или по существу отделен от наполнителей, присутствующих в свежесинтезированном гематиновом соединении или в коммерчески доступном фармацевтическом препарате, характеризующемся как комплекс железо-сахарид. Такое выделение было достигнуто авторами настоящего изобретения вследствие определения ими нескольких значимых характеристик гематиновых композиций, которые содержат комплекс железо-сахарид, включая следующие: (1) является необходимым увеличение значений Aw АГЧ-содержащей фазы или фракции; (2) АГЧ демонстрируют по меньшей мере один детектируемый вид железосодержащих частиц с формульной массой от около 250000 до около 3000000 Дальтон или более; (3) изменения в производстве и разброс параметров стабильности могут приводить к присутствию более чем одного вида детектируемых железосодержащих частиц; (4) Fe(III)-содержащие частицы могут демонстрировать различные формы, как, например, измеряется с помощью рассеяния лазерного света; (5) Fe(III)-содержащие АГЧ имеют электрический заряд; и (6) Fe (III)-содержащие АГЧ могут иметь детектируемый (редокс) потенциал окисления-восстановления, указывающий на присутствие трехвалентного железа Fe(III) или двухвалентного железа Fe(II). Разделение АГЧ и их наполнителей, по меньшей мере, на две фракции может быть достигнуто путем использования одного или нескольких из следующих далее способов, причем с предварительной стабилизацией pH в пределах от около 6,0 до около 8,0, предпочтительно от около 6,4 до около 7,8, более предпочтительно от около 6,6 до около 7,6, например от около 6,8 до около 7,4, или без такой предварительной стабилизации:

1. Электрокинетическая миграция, где концентрация АГЧ зависит от протекания постоянного электрического тока, который вызывает осаждение электрически заряженных АГЧ на заряженной поверхности коллектора или внутри объема воды, в котором присутствует заряженная поверхность отдельно от их наполнителей.

2. Мембранная технология на электрокинетической основе, где катод и анод помещаются в водной системе, разделенной на отделения с помощью полупроницаемой мембраны. Постоянный ток, приложенный через мембрану, вызывает концентрирование электрически заряженных АГЧ на соответствующем электроде благодаря притяжению между противоположными зарядами. Такое концентрирование АГЧ на одном электроде в одном отделении дает возможность для диализного удаления гидрофильных углеводов наполнителей через полупроницаемую мембрану в соседнее отделение. Предпочтительные полупроницаемые мембраны включают в себя целлюлозу, ацетат целлюлозы, сложный эфир целлюлозы или регенерированную целлюлозу. Для удерживания АГЧ в одном отделении мембрана имеет предпочтительную эксклюзионную молекулярную массу (максимальная молекулярная масса вещества, способного проникнуть в/через мембрану) от около 90000 до около 300000, предпочтительно от около 150000 до около 200000. Предпочтительные условия для указанного способа включают в себя использование дистиллированной деионизованной воды при значении pH от около 7,5 до около 9,8; давление около 1,0 атм и температуру от около 2°C до около 50°C. Скорость удаления гидрофильных наполнителей с помощью диализа может быть улучшена с помощью частой замены водной среды для диализа. Процесс обычно описывается с помощью закона Фика: F=-DA(dc/dx), где F=общий поток вещества; D представляет собой коэффициент диффузии частиц в данной среде, например, в воде; A представляет собой площадь поверхности, доступную для диффузии, и dc/dx представляет собой градиент концентрации наполнителей с разных сторон мембраны.

3. Технология капиллярного электрофореза, которая концентрирует АГЧ отдельно от сосуществующих с ними наполнителей. Капиллярный электрофорез, иногда упоминаемый как капиллярный зонный электрофорез, основывается на введении электрически заряженного анализируемого вещества в капилляр из кварцевого стекла с размерами от около 50 до около 75 микрон в диаметре и от около 50 до около 100 см в длину, к которому прикладывается напряжение вплоть до около 30 киловольт. Дифференциальное (с различными скоростями) электрокинетическое перемещение заряженных веществ в композиции может детектироваться и регистрироваться с помощью различных способов, описанных здесь, включая спектрофотометрию УФ-видимого света, флуоресценцию и масс-спектрометрию. Конечные положения электрически заряженных веществ в капилляре при миграции могут документироваться или записываться в виде электрофоретограммы. Этот способ особенно пригоден благодаря заметному электрическому заряду АГЧ в комплексах железо-сахарид.

4. Колоночная хроматография, которая представляет собой особенно предпочтительный процесс для селективного выделения АГЧ. Благодаря дискретности (узкому диапазону разброса) формульных масс, размеров, формы и заряда АГЧ, в противоположность сосуществующим наполнителям, АГЧ участвуют в различных взаимодействиях с неподвижной фазой, когда жидкий носитель или элюент (например, вода) переносит их над твердой набивкой и/или сквозь нее. Таким образом, различные скорости диффузии или миграции, ответственные за такие разделения, отражают относительные различия в электрическом заряде и/или размере, которые замедляют или ускоряют элюирование этих веществ через хроматографическую систему. Разделения могут также регулироваться путем модификации пористости, электрического заряда или адсорбционных свойств поверхности неподвижной фазы. Такие хроматографические процессы могут осуществляться при температурах от около 3°C до около 150°C, предпочтительно от около 15°C до около 35°C, как правило при 25°C, с использованием водных или неводных растворителей, подающихся в колонки по схеме однократного или многократного последовательного прохождения. Хроматографическое распределение АГЧ может осуществляться при любом перепаде давления между входом и выходом колонки. Внутреннее давление колонки может изменяться в пределах от давления ниже атмосферного до любого давления, которое может выдержать колонка и материал неподвижной фазы. Предпочтительными являются рабочее давление, превышающее примерно одну атмосферу (0,1 МПа), но могут использоваться давления до около 10000 фунтов на квадратный дюйм (69 МПа). Элюенты, подающиеся в колонку, могут включать в себя любой растворитель или разбавитель до тех пор, пока АГЧ поддерживаются в виде комплекса железо-сахарид. Такие элюенты включают в себя C1-C6 алканолы (т.е. спирты), этаноламин, диметилсульфоксид, растворители на карбонильной основе, диметилформамид, воду, водные буферные растворы и различные смеси, включая растворы вода-сахарид. Использование от около 2,0 до около 25 массовых процентов первичного спирта может быть полезным для контроля возможного роста микробов. Могут быть использованы соответствующие материалы неподвижных фаз, являющиеся коммерчески доступными, включая пористую окись кремния, поперечно сшитые полиглюканы, идентифицируемые как декстраны, поперечно сшитые метакрилатные полимеры, сополимеры этиленгликоля и метакрилата, поперечно сшитый полистирол, окись алюминия, агарозные гели, циклодекстрины, а также катион- и анионобменные набивки. Особенно предпочтительными неподвижными фазами для колоночного хроматографического разделения АГЧ и их наполнителей в гематиновой композиции являются поперечно сшитый полиглюкан или декстран, коммерчески доступные под разными марками (с различной степенью чистоты), такими как Sephadex G-10, G-15 и G-25 (Amersham-Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ), а также в виде коммерческой колонки, идентифицируемой как GMPWXL и имеющей диаметр частиц 13 микрон с размерами пор от около 100 до около 2000 Ангстрем и полиметилметакрилатный каркас (Tosoh Biosep, Montgomeryville, PA). При использовании набивки с твердой неподвижной фазой предпочтительным является диаметр пор в пределах от около 30 до около 9000 Ангстрем, более предпочтительно от около 100 до около 8000 Ангстрем. Неподвижные фазы на основе декстрана являются особенно предпочтительными для объемного выделения АГЧ, например, с использованием хроматографии низкого давления, а полиметилметакрилатный каркас является особенно предпочтительным для аналитической характеризации АГЧ, например, с использованием ЖХВД.

Способы настоящего изобретения могут быть использованы по отдельности или в сочетании друг с другом для выделения АГЧ, которые являются ответственными, преимущественно или существенно, за желаемое фармакологическое воздействие, приписываемое FHSC или SFGCS. По существу выделенные и, следовательно, очищенные АГЧ служат в качестве основы для установления первичного эталонного стандарта. В свою очередь, первичный эталонный стандарт затем может обеспечить стандарт для использования при мониторинге производства и контроля качества фармацевтических препаратов. Если это желательно, АГЧ могут быть подвергнуты дополнительной очистке с использованием способов, рассмотренных здесь. Например, когда анализ гематиновой композиции с использованием ЖХВД в сочетании, например, с РЛС и ПП демонстрирует присутствие плеча или пика, предшествующего первичному эталонному стандарту АГЧ, может быть использован дополнительный способ разделения. Как описано здесь, такое плечо или вторичный пик может присутствовать для гематиновой композиции вследствие отклонения от предпочтительных условий производства или в результате хранения гематиновой композиции, в особенности, в присутствии гидрофильных наполнителей. Дополнительный процесс разделения или очистки включает в себя дополнительное выделение первого элюирующегося материала из препаративной хроматографической колонны с использованием аналитических результатов ЖХВД или данных, полученных непосредственно от детектора РЛС, в сочетании с препаративной хроматографической колонной. Таким путем значительный процент или по существу все нежелательные агрегированные АГЧ могут быть отделены от предпочтительных АГЧ. Когда присутствует исходный пик, не соответствующий АГЧ, и он четко отделен от характерного пика первичного эталонного стандарта АГЧ, по существу весь агрегированный материал, соответствующий такому пику, может быть отделен от желаемых АГЧ, например, во фракции 1. Когда на пике первичного эталонного стандарта АГЧ появляется плечо, то, как будет дополнительно обсуждаться ниже, отделение по существу всего нежелательного, например, агрегированного материала может осуществляться с необходимыми потерями предпочтительных АГЧ, или, наоборот, может удаляться не весь агрегированный материал. Степень разделения и очистки может определяться с использованием данных, генерируемых в соответствии со способами настоящего изобретения. По этой причине, в дополнение к удалению по существу всех низкомолекулярных, прежде всего, гидрофильных наполнителей, присутствующих в гематиновых композициях по настоящему изобретению, рассматриваемые здесь способы могут приводить к получению АГЧ, которые по существу очищены также и в отношении агрегированных комплексов железа.

Применяя концепцию настоящего изобретения, конкретные активные гематиновые частицы (АГЧ) могут быть отделены от наполнителей, поставляемых вместе с коммерчески доступными композициями для парентеральной доставки, характеризуемыми как комплексы железо-сахарид; выделенный материал может служить в качестве "первичного эталонного стандарта". Один из способов выделения АГЧ из сосуществующих наполнителей использует гель-проникающую хроматографию низкого давления (ГПХ). В настоящем изобретении низкое давление относится к работе хроматографической колонки примерно при давлении окружающей среды, включая давление, слегка превышающее давление окружающей среды вследствие прокачки жидкости через колонку с набивкой, к которой присоединены трубки с кранами и, необязательно, другое оборудование, включая один или несколько аналитических инструментов или детекторов. Эта методика может быть использована не только для анализа разделенных материалов, но также и для производства объемных количеств АГЧ с целью приготовления новых композиций для парентеральной доставки. Предпочтительно, набивка колонки содержит эпихлоргидрин-поперечносшитые полиглюканы с видимой молекулярной массой или характеристикой эксклюзии, превышающей примерно 5000 Дальтон, более предпочтительно с характеристикой эксклюзии, превышающей примерно 1500 Дальтон. Соответствующее оборудование является доступным от Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ. Кроме того, подходящими также являются ионообменные гели с необходимыми для ГПХ свойствами и колонки для аффинной хроматографии.

АГЧ, как правило, присутствуют во фракции 1, а все наполнители элюируются после них во фракции 2. Поскольку материал элюируется из колонки непрерывным образом, упоминание фракций основывается на той части элюируемого из колонки материала, в которой присутствуют по существу все предпочтительные или принадлежащие к первичному эталону АГЧ, которые были по существу отделены от их наполнителей. Один из способов для маркировки такого разделения элюирующегося материала заключается в обнаружении области, где сигнал РЛС для подвижной фазы становится близким или возвращается к фоновому значению после появления начального пика или пиков, указывающих на присутствие АГЧ и/или агрегированных АГЧ (как дополнительно обсуждается ниже). В предпочтительном способе резервуар с растворителем подает разбавитель или растворитель на водной основе под действием силы тяжести или в регулируемом потоке в хроматографическую колонку любого заданного диаметра или длины, но при условии, что длина по меньшей мере вдвое превышает диаметр. Колонка может конструироваться из стекла, нержавеющей стали, поликарбоната или другого материала, который не взаимодействует с композицией и используемыми разбавителями или растворителями и который способен удерживать в себе материал неподвижной хроматографической набивки, упоминаемый также как слой. Слой, как правило, содержит шарики, имеющие соответствующую пористость, однако другие формы слоя могут быть изготовлены in situ внутри самой колонки, такие как монолитный пористый полимер. При осуществлении процесса по настоящему изобретению сначала через слой пористой набивки в виде шариков, а также через свободный объем между ними пропускают растворитель (или разбавитель) на водной основе, упоминаемый как подвижная фаза. Когда поток жидкости или элюата покидает колонку, он проводится, например, через трубки, к одному или нескольким детекторам, которые анализируют поток для определения его фоновых свойств. Детекторы могут размещаться так, чтобы осуществлять работу с последовательным протеканием элюата от одного детектора к следующему, или так, чтобы работать с разделенным потоком, что делает возможным параллельный мониторинг с помощью множества детекторов. Такие детекторы позволяют получить характеристики элюата при измерении проходящего объемного потока в реальном времени. Соответствующие детекторы используются для измерения и регистрации таких свойств потока, как pH, электрическая проводимость, электрохимический потенциал восстановления, показатель преломления (ПП) и другие полезные аналитические свойства. Измеряющие поглощение в УФ- и видимой областях спектра (A) и показатель преломления (ПП) детекторы являются предпочтительными для измерения фоновых свойств подвижной фазы.

Введение комплекса железо-сахарид, например, коммерчески доступной композиции для парентерального введения, в водный поток, вводимый в верхнюю часть слоя набивки колонки, обеспечивает то, что различные составляющие композиции будут распределены по и внутри пористых хроматографических шариков. Без какого-либо желания ограничиваться теорией, предполагается, что разделение химических частиц различных размеров, составляющих комплекс железо-сахарид, происходит, например, с помощью эффекта сита, и возможно, с помощью взаимодействий на основе водородной связи. Химические частицы, большие, чем поры, не попадают в поры, и они первыми покидают колонку в относительно малом объеме элюата (Vel). Когда поток образца продолжает проходить через колонку, все более мелкие молекулы могут захватываться в порах, а затем покидать колонку в относительно большем объеме элюата (Ve2). Таким образом, большие частицы, такие как АГЧ в гематиновой композиции, элюируются первыми (Vel) во фракции 1, а более мелкие химические частицы наполнителей элюируются позднее (Ve2) во фракции 2. Такое хроматографическое разделение дает по меньшей мере два компонента или фракции, а именно АГЧ и их наполнителей, когда оно применяется к начальному объему гематиновой композиции для парентерального введения, включающей в себя такие компоненты, как SFGCS, FHSC. Как будет описано позднее, частицы побочных продуктов или продуктов деградации большего размера также могут элюироваться вместе с АГЧ или перед ними. Далее выделение АГЧ по существу завершается, так что они выделяются из исходных сосуществующих наполнителей, в частности, гидрофильных наполнителей, включая те наполнители, которые могут иметь различные флуоресцентные свойства. Как следствие, АГЧ получают в водной фракции с высоким значением Aw, т.е. во фракции 1, которая по существу не содержит наполнителей, при этом по существу все наполнители присутствуют во второй фракции, т.е. фракции 2, характеризующейся низкими значениями Aw. Динамика связывания водорода кислоты и основания (AH-B), т.е. динамика образования водородной связи в слое колонки может еще больше увеличить эффективный объем элюирования (Ve2) наполнителей из колонки в дополнение к их размерным взаимодействиям с хроматографическим слоем. Взаимодействие связывания водорода кислоты и основания в целом обсуждаются в следующих публикациях: Hodge J.E. and E.M. Osman, 1976, Chapter 3, in "Food Chemistry", O. R. Fennema Ed., Marcel Dekker, New York, pp. 92-96; and Zapsalis C. and R. A. Beck, 1985, "Food Chemistry and Nutritional Biochemistry", Chapter 10, John Wiley & Sons, pp. 588-591 (каждая из которых включается в качестве ссылки до разрешенной степени). Для целей настоящего изобретения термин "по существу не содержащий", когда он используется для обозначения выделенных и по существу не содержащих наполнителей АГЧ, означает, что содержащая АГЧ фракция включает в себя более чем около 75 масс.%, обычно более около 85 масс.%, предпочтительно более около 95 масс.%, более предпочтительно более около 98 масс.%, еще более предпочтительно более около 99 масс.%, наиболее предпочтительно более около 99,9 масс.% и вплоть до 100 масс.% АГЧ, элюированных из колонки (другими словами, в этой фракции могут присутствовать малые количества наполнителей, а общее количество элюированных АГЧ может не включать в себя небольшое или совсем малое количество АГЧ, которое может удерживаться в колонке, трубах, в детекторах, или теряется во время обработки). Соответственно, такие наполнители, присутствуют ли они изначально в композиции, вводимой в хроматографическую колонку, или, возможно, генерируются во время обработки, содержатся в следующей далее фракции наполнителей, т.е. фракции 2, и их количество рассчитывается путем вычитания указанных выше значений из значения 100 масс.%. Например, если фракция АГЧ содержит более 99,9 масс.% АГЧ, наполнители могут присутствовать в количестве менее около 0,1 масс.%.

Присутствие АГЧ в потоке хроматографического элюата по сравнению с наполнителями, как уже описано, может наблюдаться с использованием рассеяния лазерного света. Кроме того, профиль элюирования АГЧ и наполнителей может детектироваться путем использования одного или нескольких детекторов различных типов, выходные сигналы которых для потока элюата регистрируются одновременно. В предпочтительном способе используется один детектор, который является чувствительным к длине волны (), при этом используется детектор на основе поглощения УФ-видимого света, а другой детектор представляет собой чувствительный к концентрации детектор показателя преломления (ПП). Двойные независимые выходные сигналы от этих детекторов обрабатываются и отдельно регистрируются как две независимые оси ординат (оси y) с общей абсциссой (ось x), по которой отложены единицы кумулятивного объема элюата (например, миллилитры) или срезы (i), как обсуждалось ранее. Этот способ может идентифицировать тот момент, когда так называемая фракция 1, содержащая по существу все АГЧ, фактически заканчивается, а фракция 2, содержащая по существу все наполнители, фактически начинается. Экспериментальные доказательства демонстрируют, что фракции по существу разделяются во времени, так что могут быть получены АГЧ, по существу не содержащие наполнителей.

В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера коэффициент поглощения света связан с концентрацией конкретных поглощающих свет частиц. Коэффициент поглощения (A) поглощающих свет частиц выражается так:

A=bc Уравнение 5,

где c представляет собой концентрацию поглощающих свет частиц в молях на литр (моль/л); b представляет собой длину пути света через поглощающие свет частицы в сантиметрах (см); и представляет собой константу пропорциональности, известную как молярный коэффициент экстинкции. Эта константа пропорциональности является уникальной по отношению к поглощающим свет частицам при данной длине волны света. Этот фундаментальный закон принимает во внимание тот факт, что коэффициент поглощения света для поглощающих свет частиц на конкретной длине волны () преобразуется в количественную меру их молярной концентрации. Следовательно, положительное изменение, т.е. увеличение коэффициента поглощения на заданной длине волны для анализируемого вещества соответствует увеличению его молярной концентрации. Для мониторинга таких АГЧ, как SFGCS или FHSC, в потоке хроматографического элюента, предпочтительная длина волны составляет 435 нм благодаря высокому коэффициенту экстинкции комплексов железо-сахарид на этой длине волны, а именно 6,590log10. Для приготовления АГЧ, по существу не содержащих наполнителей, с использованием хроматографического разделения значение A430нм табулируется как функция объема элюата из колонки. Оно может быть преобразовано в профиль хроматографического элюирования, где значения A430нм по ординате (ось y) и объемы элюата (ось x) изображаются в зависимости друг от друга. Как обсуждалось, АГЧ большего размера элюируются из хроматографической колонки перед более мелкими наполнителями. Пока изменение коэффициента поглощения (A) по отношению к изменениям объема элюата (V) или, иначе говоря, A/V четко показывает положительное отношение (+A/V) выше фонового сигнала элюента, не содержащего растворенного вещества, концентрация АГЧ увеличивается в объеме элюата. Для отрицательного отношения (-A/V) верным является обратное утверждение. Когда отношение A/V совершает переход от (+) к (-), хроматографическое элюирование АГЧ достигает максимального значения в виде "хроматографического пика". Начиная с этой точки, когда хроматографический профиль продолжает демонстрировать отрицательное отношение (-A/V), концентрация АГЧ в объеме элюата уменьшается. Это является верным для концентраций АГЧ до тех пор, пока A430нм продолжает асимптотически уменьшаться и приближается к значению A430нм около 0,0. Поскольку это измерение сигнализирует окончание элюирования АГЧ, чувствительный к концентрации ПП-детектор начинает откликаться на увеличение количеств гидрофильных и других наполнителей, заключенных в элюате. Как и выше, положительное (+) изменение отношения ПП к изменениям объема (+ПП/V) сигнализирует об увеличении концентрации наполнителей. Такой собираемый объем элюата, когда A/V все еще демонстрирует отрицательное отношение (-A/V), асимптотически приближаясь к значению A около 0,0, а ПП-детектор начинает сигнализировать о положительном наклоне (+ПП/V), обозначает эффективную границу, на которой фракция 1 по существу заканчивается, а фракция 2 фактически начинается. Фракция 1 содержит АГЧ в среде с высоким значением Aw, а фракция 2 содержит гидрофильные и другие наполнители в среде с низким Aw . Таким образом определяется профиль элюирования.

Границы элюата, которые определяют разделение, когда фракция 1 по существу заканчивается, а фракция 2 фактически начинается, альтернативно могут быть определены путем измерения процента спектрального пропускания АГЧ в элюате колонки при 430 нм. Соответствующий инструмент для этой цели представляет собой систему "ColorQuest XE", изготавливаемую Hunter Associates Laboratory, Inc., Reston, VA. Увеличение пропускания света через элюат, когда присутствие АГЧ в элюате асимптотически приближается к нулю процентов, может указывать на достаточное разделение или окончание элюирования АГЧ. Последующее увеличение отклика ПП для потока элюата отмечает начало объема элюата, содержащего наполнители. В дополнительном альтернативном варианте воплощения линия раздела между областями, где фракция 1 по существу заканчивается, а фракция 2 фактически начинается, может быть определена путем измерения коэффициента поглощения A620нм с использованием антрона для потока элюата. Поскольку как АГЧ, так и наполнители имеют заметное поглощение декстрозного эквивалента (DE), детектируемое DE-значение A 620нм будет минимальным между фракцией 1 и фракцией 2. Принципы, которые лежат в основании этой аналитической концепции, описаны в R. Dreywood, "Qualitative Test for Carbohydrate Material," Indus. and Eng. Chem., Anal. Ed., 18:499 (1946); J.E. Hodge and B.T. Hofreiter, "determination of Reducing Sugars and Carbohydrate," Methods Carbohydrate Chem., 1:384-394 (1962); а позже в C. Zapsalis and R.A. Beck, "Food Chemistry and Nutritional Biochemistry," Chapter 6, John Wiley & Sons, pp. 353-354 (1985) (каждое из описаний которых включаются сюда до разрешенной степени).

Способы по настоящему изобретению дают возможность для приготовления больших произведенных партий (например, от больших, чем около 500 миллиграмм до равных или больших, чем около 1,0 грамм; или от около 1,0 грамма до около 10 грамм или более; от около 1,0 грамма до около 100 грамм или более; от около 1,0 грамм до около 1 кг или более; например, если это желательно, с помощью настоящего способа могут быть произведены сотни или даже тысячи килограммов) или малых аналитических образцов (от около 5,0 до около 500,0 миллиграммов) АГЧ, присутствующих в виде комплексов железо-сахарид любого типа. Поскольку АГЧ представляют собой предпочтительный компонент комплексированного железа, присутствующего в этих композициях для парентеральной доставки, способность к выделению АГЧ представляет собой основу для первичного эталонного стандарта. Выделение фракции 1 делает возможными дальнейшие подробные химические и/или структурные анализы; такие способы описаны здесь в других местах. Однако выделенные АГЧ, например фракция 1, а также наполнители, например фракция 2, могут дополнительно концентрироваться для подробных исследований.

Настоящее изобретение является также пригодным для производства малых количеств АГЧ (от меньших, чем около 1,0 мг до меньших, чем около 5,0 мг), предпочтительно, посредством жидкостной хроматографии высокого давления (или высокоэффективной хроматографии) (ЖХВД или ВЭЖХ). Соответствующая хроматографическая твердая набивка может быть использована для отделения АГЧ от их наполнителей. Это приводит к переносу АГЧ в гидродинамический объем внутри колонки, который демонстрирует высокие значения Aw, например, достигающие значения 1,0. Наполнители переносятся в гидродинамический объем с низкими значениями A w, имеющий низкое значение Aw, например, меньшее, чем значение для фазы, содержащей АГЧ. Принцип работы этого способа является сходным с хроматографическим способом низкого давления, описанным выше, но материалы неподвижного слоя колонки для метода ЖХВД являются более мелкодисперсными для того, чтобы они выдерживали давления от около 5000 до около 10000 фунтов на квадратный дюйм (от около 35 до около 69 МПа). Это приводит к более медленным скоростям потока элюата из колонки, но это более чем компенсируется высоким гидростатическим давлением. Неподвижный слой на основе окиси кремния, который зависит от явлений разделения анализируемых веществ на основе адсорбции-десорбции, может быть использован для отделения АГЧ от их наполнителей. Однако характеристики такого разделения на основе окиси кремния трудно контролировать, при этом оно требует аккуратного приготовления азид-содержащей водной подвижной фазы; как следствие, они приводят к большим аналитическим ошибкам. Кроме того, выпадение или осыпание частиц из слоев на основе окиси кремния осложняет или может препятствовать эффективному использованию детектора РЛС. Таким образом, полимерная колонка для ЖХВД, такая как колонка марки GMPWXL, изготавливаемая Tosoh Biosep, Montgomeryville, PA, которая использует водную подвижную фазу, является предпочтительной по сравнению с колонками на основе окиси кремния. Такой анализ с помощью ЖХВД, например, коммерчески выпускаемой формы комплекса железо-сахарид, требует предварительной фильтрации через фильтр с порами в 0,02 микрона, например, через неорганическую мембрану марки Anotop 25 (Whatman, Maidstone, UK).

2. Способы характеризации первичного эталонного стандарта АГЧ и сосуществующих наполнителей.

Анализ на железо демонстрирует, что более чем около 90% железа, предназначающегося для гематиновых целей, находится во фракции с высоким значением Aw, обозначаемой выше как фракция 1, как правило по меньшей мере от около 75 масс.% до менее чем около 100 масс.%, предпочтительно от около 80 масс.% до около 99,9 масс.%, например от около 90 масс.% до около 99,9 масс.%, от около 95 масс.% до около 99 масс.%, а наполнители находятся во фракции с низким значением Aw, обозначаемой как фракция 2. Атомы железа во фракции 1 могут быть количественно определены с помощью атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), но количественное определение железа с помощью одной только ААС не определяет гематиновую функциональность продуктов по настоящему изобретению.

Важная характеристика недекстрановых гематиновых соединений по настоящему изобретению основывается на их способности к доставке физиологически приемлемого или мягкого источника трехвалентного железа, т.е. Fe(III), предпочтительно, с помощью средств для парентеральной доставки. Эта композиция трехвалентного железа представляет собой парентерально приемлемые частицы, которые сохраняют свойства ассоциированного коллоида. Ассоциированный коллоид представляет собой обратимую химическую комбинацию, возникающую благодаря слабым силам химического связывания, в которой агрегировано вплоть до сотен молекул или ионов с формированием коллоидных структур с размерами от около 1 до около 2000 нанометров или более. Такие коллоиды ионов трехвалентного железа, взаимодействующие с сахаридными соединениями, демонстрируют направленную миграцию в электрическом поле, в дополнение к оптической активности, идентифицируемой с помощью рассеяния лазерного света (РЛС). Свойства РЛС, важные здесь, относятся к эффекту Тиндаля, согласно которому падающий луч света (I0), проходящий через коллоид, выходит из него под углом 90° к его исходному пути. Рассеяние света происходит только в том случае, если свет взаимодействует с макромолекулами, такими как крахмалы, белки или другие коллоидные частицы, т.е. если длина волны падающего света близка к размерам молекул. Рассеяние света может происходить за счет ослабляющей или деструктивной интерференции, когда рассеянные длины волн взаимодействуют, компенсируя друг друга, или за счет усиливающей или конструктивной интерференции, когда две длины волны света усиливают одна другую. Математическая обработка данных РЛС дает возможность для оценки размера и формы различных коллоидных частиц. Например, размер может оцениваться в терминах молекулярной массы для отдельной молекулы или формульной массы для многомолекулярного или ионного агрегата. В любом случае выражение для массы представляет собой сумму атомных масс всех атомов, присутствующих в таких структурах. Структурное разнообразие большинства агрегатов или молекул, таких как полимеры, является таким, что они существуют с некоторым частотным распределением по различным массам, как правило, выражаемым в виде распределения средних или усредненных молекулярных масс (molecular weight distribution, MWD). Помимо размера, важным параметром может быть форма коллоида. Например, если его форма представляет собой тонкий стержень, структуру в виде случайного неупорядоченного клубка или сферу, то его взаимодействие с другими молекулами или структурами может изменяться. РЛС, включая высокоугловое рассеяние лазерного света (ВУРЛС) или малоугловое рассеяние лазерного света (МУРЛС), в сочетании с одним или несколькими методами анализа с помощью детекторов, интегрированных в ЖХВД, может быть использовано для оценки комплексов железо-сахарид. Для целей настоящего изобретения ссылки на РЛС должны рассматриваться как включающие в себя ВУРЛС, при этом последний представляет собой предпочтительный тип детектора. Использование здесь измерений РЛС обеспечивает превосходный и предпочтительный аналитический метод для характеризации нормального комплекса железо-сахарид, или, говоря другими словами, комплекса, который представляет собой АГЧ, полученные в результате контролируемого соответствующим образом синтеза, или комплекса, который демонстрирует наличие продуктов распада или деградации. Из литературы известны фундаментальные математические соотношения и работа ЖХВД в сочетании с детекторами рассеяния лазерного света и показателя преломления для характеризации макромолекулярных структур и ассоциированных коллоидов (смотри P. Wyatt, Light scattering and absolute characterization of macromolecules, Analytica Chimica Acta. (1993) 272:1-40; включается в качестве ссылки до разрешенной степени). Как уже здесь обсуждалось, такие методики являются применимыми для комплексов железо-сахарид, содержащих АГЧ.

Сбор данных РЛС является особенно полезным для идентификации АГЧ в комплексах сахарид-железо, особенно тогда, когда требуется аттестованный аналитический эталонный стандарт. Данные РЛС могут быть получены для индивидуальной партии на основе выделенного образца, или же данные РЛС могут быть получены в ходе непрерывного процесса с использованием in-line анализа потока элюата, содержащего АГЧ, после их выделения с помощью жидкостной хроматографии. Другими словами, после того, как комплекс связанного с сахаридом трехвалентного железа был получен и исследован с помощью РЛС, в отдельности или в сочетании с другими способами, такими как те, которые описаны здесь, сравнения отдельных партий при непрерывном производстве с точки зрения формульной массы и морфологии фармакологических частиц могут проводиться рутинно. Характеризация особенностей формы и размера АГЧ может быть использована для мониторинга процессов производства АГЧ, качества продукта АГЧ и стабильности АГЧ с использованием алгоритмов РЛС, которые интегрируются (объединяются) с рабочим программным обеспечением ЖХВД, усиленной РЛС. В частности, как уже здесь рассматривалось, размерные свойства и форма структур так называемых нормальных АГЧ (например, материала первичного эталонного стандарта или предпочтительных АГЧ) и так называемых ненормальных АГЧ (например, деградировавших или агрегированных АГЧ) определяются по стандартному графику Дебая, генерируемому рабочим программным обеспечением, таким как ASTRA (Wyatt Techlogy Corp., Santa Barbara, CA.). Детали такого применения описаны в публикации P. Wyatt, Light scattering and absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta, 272:1-40 (1993), которая включается сюда в качестве ссылки до разрешенной степени. Было замечено, что предпочтительные АГЧ имеют в целом сферическую форму и размер около 10 нанометров или менее, в то время как деградировавшие или агрегированные АГЧ, такие как материал, который элюируется из хроматографической колонки перед предпочтительными АГЧ, как правило, имеют размер более 10 нанометров, например от около 10 до около 30 нанометров или более, например от около 20 до около 30 нанометров или более. Размер и форма могут быть важными параметрами для физиологической и метаболической толерантности, а также для распределения и размещения гематиновых соединений в тканях. Таким образом, применение способов РЛС является предпочтительным для рутинной характеризации (включая характеризацию после получения и во время хранения) и мониторинга производства гематиновых соединений по настоящему изобретению.

Рассеяние лазерного света АГЧ обеспечивает получение таких параметров характеризации, как абсолютная формульная масса или абсолютная молекулярная масса. Однако, поскольку АГЧ не являются мономолекулярными частицами, а вместо этого ведут себя как ассоциированный коллоид, использование абсолютной молекулярной массы является особенно предпочтительным. Такие измерения молекулярной массы с помощью РЛС являются предпочтительными по сравнению с другими способами оценки массы, которые дают так называемую относительную молекулярную массу. Измерения относительной молекулярной массы АГЧ не основываются на физических взаимодействиях света с АГЧ, зависящих от размера и формы, в качестве основы для определения их массы. Вместо этого, измерения относительной молекулярной массы основываются на стандартных методах эксклюзионной хроматографии (ЭХ, от англ. size exclusion chromatography), также иногда упоминаемой как гель-проникающая хроматография (ГПХ). Термины ЭХ и ГПХ далее используются взаимозаменяемо. При анализе с помощью ГПХ эффективный размер, а не формульная масса макромолекулы или агрегата (такого как АГЧ) определяет ее или его объем элюирования и выход из калиброванной хроматографической колонки. Следовательно, относительное элюирование и перенос АГЧ через колонку для ГПХ в сравнении с рядом калибровочных стандартов в виде узких зон выше и ниже ожидаемой массы АГЧ создает основу для присвоения относительной формульной массы железо-содержащему комплексу. При использовании этой концепции чувствительный к концентрации детектор, такой как детектор показателя преломления (ПП), использовался бы для детектирования АГЧ и его калибровочных стандартов, когда они элюируются из колонки. В качестве чувствительного к концентрации детектора (индикатора), измерения ПП основываются на изменениях показателей преломления света (n) при увеличении или уменьшении концентраций (c) анализируемого вещества (например, растворенного вещества) в соответствующем им потоке через ячейку детектора ПП. Через равномерно распределенные по времени интервалы отношения таких изменений в преломлении и концентрации регистрируются как значения dn/dc. Каждое значение dn/dc является уникальным для конкретного анализируемого или растворенного вещества, при этом значение dn/dc, характерное для одного вещества, a priori не является значением, универсально применимым к любому другому конкретному веществу. Такие значения dn/dc, зарегистрированные при элюировании известных калибровочных стандартов и неизвестных анализируемых веществ, могут собираться и регистрироваться через точные временные интервалы. Каждое измерение dn/dc в общем профиле элюирования колонки для жидкостной хроматографии упоминается как срез (i). Номер среза, его время элюирования или объем элюирования может быть использован для обозначения этого среза. Время элюирования для некоторого среза, умноженное на расход элюента в колонке, дает объем элюирования. Регистрация номеров срезов, в терминах ли объема или же номера, не влияет на общую значимость (важность) этой концепции регистрации данных. Таким образом, график dn/dc (ордината) в зависимости от номеров среза (абсцисса) в ходе измерения с помощью ГПХ дает профиль элюирования калибровочных стандартов по отношению к неизвестным веществам, которые могут не иметь никакого отношения друг к другу, но которые при этом имеют массы, детектируемые с помощью dn/dc и пригодные для инструментального мониторинга.

Поскольку стандартные процедуры ГПХ не распознают важных физических взаимодействий, общих для всех больших молекулярных или коллоидных структур, оценки массы с помощью ГПХ для АГЧ, присутствующих в SFGCS, FHSC или в других подобных гематиновых соединениях, могут быть подвержены аналитическим ошибкам. Кроме того, способы ГПХ на основе ПП не способны характеризовать форму и топологические особенности АГЧ, включая, например, структурное разветвление. Кроме того, оценки относительной формульной массы с использованием способов ГПХ, связанных с ПП, также подвержены разбросу данных, чувствительны к незначительным ошибкам аналитика и совершенно не чувствительны к разбросу частиц по размерам в ассоциированных коллоидах, которые имеют высокую плотность. Для ассоциированных коллоидов, и в частности, для FHSC и SFGCS, эти особенности являются важными, поскольку несахаридно агрегированные или связанные атомы железа могут сосуществовать вместе с желаемым комплексом железо-сахарид, содержащим АГЧ. Таким образом, является важным заметить, что ГПХ на основе ПП может обеспечить получение значений относительной формульной массы для анализируемых соединений АГЧ с разумным разбросом и разумной точностью, но этот способ упускает (не чувствует) других важных характеристик структуры АГЧ.

Как хорошо известно из принципов физики рассеяния света, изотропные частицы с малыми размерами, такие как макромолекулы и коллоиды, взаимодействуют со светом таким образом, что делают возможным вычисление их абсолютной массы и формы. Это верно для АГЧ, содержащихся в FHSC и SFGCS. В отличие от анализа на основе ГПХ-ПП, абсолютная формульная масса коллоидных частиц может быть определена вне зависимости от какой-либо калибровочной кривой, которая зависит от предварительно установленных градуированных стандартов молекулярной массы (M.J. Void and R.D. Void, 1964, "Colloid Chemistry," Reinhold, NY; и Zapsalis C. and R.A. Beck, 1985, "Food Chemistry and Nutritional Biochemistry," Chapter 8, John Wiley & Sons. pp. 507-547, причем последняя здесь и далее упоминается как Zacsalis and Beck, 1985) (каждая из них включается в качестве ссылки до разрешенной степени). Установлено, что интенсивность света, рассеянного частицей под углом (I ), зависит от интенсивности падающего луча света (I 0), длины пути света ( s) через объем, рассеивающий свет, и поляризуемости () частицы. Для неполяризованного света, уравнение записывается так:

R (1 + cos2)=I s 2/I0=8 4/(1 + cos2) Уравнение (1)

Термин R (1 + cos2) является основой для отношения Релея. Распространение этого подхода к измерению рассеяния света на очень разбавленные растворы частиц с размерами, меньшими, чем длина волны падающего света (I 0), дает выражение:

R =2 2 o 2[(- o)/C]2/L 4·CM=K*CM Уравнение (2)

где R представляет собой отношение Релея (R); представляет собой показатель преломления раствора, содержащего коллоидные частицы, o представляет собой показатель преломления растворителя без коллоидных частиц; C представляет собой концентрацию растворенного вещества в терминах массы на единицу объема; M представляет собой молекулярную или формульную массу соответственно для молекулы или коллоидной частицы; L представляет собой число Авогадро; представляет собой длину волны света; и K*=2 2 o 2 [(- o)/C]2/L 4 представляет собой оптическую постоянную. Это выражение дает основу для установления отношения Рэлея (R) или той доли падающего света (I0), которая рассеивается частицей, когда длина волны () падающего света является сравнимой с размером некоторых частиц или большей этого размера. Соответственно, R соотносится с формульной массой анализируемого вещества, такого как АГЧ в SFGCS, FHSC и в других комплексах железо-сахарид, на основе уравнений, описывающих физику явления рассеяния света, а не с помощью относительных сравнений с калибровочными кривыми ГПХ, полученными для совершенно других материалов, не связанных с ними. Независимо от геометрии детектора в устройстве для детектирования отношения Релея (R), когда падающий свет (I0) взаимодействует с частицами, выполняется выражение

R=K*CM Уравнение (3)

В соответствии с концепциями измерения в потоке элюата, подробно изложенными выше, в том случае, когда значения dn/dc собираются для систем на основе ГПХ-ПП, измерения отношения Релея (R) собираются для каждого среза, другими словами, для каждого значения "i", при этом отношение Рэлея Ri представляет собой просто произведение концентрации для каждого среза (Ci), молекулярной массы (Mi) и оптической постоянной (K*): 

Ri=K*CiMi Уравнение (4) 

Рассеяние света также дает возможность для характеризации структурного постоянства АГЧ в комплексах железо-сахарид на основе отношений асимметрии между светом, рассеянным под некоторым углом вперед, и светом, рассеянным под дополнительным к нему углом 180-(I /I180- ). Среди всех возможных углов рассеяния света углы около 45° и 135° служат в качестве инструктивных эталонных точек. Когда строится график зависимости I /I180- (ордината) от L/(абсцисса), структурная асимметрия для сфер, стержней и случайных клубков легко определяется путем обращения к ссылке Zapsalis and Beck, 1985, p.535.

Если АГЧ по существу выделены, например, в виде фракции 1, обсуждаемой выше, они могут быть собраны (a) в промышленных объемах или (b) в малых аналитических объемах, типичных для тех, которые находятся в потоках элюата при жидкостной хроматографии. В любом случае, способы РЛС дают предпочтительный аналитический способ для создания рутинного эталонного стандарта для любого комплекса железо-сахарид в этом классе фармацевтических препаратов.

Способность к получению очищенного АГЧ или комплекса железо-сахарид с использованием концепции настоящего изобретения позволяет подробно анализировать и характеризовать их, включая определение их коллоидных и молекулярных свойств. Соответствующие методы анализа и характеризации, применимые к АГЧ, и в частности, к SFGCS и FHSC, включают в себя: ультрафиолетовую (УФ) спектрофотометрию, спектрофотометрию видимого света (ВС) и объединенную УФ-ВС спектрофотометрию, включая методы с использованием фотодиодных матриц (ФДМ), инфракрасную (ИК) спектроскопию, электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), импульсную полярографию, энергодисперсионный рентгеновский анализ (EDS), круговой дихроизм (КД) и дисперсию оптического вращения (ДОВ), флуоресцентную спектроскопию, поляриметрию, анализ с помощью пиролиза и пиролитическую масс-спектрометрию, спектроскопию ядерного магнитного резонанса, дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), жидкостную хроматографию, объединенную с масс-спектрометрией (ЖХ-ГХ), методики лазерной десорбции из вспомогательной матрицы/ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-MS), анализ с использованием радиоактивных изотопов, включая радиоактивное железо, антитела к гематиновым веществам, капиллярный электрофорез и спектрометрию индуктивно связанной плазмы, атомно-абсорбционный анализ, электрохимический анализ, а также исследования хранения и стабильности при конкретном pH и целевую глюкозидную деградацию АГЧ с анализом сахаридных продуктов. В методе MALDI-MS лазерный свет используется для ионизации макромолекулярного анализируемого вещества и десорбции его ионов из матрицы образца в вакуумную систему. Этот метод используется для измерений массы разнообразных макромолекул в сочетании с масс-спектрометрией.

Кроме того, способность к разделению АГЧ по меньшей мере на две фракции, фракцию 1 (фракция с высокой Aw) и фракцию 2 (фракция с низкой Aw), также дает возможность для независимого анализа наполнителей, которые концентрируются во фракции 2. Отличительные «отпечатки пальцев» (т.е. свойства) наполнителей могут использоваться для характеризации АГЧ, а также вносить вклад в идентификацию продукта и мониторинг контроля качества, и для страховки. Нахождение и верификация типичных или ожидаемых наполнителей способствует стандартизации и мониторингу производства. Это увеличивает вероятность благоприятного использования пациентом в клинических условиях, где назначаются гематиновые соединения. Поскольку в типичных коммерческих композициях для парентеральной доставки наполнители могут составлять более 75 процентов от всех твердых продуктов, верификация и анализ наполнителей может представлять собой важную задачу. Более того, поскольку подвергающиеся термической обработке сахариды, как известно, производят идентифицируемые химические маркеры, которые отражают историю их обработки, они, а также избыточные реагенты и побочные продукты, получаемые во время производства гематиновых соединений (для целей настоящего изобретения все такие материалы в целом включаются в термин "наполнители"), могут быть использованы для мониторинга и характеризации как гематиновых продуктов, так и процессов, используемых для их производства. 

Существует, по меньшей мере, три возможных проявления, в которых ионы трехвалентного железа находятся в гематиновых комплексах железо-сахарид или взаимодействуют с ними. Во-первых, предпочтительный главный агент, а именно АГЧ, ведут себя как ассоциированный коллоид, при этом они представляют собой желаемый носитель для доставки железо-сахарида. Во-вторых, агрегаты с высокой формульной массой могут образовываться из АГЧ, и они также могут детектироваться. В-третьих, железо может существовать в виде комплекса с избыточными сахаридными реагентами и/или побочными продуктами, образовавшимися на стадиях реакций синтеза. Эта форма железа может находиться вместе с гидрофильными наполнителями во фракции 2. Является особенно предпочтительным, чтобы композиции для парентерального введения, так же как и фракция (2), подвергались мониторингу на: (a) содержание железа, (b) остаточные количества сахаридных реагентов и (c) свидетельства присутствия побочных продуктов температурно-зависимых реакций синтеза. Особенно предпочтительный способ мониторинга таких анализируемых веществ включает в себя использование жидкостного хроматографического анализа с in-line детектированием показателя преломления (ПП) в потоке элюата с помощью по меньшей мере одного из следующих методов: рассеяния лазерного света (РЛС), электрохимического детектирования (ЭХД), УФ-ВС спектрофотометрии на основе фотодиодной матрицы (ФДМ), инфракрасной (ИК) спектроскопии и жидкостной хроматографии, объединенной с масс-спектрометрией (ЖХ-МС), и, при необходимости, одного или нескольких методов анализа и характеризации, описанных выше. В то время, как ПП представляет собой чувствительный к концентрации детектор или индикатор, который делает возможным количественное определение наполнителей-сахаридов, электрохимические детекторы (ЭХД) откликаются на соединения, содержащие металлы и неметаллы, имеющие характерные электрохимические потенциалы окисления-восстановления, а УФ-ВС анализ на основе ФДМ делает возможным детектирование термически получаемых сахаридных производных в дополнение к частицам комплексов железа с низкой формульной массой.

Способы настоящего изобретения дополнительно включают в себя способы характеризации АГЧ и сосуществующих с ними наполнителей. Применение ЖХВД с использованием полимерной колонки, описанной выше, к заранее приготовленному образцу фракции 1, содержащей АГЧ, в сочетании со спаренными детекторами ПП и РЛС в потоке элюата после ЖХВД дает результаты, иллюстрирующиеся на фиг.1. Эта фигура демонстрирует хроматографическую характеристику для выделенных и очищенных АГЧ, которые присутствуют во фракции 1 и которые, кроме того, не содержат наполнителей. Такая характеристика элюирования ЖХВД представляет собой предпочтительный результат для произведенного гематинового продукта, содержащего АГЧ, например, продукта, выпускаемого в герметичной стеклянной ампуле. Фиг.2 иллюстрирует хроматографическую характеристику для четырех наполнителей, присутствующих во фракции 2, полученной из того же образца, который дает фракцию 1. В этом исследовании или тесте малое количество АГЧ из фракции 1 намеренно вводится во фракцию 2, так что могут наблюдаться относительные положения пиков наполнителей и АГЧ. На фиг.2 и 3 можно заметить, что наполнители лучше отслеживаются с помощью ПП-детектора, поскольку ПП представляет собой чувствительное к концентрации свойство, в то время как РЛС-детектор является чувствительным к массе и откликается на АГЧ лучше, чем на углеводы-наполнители. Эти эффекты четко видны на фиг.2, где всего лишь небольшое количество чистых АГЧ было добавлено в качестве внутреннего стандарта для относительного измерения процесса элюирования наполнителей. В этом случае ПП не чувствует никакого появления очищенных АГЧ, хотя сигнал РЛС регистрирует их присутствие в качестве анализируемых частиц. Кроме того, фиг.3 дополнительно иллюстрирует, что способ ЖХВД на основе РЛС и ПП с использованием полимерной колонки может быть использован для аналитического отделения АГЧ от их наполнителей. То есть, компонент АГЧ выделяется в гидродинамический объем с высоким значением Aw, в то время как сосуществующие наполнители, которые изначально сопутствуют АГЧ, по существу выделяются в те гидродинамические объемы колонки, которые элюируются после элюирования АГЧ. Эти результаты соответствуют результатам на фиг.1 для первичного эталонного стандарта, заранее выделенного в качестве отдельного объекта, в то время как фиг.3 представляет результаты для многокомпонентной начальной композиции (АГЧ и наполнители). Эти данные подтверждают то, что способы по настоящему изобретению могут быть использованы для мониторинга таких гематиновых композиций, которые производятся коммерчески и содержат АГЧ и наполнители.

Такие условия, как нестабильность, старение АГЧ и изменения условий производства, могут отслеживаться по комплексам железо-сахарид с использованием анализа на основе ЖХВД, снабженной по меньшей мере РЛС как одним из режимов детектирования. Кроме того, ЖХВД на основе РЛС, используемая в сочетании с чувствительным к концентрации детектором, таким как ПП-детектор, может быть использована для мониторинга структурных изменений в номинальной характеристике хроматографического пика для АГЧ. Такие изменения можно увидеть на хроматограмме, показанной на фиг.4, в особенности если сравнивать с хроматограммой на фиг.1, полученной для первичного эталонного стандарта, или с хроматограммой на фиг.3 для разделенной смеси. Подобным же образом, фиг.5 демонстрирует присутствие пика измененных АГЧ в другом гематиновом продукте производителя. Замечено, что различные детекторы, например, хроматографический РЛС-детектор и чувствительный к концентрации ПП-детектор, могут давать различную информацию. Чувствительный к концентрации ПП-детектор воспринимает и регистрирует концентрацию анализируемого вещества, но не его массу, которая независимо документируется с помощью РЛС-детектора. Таким образом, РЛС-детектор может чувствовать увеличение массы частиц, формируемых вследствие, например, комплексообразования или поперечной сшивки АГЧ, которые элюируются перед первичным эталонным стандартом АГЧ. Поскольку АГЧ, как иллюстрируется на фиг.1, представляют собой желаемое гематиновое вещество, то частицы, показанные на фиг.4 и 5, представляют собой побочные продукты с еще более высокой формульной массой, которые, как предполагается, образуются из АГЧ. Новый пик появляется за счет количественного расхода предпочтительных АГЧ.

Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для мониторинга стабильности при хранении гематиновых соединений, содержащих АГЧ. Подобно большинству органических молекул, АГЧ страдают от структурной нестабильности, так что они могут деградировать или трансформироваться с получением новых частиц даже внутри герметичных стеклянных ампул, используемых при производстве гематиновых соединений. Такие структурные трансформации АГЧ зависят от времени и также могут облегчаться с помощью температуры. Доказательство структурной трансформации АГЧ со временем очевидно при рассмотрении ряда профилей ЖХВД на основе РЛС и ПП, полученных для комплексов железо-сахарид, хранимых в выпускаемых герметичных стеклянных ампулах при комнатной температуре и в темноте в течение 6, 12, 22 и 25 месяцев после производства. Соответствующие хроматографические профили для этих продуктов показаны соответственно на фиг.6, 7, 8 и 9. Доказательство структурных изменений является очевидным, если сравнивать асимметричные пики АГЧ на этих фигурах с предпочтительным и симметричным пиком первичного эталонного стандарта, демонстрируемым АГЧ на фиг.1. Новый объект, указывающий на деградацию АГЧ и детектируемый с помощью РЛС, элюируется из колонки перед первичным эталонным стандартом или АГЧ, который также может быть виден на фигурах. Новый объект имеет такие особенности, как очень плотная структура с высокой формульной массой, концептуально сходная с шариками для детского пневматического оружия (от англ. «ВВ shot»). Эти характеристики определяются на основе графика Дебая, генерируемого с помощью обработки данных по рассеянию света с использованием программного обеспечения ASTRA, включенного в оборудование для РЛС упоминаемой ранее Wyatt Technology Corp., Santa Barbara CA, и методов и вычислений, описанных со ссылкой на журнал 1993 Analytica Chimica Acta, также упоминавшийся выше. Графики Дебая делают возможным получение конкретных данных РЛС, которые, в сочетании с измерениями среднеквадратичного (скв) радиуса или радиуса гирации (Rg), дают возможность для определения размеров молекулярных частиц или коллоидов. Для фиг.6-9 скв-значение, указывающее диаметр частиц, дает среднее значение, равное или большее 20 нм. Соответствующее скв-значение для хроматографической характеристики АГЧ на фиг.1 является равным или меньшим, чем 10 нм, что значительно ниже практического предела детектирования РЛС. Таким образом, способы по настоящему изобретению могут использоваться для мониторинга качества и стабильности при хранении гематиновой композиции, содержащей АГЧ.

Коммерчески производимые гематиновые соединения могут подвергаться мониторингу на присутствие АГЧ, а также наполнителей, в течение процесса производства, по окончании производства, например, во время упаковки, и после производства, например, если продукт находится на хранении. Подобным же образом композиция с комплексом железо-сахарид, содержащая АГЧ после отделения наполнителей, например композиция в форме водной композиции или после сушки, например, сушки вымораживанием, также может подвергаться мониторингу таким же способом. Комплекс железо-сахарид, содержащий АГЧ, может подвергаться мониторингу не только во время производства, но также и тогда, когда он находится на хранении вскоре после производства, например, в течение более одной недели после этого, а также после умеренно короткого периода хранения от около 6 месяцев и вплоть до около пяти лет или более после производства; продолжительное хранение может составлять от около 1 года до около пяти лет; или от около 1 года до около 3 лет. В каждом случае АГЧ могут подвергаться мониторингу путем сравнения их свойств, включая различные аналитические свойства, обсуждавшиеся выше, например, хроматографической характеристики, полученной с использованием ЖХВД в сочетании с РЛС и ПП, с первичным эталонным стандартом. 

Как описано выше, меньший пик, детектируемый с помощью РЛС и появляющийся в результате деградации или модификации исходно присутствующих АГЧ, представляет вещество с исключительно высокой формульной массой, идентифицируемое на фиг.6-9 как пик агрегатов АГЧ (АГЧАП). Вещество, ответственное за этот характерный АГЧАП, имеет формульную массу согласно рассеянию света в пределах от около 350000 до около 3000000 Дальтон или более, но для установления высокой формульной массы этих частиц также могут быть использованы ультрацентрифугирование и другие способы. Предполагается, что АГЧАП не связан с наполнителями, обычно присутствующими вследствие процесса синтеза или производства АГЧ. Вместо этого АГЧАП связан, вероятнее всего, с явлением старения, но он также может возникать из-за значительных отклонений от предпочтительных условий производства. Способы настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации уровней количественной толерантности АГЧАП в гематиновом продукте для парентерального введения. Присутствие и детектирование АГЧАП в любое время после производства (АГЧАПВПП) комплекса железо-сахарид может сравниваться с общим количественным сигналом ЖХВД для АГЧАП, детектируемым после заданного периода хранения гематинового продукта, когда он подвергается воздействию заданных условий (АГЧАПОБЩ). В качестве примера, период хранения должен перекрывать любой удобный период времени, например, от около 6 месяцев до около 10 лет или дольше; альтернативно, от около 1 до около 8 лет; или от около 1 года до около 5,0 лет. Если используется, например, период в 5 лет, то через 5 лет значение АГЧАП5летОБЩ будет обеспечивать основу для установления максимального приемлемого разложения или модификации измеряемых характеристик гематинового продукта после его выпуска. Другими словами, когда проходит время, равное 5 годам, АГЧ может превратиться в фармакологически бесполезный агрегат железа и композиционные остатки, совершенно отличные от предполагаемого и изначально выпущенного комплекса железо-сахарид для парентерального использования. Таким образом, количественно определение АГЧАПВПП для любого момента времени вплоть до АГЧАП5летОБЩ, выраженное как отношение присутствия, [АГЧАПВПП]/[АГЧАП 5летОБЩ], может давать зависимое от времени отношение или показатель стабильности для оценки качества гематинового продукта и реального процентного содержания интактных (т.е. неповрежденных) АГЧ, остающихся в гематиновом продукте. В настоящее время не существует такого стандартизированного способа для количественного описания старения и распада комплексов железо-сахарид после того, как они выпускаются в продажу. Необходимо заметить, что отношение присутствия не является ограниченным использованием в течение 5-летнего интервала времени; наоборот, как отмечено выше, оно применяется к любому удобному выбранному интервалу времени. Оно может быть пригодным для использования при оценке старения и стабильности комплекса железо-сахарид в зависимости от заранее определенных условий: например, когда 50 процентов комплекса железо-сахарид остается в своей исходной форме в момент производства или выпуска на рынок по сравнению с иным железом, чем комплекс железо-сахарид (например, свободным или несвязанным железом или агрегатом железа), то тем самым появляется возможность для определения половинного времени жизни комплекса железо-сахарид. Когда отношение [АГЧАПВПП]/[АГЧАПОБЩ] является близким к значению около 0,5, это значение отношения 0,5 может служить в качестве фармакокинетического показателя и гарантии того, что произведенный продукт будет иметь все еще интактным по меньшей мере 50% своего комплекса железо-сахарид, предполагавшегося для изначального выпуска. Хотя основой для количественной оценки времени жизни при хранении гематиновых соединений, как здесь цитируется, является значение 50%-ой выживаемости комплекса железа в АГЧ, на практике желательными являются более высокие стандарты качества, чем 50%, например от около 0,5 до около 0,98; предпочтительно от около 0,75 до около 0,95; более предпочтительно от около 0,80 до около 0,99; например, любое отдельное значение в пределах между около 0,5 и около 1,0 (и соответственно, для иного железа, чем комплекс железо-сахарид, т.е. АГЧ, значения от около 0,02 до менее около 0,5; от около 0,05 до около 0,25 и от около 0,01 до около 0,20; например, любое отдельное значение от около 0 до около 0,5), причем эти значения могут устанавливаться организацией, регулирующей стандарты, или производителем. Такое установленное отношение [АГЧАПВПП]/[АГЧАПОБЩ] является особенно полезным для целей индексирования, гарантирования или стандартизации клинической эффективности, рабочих характеристик и безопасности таких гематиновых соединений. До настоящего изобретения не существовало основы для присвоения стандартов соответствия качеству комплексам железо-сахарид с использованием стандартов, которые применимы к лекарственным средствам в целом. Как здесь описано, использование хроматографического способа на основе ЖХВД, предпочтительно включающего в себя детекторы на основе РЛС и ПП, делает возможным создание таких показателей. Более того, способность к выделению АГЧ, присутствующих в этих комплексах железа, усиливает практическое применение способа.

Поскольку АГЧ, упоминаемые как первичный эталонный стандарт для комплексов железо-сахарид, начинают деградировать вскоре после синтеза или производства, было бы также полезно установить вторичный эталонный стандарт. С практической точки зрения вторичный эталонный стандарт основывается на относительной доле агрегатов железа, полученных из активных гематиновых частиц, по сравнению с общим количеством агрегатов железа, которые могут с течением времени выделяться активными гематиновыми частицами при заданных условиях. Измерения агрегатов железа проводятся для создания таких стандартов целостности и стабильности активных гематиновых частиц, поскольку детектируемые уровни агрегатов железа формируются за счет первичного эталонного стандарта. График зависимости отношения [АГЧАПВПП]/[АГЧАП ОБЩ] от времени после производства или коммерческого выпуска комплекса железо-сахарид дает показатель стабильности продукта при хранении. Время, необходимое для достижения произвольного или обусловленного рабочими характеристиками отношения, например, 0,5, основанного на данных сигнала ЖХВД в виде [АГЧАПВПП ]/[АГЧАПОБЩ], может быть особенно пригодным для использования, хотя любое другое отношение может быть выбрано в качестве показателя, удостоверяющего качество продукта активных гематиновых частиц. Какое бы отношение не было выбрано с тем, чтобы служить в качестве минимального приемлемого стандарта для мониторинга клинической эффективности, полезности и безопасности на основе исторического использования, оно будет устанавливать стандарт композиции для вторичного эталонного стандарта. Такой первичный эталонный стандарт или вторичный эталонный стандарт может быть приготовлен в качестве практического аналитического стандарта для использования при мониторинге между- и внутрилабораторных или производственных рабочих характеристик, а также в качестве показателя качества продукта и инструмента для стандартизации продукта.

Выделенная АГЧ-содержащая композиция, фракция 1, составляющая первичный эталонный стандарт, может быть высушена для продолжительного хранения и восстановлена, т.е. повторно разбавлена для парентерального использования и дополнительного исследования.

Высушенные и/или повторно разбавленные АГЧ могут храниться для целей будущей аналитической характеризации, например, для установления более определенных химических критериев, а также для архивирования образцов АГЧ для будущих стандартов. Хранение выделенных и лиофилизированных АГЧ является важным, поскольку комплексы железо-сахарид подвержены дестабилизации и разложению после их синтеза, особенно в том случае, когда комплексы остаются в разбавителе или в жидком, в частности, водном носителе. В противоположность этому, высушенные АГЧ могут храниться в течение продолжительных периодов времени, предпочтительно, в не содержащей влаги среде, включая герметичные контейнеры. Кроме того, высушенный стабильный комплекс удобно транспортировать и повторно растворять по мере необходимости в точке использования, тем самым дополнительно увеличивая его стабильность до момента использования. Например, высушенные АГЧ могут быть герметизированы в защищающих от влаги контейнерах, таких как мешочки из металлической фольги или стеклянные контейнеры, и храниться при температуре окружающей среды (от около 20°C до около 25°C) или более низкой температуре в течение продолжительных периодов времени. Например, высушенный комплекс может храниться с момента времени вскоре после производства, например, от около одной недели после этого, а также после умеренно короткого периода хранения в приблизительно 6 месяцев, до около пяти лет или более после производства; продолжительное хранение может составлять от около 1 года до около пяти лет или от около 1 года до около 3 лет. Во время такого хранения после производства АГЧ могут подвергаться мониторингу на стабильность путем сравнения аналитических свойств, например, хроматографической характеристики, полученной с использованием ЖХВД в сочетании с РЛС и ПП для повторно растворенного образца, с первичным эталонным стандартом.

Выделенные АГЧ (фракция 1) сразу после изготовления или через конкретное время после этого могут быть высушены вымораживанием (лиофилизированы) и растворены повторно для простоты хранения и транспортировки, а также для дополнительных исследований. Перед лиофилизацией, носитель для доставки железа, т.е. АГЧ, присутствующие в виде комплекса железо-сахарид, предпочтительно выделяются из сосуществующих с ними гидрофильных и других наполнителей, как описано ранее. Такие наполнители включают в себя избыточные реагенты для синтеза, побочные продукты реакции, примеси глюканов, полиглюканов, сахаридных лактонов, побочные продукты деградации и другие вещества. В предпочтительном варианте воплощения АГЧ выделяют в виде частиц первичного эталонного стандарта, составляющих фракцию 1. По причине отделения АГЧ от сосуществующих гидрофильных веществ происходит увеличение значения Aw для фракции или композиции, в которой они присутствуют; другими словами, в содержащей АГЧ фракции значение Aw достигает 1,0.

Технология сушки вымораживанием хорошо известна в пищевой и перерабатывающей промышленности, а также широко используется при сушке фармацевтических препаратов. Технология, как правило, применяется для сушки композиций, которые смочены водой, хотя является возможной и сушка материалов или растворенных веществ, которые диспергированы или растворены в других разбавителях или растворителях, присутствующих по отдельности или в смеси, например, с водой, и которые восприимчивы к сушке вымораживанием. Как правило, композицию замораживают до температуры значительно ниже 0°C и подвергают воздействию низкого абсолютного давления, другими словами, высокого вакуума. Затем осторожно подводят тепло для того, чтобы создать условия для сублимации льда. Процесс использовался ранее для защиты чувствительных к теплу материалов от термических повреждений, а также для того, чтобы предотвратить усадку пористых материалов во время сушки, с тем, чтобы они могли повторно, быстро и полностью гидратироваться. Настоящее изобретение предоставляет способ выделения и лиофилизации или концентрирования путем сушки вымораживанием активных гематиновых частиц, произведенных для использования в качестве носителей для парентеральной доставки железа.

Во время сушки вымораживанием существует изменяющееся состояние дисбаланса между льдом в замороженной композиции, упоминаемым как лед продукта, и условиями давления и температуры в системе. Миграция паров воды с границы раздела льда продукта осуществляется только в том случае, если существует это состояние дисбаланса, и лед продукта находится на более высоком уровне энергии, чем остальная часть системы. Оборудование для сушки вымораживанием конструируется для создания набора контролируемых условий, обеспечивающих и поддерживающих предпочтительные разности температуры и давления для данного продукта, тем самым вызывая сушку продукта за наименьшее количество времени.

Предел дисбаланса определяется максимальным количеством тепла, которое может быть подведено к продукту, не вызывая перехода из твердого состояния в жидкое (упоминаемое как обратное плавление). Это может произойти даже в том случае, если давление в камере является низким, поскольку продукт высыхает с поверхности, ближайшей к области самого низкого давления; эта поверхность называется границей раздела льда. Расположение высушиваемой твердой композиции или частиц над этой поверхностью раздела оказывает сопротивление парам, выходящим снизу, тем самым поднимая давление и температуру продукта. Для предотвращения обратного плавления тепловая энергия, которая подводится к продукту, практически приближается, а предпочтительно, не превосходит скорости, с которой пары воды покидают продукт. Другой фактор, воздействующий на процесс, представляет собой скорость, с которой тепловая энергия, прикладываемая ко льду продукта (и уносимая прочь с помощью мигрирующих паров), удаляется с помощью конденсаторной охладительной системы. При поддержании низкой температуры конденсатора пары воды захватываются в виде частиц льда и эффективно удаляются из системы, тем самым снижая и упрощая требования к вакуумной откачке. Воздух и другие неконденсируемые молекулы, присутствующие в камере, а также механические препятствия, расположенные между льдом продукта и конденсатором, составляют дополнительное сопротивление для удаления паров, мигрирующих к конденсатору.

Четыре условия, как правило, рассматриваются в качестве основных для сушки вымораживанием. Эти условия проведения процесса являются следующими: (1) продукт замораживают до твердого состояния ниже его эвтектической температуры или температуры стеклования; (2) обеспечивают наличие конденсирующей поверхности, способной достигать температур, приблизительно на 20°C более холодных, чем температура на поверхности раздела льда продукта, как правило, меньших около -40°C; (3) вакуумная система является способной к откачке до абсолютного давления от около 5 до около 65 микрон ртутного столба (Hg) (от около 0,5 до около 10 Па, предпочтительно от около 1 до около 8 Па); и (4) источник тепла, поступающего в продукт, поддерживается при температурах от около -60°C до около +65°C, предпочтительно от около -40°C до около +65°C, более предпочтительно от около -30°C до около +55°C, наиболее предпочтительно от около -25°C до около +25°C; как правило, температура около +20°C используется для обеспечения подвода тепла, необходимого для перехода воды из твердого в парообразное состояние (то есть теплоты сублимации). Физическая конфигурация оборудования, сконструированного с тем, чтобы удовлетворить этим четырем условиям, изменяется в широких пределах и включает в себя устройства для сушки вымораживанием с индивидуальной колбой и устройства для сушки вымораживанием периодического типа. Процессы сушки вымораживанием, как правило, осуществляются в камерах периодического типа в том случае, когда требуется точный контроль процесса, например, в химической и фармацевтической промышленности. Это дает возможность оператору для более точного контроля за тем, что происходит с сублимируемым продуктом. Соответствующее оборудование описано, например, в патенте США 6122836 (правообладатель Virtis Division of S.P. Industries, Inc., N.Y.) и в ссылках, цитируемых в нем, а также в публикации Zapsalis and Beck, Food Chemistry and Nutritional Biochemistry, 1985, Chapter 1, pp. 23-26 (все они включаются сюда в качестве ссылок до разрешенной степени). Другое пригодное для использования коммерческое оборудование и условия процесса подробно описаны в разделе, озаглавленном "Freeze Drying", van Nostrand's Scientific Encyclopedia, Eighth Edition, pages 1338-1342, 1995 (включается сюда в качестве ссылки до разрешенной степени).

Эффективность процессов сушки вымораживанием, в частности, определяется тройной точкой на диаграмме состояния воды, т.е. когда твердая вода в форме льда подвергается прямому преобразованию в паровую фазу при температурах ниже 0°C и давлениях менее 4,58 Тор (610,5 Паскаля). Эффективная сушка вымораживанием осуществляется при давлении (в вакууме) от около 10 микрон до около 200 микрон ртутного столба, предпочтительно от около 40 до 100 микрон, более предпочтительно от около 40 до около 80 микрон, как правило, используется давление около 60 микрон. Удаление молекул воды, существующих в качестве (a) льда внутри гидратированной физической матрицы или (b) льда, который образуется при замораживании простых водных растворов, в идеале дает сухую остаточную физическую матрицу, свободную от воды, или остаток некоторого желаемого растворенного вещества, не содержащего воды. Однако, когда внутри ледяной системы присутствуют гидрофильные растворенные вещества, коллоиды, суспензии или дисперсии, такие как сахаридные наполнители, они могут концентрироваться в структуре льда в процессе сушки вымораживанием, и объем воды, растворителя или разбавителя уменьшается. Поскольку такие материалы становятся более концентрированными, по мере осуществления сушки вымораживанием это все сильнее понижает точку замерзания замороженной водной системы. Когда возникает это состояние, коллигативные свойства взаимодействия растворенного вещества с водой могут также поднять температуру замерзания выше эвтектической точки, вызывая явление обратного плавления или внося в него вклад. Это противоречит предпочтительному процессу сушки вымораживанием по настоящему изобретению, в котором лед, сопутствующий желаемому растворенному веществу, т.е. АГЧ, поддерживается в замороженном состоянии, по существу не подвергаясь вредному влиянию частиц гидрофильного растворенного вещества, которые могут включать в себя трудноудаляемую воду до тех пор, пока по существу вся вода, ассоциированная с АГЧ, не удаляется путем сублимации.

Предпочтительная сушка АГЧ вымораживанием осуществляется в значительной степени в результате высокого значения Aw фракции (фракция 1), содержащей по существу весь комплекс железо-сахарид, изначально присутствующий в образце, что облегчает его быстрое замораживание в виде оболочки на пластине, на стенках контейнера или на некотором другом трехмерном каркасе, который обеспечивает для замороженной фракции высокое отношение поверхности к объему. Чем более эффективно осуществляется это замораживание в виде оболочки, тем лучше качество лиофилизированного продукта. Как правило, замораживание осуществляется при температурах от около -160°C до около -10°C, предпочтительно от около -80°C до около -20°C, например около -60°C. Когда АГЧ присутствуют в замороженной композиции, в которой вода демонстрирует близкое к 1,0 значение Aw, давление ниже около 4,58 Тор (610,5 Па) приводит к увеличению давления паров воды, и описанные температурные условия могут приводить к увеличению давления паров воды и эффективной сублимации. Вода удаляется изо льда путем поддержания давления вокруг замороженных АГЧ ниже давления паров на поверхности остающегося льда, удаляя пары воды с помощью вакуумного насоса и конденсируя их на охлаждаемых поверхностях, поддерживающихся при температурах от около -120°C до около -25°C, предпочтительно от около -80°C до около -50°C, как правило -60°C. В частности, высокое значение Aw для ранее выделенных АГЧ увеличивает скорость миграции фронта сублимации через замороженный продукт. В отсутствие удаления наполнителей, в особенности гидрофильных наполнителей, из АГЧ или комплекса железо-сахарид АГЧ подвергаются обратному плавлению во время процесса сушки вымораживанием. Другими словами, присутствие гидрофильных веществ приводит к тому, что вода является по существу связанной или удерживаемой в композиции АГЧ, в которой присутствуют такие гидрофильные вещества. Если для увеличения давления паров при попытке удаления такой связанной воды используются более высокие температуры, это также может оказывать нежелательное воздействие, вызывая плавление фазы льда и, тем самым, ухудшая сушку вымораживанием. Вследствие этого является предпочтительным, чтобы все или по существу все гидрофильные наполнители были удалены или выделены из АГЧ перед сушкой вымораживанием: предпочтительно удаляются более около 95% из исходно присутствующих наполнителей; более предпочтительно более около 98%, еще более предпочтительно более около 99%, наиболее предпочтительно более около 99,9%, например, АГЧ отделяются от гидрофильных наполнителей перед сушкой вымораживанием до такой степени, что такие наполнители присутствуют в очень малых или следовых количествах.

Для целей настоящего изобретения сухой остаток АГЧ содержит фармакологически полезный комплекс железо-сахарид. Таким образом, выделенные и высушенные АГЧ являются пригодными для использования при дальнейших аналитических исследованиях или, при необходимости, для повторного растворения в ходе других исследовательских аналитических или фармакологических применений. Как правило, способы по настоящему изобретению пригодны для сушки АГЧ, из которых по существу удалены наполнители, так что удаляется от около 85% до по меньшей мере около 99%, предпочтительно от около 90% до по меньшей мере около 97%, наиболее предпочтительно от около 92% до по меньшей мере около 95% воды. Необходимо понять, что малая процентная доля воды, изначально присутствующая в выделенных АГЧ, может быть ассоциирована или сильно связана с АГЧ, и попытки удаления такой связанной воды могут вызвать опасность ненужной деградации АГЧ. Образец АГЧ после лиофилизирования и повторного растворения, подвергнутый анализу с помощью ЖХВД на основе РЛС и ПП, показывает результаты, иллюстрируемые на фиг.10. Эта фигура демонстрирует хроматографическую характеристику, по существу идентичную той, что показана на фиг.1, которая служит в качестве первичного эталонного стандарта. Более того, анализируемые соединения, показанные на фиг.1 и 10, являются по существу идентичными АГЧ, показанным на фиг.3, где наполнителям дали возможность остаться.

Гематиновый материал с профилем ЖХВД, который отличается от первичного эталонного стандарта, такого как на фиг.1 или на фиг.10, представляет собой материал, который также демонстрирует доказательство того, что агрегатные частицы в лиофилизированном продукте имеют необычную морфологию. Когда в ходе исследований с помощью ЖХВД наблюдают, что часть АГЧ составляют агрегатные частицы, вид лиофилизированных АГЧ под микроскопом при 100-кратном и выше увеличении визуально может описываться как структура типа вельвета. Она демонстрирует красно-коричневые параллельные полосы или рубцы трехвалентного железа, равномерно перемежающиеся с прозрачными полосами тонких пластинок углеводов. Красно-коричневые параллельные полосы трехвалентного железа имеют отчетливую форму параллельных друг другу столбцов, которые имеют по меньшей мере в два раза больший диаметр, чем толщина, демонстрируемая прозрачными длинными планарными пластинками углеводов, которые повторяющимся образом (периодически) расположены между такими столбцами. Эта наблюдаемая микроскопическая форма имеет структурную аналитическую значимость и соответствует данным ЖХВД с рассеянием света в том случае, когда хроматографические профили выглядят как показанные на фиг.4-9. Когда представлены желаемые свежеприготовленные АГЧ, соответствующие первичному эталонному стандарту комплексов железо-сахарид, морфология лиофилизированного продукта характерным образом отличается тем, что здесь отсутствует колоночная структура.

Консервация лиофилизированного продукта может поддерживаться в вакууме или в атмосфере любого инертного газа, включая, например, азот, аргон и гелий (а также любой газ, который не взаимодействует с лиофилизированным продуктом), до того момента, как он повторно растворяется для анализа или использования. Также, поскольку процесс лиофилизации сам по себе не воздействует на структуру комплекса железо-сахарид, использование этого процесса имеет важное значение для сохранения структуры этих гематиновых агентов в течение различных интервалов времени с тем, чтобы «задокументировать» гематиновые частицы, присутствующие в данный момент времени, когда осуществляется лиофилизация. Это обеспечивает способ для архивного хранения и документирования производства и качества продуктов. В других случаях лиофилизация может специально быть использована для стабилизации и хранения первичных и/или вторичных эталонных стандартов этих гематиновых композиций. Более того, соответствующим образом приготовленные и поддерживаемые лиофилизированные АГЧ могут безопасно храниться с малым риском значительной деградации продукта до возникновения необходимости в них. Более того, продукт в такой форме удобно доставлять в географически удаленные области и удобно хранить до возникновения потребности в нем, причем при возникновении такой потребности повторное растворение гематинового соединения для парентерального использования будет легко осуществимо. Например, лиофилизированный продукт, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением, может храниться в герметичных стеклянных или защищенных соответствующим образом металлических контейнерах, предпочтительно наполненных по существу не содержащим влаги инертным газом. Альтернативно, такой продукт может быть герметизирован в мешочке из металлической фольги в количестве, соответствующем повторному растворению в виде стандартной единичной дозы для парентерального введения и так далее. Упоминаемые комплексы железо-сахарид приготавливаются с целью производства парентеральных гематиновых комплексов для доставки железа людям или животным, нуждающимся в этом. Эти комплексы железа, как правило, находятся в такой форме, что железо может вводиться парентерально и благоприятным образом для усиления гематопоэтических механизмов, необходимых для лечения многочисленных клинических состояний у млекопитающих, в частности, у людей, нуждающихся в этом.

Термин "около", когда он используется в качестве модификатора перед или в сочетании с переменной, предназначен для донесения той информации, что описанные здесь числа и пределы являются гибкими, и что осуществление настоящего изобретения специалистами в данной области с использованием температур, концентраций, количеств, содержаний, углеродных чисел, свойств, таких как молекулярная масса, вязкость, растворимость, и тому подобных величин, которые находятся вне указанных пределов или отличаются от единственного значения, достигнет желаемого результата, а именно приготовления гематинового комплекса железо-сахарид, пригодного для сушки вымораживанием, получения высокочистого гематинового комплекса железо-сахарид, и выполнения способов его использования. Более того, когда приведены пределы значений, то необходимо понимать, если не указано иного, что настоящее изобретение предполагает использование всех других пределов, которые находятся внутри самого широкого диапазона.

ПРИМЕРЫ 

В настоящем изобретении упоминание содержания воды в невысушенном веществе или композиции, другими словами, перед сушкой, приводится в виде процента от общей массы невысушенного вещества или композиции. Содержание воды в высушенном веществе или композиции приводится в виде процента от общей массы только сухого вещества, исключая всю влагу.

Последующее описание представляет собой процедуру для гель-проникающей хроматографии низкого давления, используемую при приготовлении образцов, для которых результаты исследований представлены на фиг.1, 2 и 10, включая приготовление очищенных и по существу не содержащих наполнителей АГЧ. В данном конкретном варианте применения гель-проникающей хроматографии (ГПХ) низкого давления для выделения АГЧ используются поперечно сшитые полиглюканы или декстраны, демонстрирующие эксклюзионные характеристики для молекулярной массы более около 5000, а предпочтительно, более около 1500 Дальтон. Неподвижная фаза в ГПХ представляет собой "Sephadex G-10" (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Резервуар с растворителем с помощью силы тяжести или регулируемого потока подает в качестве подвижной фазы воду с чистотой «для ЖХВД» в колонку для ГПХ, содержащую неподвижную фазу декстрана. Колонка конструируется из стекла, имеющего диаметр 2,0 см и длину 25 см. Неподвижная фаза приготавливается в соответствии с рекомендациями производителя, включая гидратирование декстрана и дегазирование в вакууме перед использованием. 400-микролитровый объем образца гематинового раствора, включающего в себя комплекс железо-сахарид, например, выпущенный его производителем в герметичных стеклянных ампулах, вводится в верхнюю часть колонки для ГПХ, и ему дают возможность для проникновения в неподвижную фазу. После того, как сильно окрашенный гематиновый раствор проникает в неподвижную фазу, вода «для ЖХВД» подается вручную или с помощью насоса со скоростью 1-4 мл в минуту с тем, чтобы обеспечить его элюирование через колонку в виде четко определенной окрашенной полосы. Когда характерно окрашенные АГЧ элюируются из колонки, как определяется по минимальному спектрофотометрическому поглощению на 430 нм, это означает конец элюирования для фракции 1. Более тонкий аналитический способ для обнаружения точки разделения для фракции 1 и начала следующей фракции, идентифицируемой здесь как фракция 2, использует реакцию с использованием антрона (Dreywood, 1946, цитировалось ранее). Граница элюата между двумя фракциями может быть определена за счет того, что самая низкая концентрация производящих фурфураль углеводов в общем потоке элюата из процесса разделения находится между АГЧ и их гигроскопичными наполнителями. На практике 100-микролитровые образцы из потока элюата отбираются, взаимодействуют с антроновым реагентом, и полученное в результате поглощение регистрируется на 620 нм. Фракция 1 красно-коричневого цвета содержит АГЧ, по существу не содержащие гидрофильных и сильно гигроскопичных наполнителей, которые ранее сосуществовали с АГЧ после выпуска. Остающийся объем, элюируемый из колонки, рассматривается как фракция 2.

АГЧ, полученные, например, из фракции 1, как описано выше, или из образцов, взятых непосредственно из стеклянных ампул гематиновых композиций, продаваемых для использования в клинических применениях, или образцов, приготовленных из концентрированных объемов фракции 1, включая повторно растворенные композиции на основе использования сушки вымораживанием, могут дополнительно анализироваться с использованием ЖХВД анализа на основе показателя преломления (ПП) и рассеяния лазерного света (РЛС). Конкретно, способ использует насос Waters 590 (Waters Corporation, Milford MA) для подачи водной подвижной фазы в колонку GMPWXL диаметром 7,8 мм и длиной 30 см (Tosoh Biosep, Montgomeryville, PA). Материал внутренней набивки колонки состоит из вытеснительных полимерных шариков с каркасом из полиметилметакрилата, имеющих диаметр частиц 13 микрон и различные размеры пор в пределах от менее около 100 Ангстрем до около 2000 ангстрем. Поток элюанта из колонки отслеживается с помощью высокоуглового детектора рассеяния света Wyatt miniDawn в сочетании с интерферометрическим рефрактометром Optilab DSP (оба от Wyatt Technology, Inc., Santa Barbara, CA). Рабочие температуры нагревателя колонки и рефрактометра поддерживаются при 35°C. Водная подвижная фаза включает в себя 200 миллионных долей азида натрия, pH устанавливается на 6,0, после чего она подвергается вакуумной фильтрации через поры 0,02 микрона и кипящему барботированию гелием перед использованием. Подвижная водная фаза подается в систему со скоростью 1,0 мл в минуту, при давлении 150 фунтов на квадратный дюйм. Приготовление образца для исследований требует фильтрования через мембранный фильтр с порами 0,02 микрона (например, фильтры "Anotop", Whatman, Maidstone, England). Когда гематиновые композиции, комплексы железо-сахарид или их компоненты состариваются, могут потребоваться мембранные фильтры с порами до 0,45 микрона для удаления частиц большого размера без закупоривания. Если такие частицы не исключаются из аналитических образцов перед введением в систему ЖХВД, аналитические рабочие характеристики ЖХВД сильно ухудшаются. Образцы разбавляются, по желанию, до 2,5% масс/масс, и 80-200 микролитровый объем образца вводится в систему ЖХВД для анализа. Анализ множества образцов облегчается путем автоматизации использования "Water's autosampler", model 717 (Milford, MA).

Объединение детектирования на основе ПП и РЛС с ЖХВД устанавливает абсолютную макромолекулярную массу анализируемых соединений, которые дают хроматографический пик, а также значение среднеквадратичного радиуса (скв), также упоминаемого как радиус гирации (Rg ). Среднеквадратичное значение в сочетании с определением абсолютной массы обеспечивает информацию о формах рассеивающих свет частиц, таких как стержни, клубки, сферы или диски. Формульная масса АГЧ и форма конкретных комплексов железо-сахарид может быть использована для различных целей мониторинга.

Процесс сушки вымораживанием, используемый для примеров по настоящему изобретению, представляет собой следующее:

Фракция 1, идентифицированная выше, служит в качестве исходного материала для сушки вымораживанием. Используя способ, описанный ниже, малые объемы в 10 мл или большие объемы в 100 мл содержащих АГЧ растворов могут быть легко высушены вымораживанием при условии, что образец по существу не содержит сахаридных веществ, которые стремятся понизить энтропию воды и давление ее паров. Эти объемы могут содержаться в любом стеклянном контейнере, который выдерживает физическое напряжение замораживания в виде оболочки, этот способ используется для получения общей дегидратации и концентрирования АГЧ. Предпочтительное отношение объема жидкости к объему контейнера для замораживания в виде оболочки составляет от около 1 до около 5, но возможны и другие отношения. После введения в контейнер жидкости, содержащей по существу не содержащие наполнителей АГЧ, этот контейнер вращается со скоростью примерно 50 оборотов в минуту, в криогенной бане. Баня может быть создана путем смешивания сухого льда и ацетона, или, альтернативно, может быть использован жидкий азот, при условии, что поддерживается температура в по меньшей мере около -50°C или ниже. Погружение и вращение контейнера замораживает АГЧ-содержащий водный объем на стенках контейнера. Это увеличивает отношение поверхности к объему для АГЧ-содержащего водного объема с тем, чтобы облегчить сублимацию воды. Другие вариации способа и оборудования для этой процедуры могут быть использованы для получения таких же или подобных результатов.

Один или несколько контейнеров с замороженными в виде оболочки композициями, содержащими воду и АГЧ, размещаются на полке внутри устройства для сушки вымораживанием. Для этой цели может быть использован такой инструмент, как "Virtis Unitop 600L", соединенный с "Freezemobile 12 ES" (Gardiner, NY). В системе поддерживается вакуум в 60 микрон ртутного столба (7,5 Па), а также поддерживается температура конденсатора в по меньшей мере около -60°C или холоднее. Предпочтительный цикл сушки вымораживанием является следующим: содержание на полке при начальной температуре в -50°C в течение 2 часов; затем температуру равномерно повышают до 25°C в течение 12 часов; образец выдерживается при 25°C в течение дополнительных 24 часов. Предпочтительно, высушенный продукт должен храниться в осушающих условиях в эксикаторе, например в атмосфере сухого инертного газа, такого как аргон или азот. Высушенные АГЧ могут повторно растворяться в желаемом водном объеме, при этом они легко переходят в раствор и могут легко фильтроваться через мембрану с порами 0,02 микрона, как описано выше.

ЖХВД анализ с использованием детектирования на основе ПП и РЛС демонстрируется на следующих далее 10 примерах с использованием комплексов железо-сахарид. Результаты для каждого из образцов 1-10 соответствует фиг.1-10. Гематиновые образцы 1-4 и 6-10 представляют собой комплекс железо-сахарид, идентифицируемый как комплекс глюконата натрия железа(III) в сахарозе (SFGCS), продаваемый под торговым наименованием Ferrlecit ®((производится Rhône-Poulenc Rorer, Dagenham, Essex, England). Образец 5 и соответствующая ему фиг.5 представляет собой комплекс гидрат окиси железа(III)-сахароза (FHSC), продаваемый под торговым наименованием Venofer®(производится Luitpold Pharmaceuticals, Shirley, NY). Образцы, используемые для анализа с помощью ЖХВД, берутся из вновь открываемых стеклянных ампул, хранимых в условиях комнатной температуры. В дополнение к этому, образцы 6, 7, 8 и 9 анализируются через 6, 12, 22 и 25 месяцев после выпуска продукта производителем. Эти периоды времени упоминаются здесь как "время после выпуска" или ВПП и соответствуют ВПП№1, ВПП№2, ВПП №3 и ВПП№4 в примерах. Образцы приготавливают с помощью 1-20-кратного разбавления, после чего 200-микролитровые объемы образцов при таких разбавлениях анализируются с помощью способа ЖХВД, описанного выше.

Результаты исследований примера 1 показаны на фиг.1. Результаты основаны на использовании ЖХВД с детектированием на основе ПП и РЛС для оценки АГЧ, выделенных в элюате фракции 1, полученной с использованием препаративной ГПХ низкого давления из образца комплекса железо-сахарид, полученного из продаваемой стеклянной ампулы. Хорошо выраженный хроматографический профиль с одиночным пиком для сигнала РЛС и сигнала ПП совпадает с элюированием АГЧ, при этом никаких наполнителей в очищенном материале не замечено.

Результаты примера 2 показаны на фиг.2. Результаты основаны на использовании ЖХВД с детектированием на основе ПП и РЛС для оценки АГЧ, выделенных в элюате фракции 2, полученной при использовании препаративной ГПХ низкого давления из комплекса железо-сахарид примера 1. Из этих двух результатов ясно, что наполнители и АГЧ разделяются или выделяются в различных фракциях. 15 микролитров АГЧ из фракции 1, пример 1, добавляют к элюанту фракции 2 в качестве внутреннего стандарта для идентификации того, где окажется его положение при элюировании по отношению к положению наполнителей.

Результаты примера 3 показаны на фиг.3. Результаты основаны на использовании ЖХВД с детектированием на основе ПП и РЛС, примененной к тому же гематиновому образцу, как и в примере 1, для выделения фракции 1 с ее характерными АГЧ из наполнителей, обычно наблюдаемых во фракции 2. Способ ЖХВД может выделить различные составляющие комплекса железо-сахарид из гематиновой композиции в едином хроматографическом профиле. В то время как ЖХВД является особенно пригодной для использования при быстром аналитическом исследовании, хроматография низкого давления является особенно пригодной в качестве препаративного метода получения предпочтительных АГЧ. Сигнал РЛС для АГЧ соответствует наблюдаемому сигналу ПП.

Результаты примера 4 показаны на фиг.4. Результаты основаны на использовании предпочтительного способа ЖХВД для детектирования структурных отклонений от исходных АГЧ. В их недеградированной форме АГЧ служат как эталон качества, также обозначенный на этих фигурах как "первичный эталонный стандарт". ЖХВД анализ с использованием ПП и РЛС осуществляется для гематиновой композиции, полученной непосредственно из поставляемой ампулы и содержащей комплекс железо-сахарид. Фигура демонстрирует несоответствие с ожидаемым или идеальным пиком АГЧ. Заметно появление нового, наблюдаемого хроматографически вторичного пика вблизи пика первичного эталонного стандарта АГЧ. Эта особенность указывает на возникновение частиц агрегатов железа вследствие деградации АГЧ. Фигура идентифицирует второй пик как пик агрегатов активных гематиновых частиц (АГЧАП) с использованием детектирования РЛС. Особенно примечательно, что этот пик не наблюдается при использовании одного только детектирования на основе ПП.

Результаты примера 5 показаны на фиг.5. Результаты основаны на использовании ЖХВД, снабженной детекторами на основе ПП и РЛС. Эта фигура также демонстрирует структурные изменения в пике АГЧ или первичного эталонного стандарта гематинового вещества, содержащего FHSC. Образец этого продукта имеет на ампуле дату изготовления декабрь 1999 года и срок годности до декабря 2002 года. В этом примере АГЧАП появляется в виде плеча на пике АГЧ, что говорит об иной степени изменений по сравнению с образцом, исследуемым в примере 4. Хотя хроматографические профили РЛС и ПП в целом перекрываются, только сигнал РЛС детектирует доказательство присутствия агрегатов железа в гематиновом веществе для парентерального введения. Как и в каждом из предыдущих примеров, образец для этих исследований получается непосредственно из герметичной стеклянной ампулы, используемой для клинических применений.

Примеры 6-9. Легко детектируемые отклонения в профилях элюирования ЖХВД на основе ПП и РЛС от ожидаемого хроматографического профиля для АГЧ отражают либо отклонение от предпочтительных условий производства, либо деградацию АГЧ из-за старения и дестабилизации, когда они все еще герметизированы в стеклянных ампулах для доставки. Сама по себе дестабилизация проявляется в агрегации железа, обычно существующего в качестве составляющей в желаемой структуре АГЧ. Хотя ЖХВД с детектированием на основе ПП не дает возможности детектировать изменения в комплексах железо-сахарид, детектирование на основе РЛС дает четкие доказательства такой дестабилизации продукта. Преимущества настоящего изобретения как способа мониторинга состояния гематинового продукта, содержащего комплекс железо-сахарид, иллюстрируется в том случае, если ЖХВД соединяется с детекторами на основе ПП и РЛС для детектирования доказательств деградации АГЧ, индицируемой по формированию агрегатов железа. Формирование агрегатов железа наблюдается в виде хроматографического пика ЖХВД, обозначаемого как АГЧАП, индивидуальные образцы комплексов железо-сахарид, в частности, SFGCS, произведенные в течение нескольких месяцев, хранятся при комнатной температуре в отсутствие света и без каких-либо вмешательств, о которых известно, что они отрицательно влияют на стабильность продуктов, когда они герметизированы в своих стеклянных ампулах. Образцы состариваются при комнатной температуре в темноте, а через 6, 12, 22 и 25 месяцев после их производства соответствующие ампулы открываются, и их содержимое анализируется с помощью ЖХВД на основе ПП и РЛС, как описано выше. Ни один из образцов хранимого продукта не достигает его установленного срока годности, сформулированного на упаковочном материале. Образец с самым коротким значением ВПП в 6,0 месяцев обозначается как ВПП№1, а образец с самым длительным хранением в 25 месяцев - как ВПП№4. Результаты исследований с помощью ЖХВД, примененных к этому набору последовательно состаренных образцов гематиновых веществ, показаны на фиг.6-9. Ключевой областью аналитического интереса в хроматографических профилях, представленных на фиг.6-9, является та область, где появляется характеристика АГЧ, по этой причине на указанных фигурах демонстрируется только конкретный диапазон элюирования, важный для аналитического профиля, наблюдаемого с помощью ПП и РЛС.

При рассмотрении группы в последовательности от ВПП№1 (фиг.6) до ВПП№4 (фиг.9.) становится ясным, что сигнал ПП от этих образцов демонстрирует очень небольшое влияние состаривания образца посредством разложения АГЧ и агрегирования железа. С другой стороны, доказательство дестабилизации АГЧ с агрегацией железа ясно видно по плечу АГЧАП или по вторичному пику, который детектируется при использовании РЛС во всех четырех образцах.

Посредством этих примеров доказано, что предпочтительный способ ЖХВД на основе ПП и РЛС дает возможность для проверки присутствия АГЧ или их сосуществования с обычно присутствующими наполнителями, с которыми они выпускаются для парентерального использования. Наряду с этим, настоящий способ дает очень важную возможность для мониторинга, а также для исследования и разработки новых гематиновых соединений на основе комплексов железо-сахарид как группы. Можно увидеть, что этот класс гематиновых веществ является восприимчивым к дестабилизации, приводящей к образованию агрегатов железа, которые смешиваются с предпочтительными или нормальными АГЧ. Если только ЖХВД не используется по меньшей мере вместе с детектированием на основе РЛС, а также с детектированием на основе ПП, появление агрегатов железа в этих гематиновых агентах может пройти незамеченным.

Как описано выше, когда осуществляется предпочтительный способ настоящего изобретения, образцы рутинно фильтруются через мембранный фильтр с порами 0,02 микрона марки Anotop, чтобы исключить рабочие проблемы с образцом перед тем, как он вводится в ЖХВД. Образцы комплексов железо-сахарид, которые не показывают доказательств появления АГЧАП, могут быть легко отфильтрованы при приготовлениях к исследованию, но более старые образцы фильтруются с большими сложностями, или вообще не фильтруются даже при использовании фильтров с порами 0,45 микрона. Наблюдается, что сложности во время препаративного фильтрования образцов для исследований с помощью ЖХВД в соответствии с указанным и предпочтительным способом соответствуют появлению самых высоких уровней АГЧАП. Измеримое и количественное удерживание агрегатов железа на поверхности мембранного фильтра может давать еще один, хотя и поверхностный, способ для оценки нежелательного уровня разрушения гематинового препарата. Однако применение такого метода фильтрования к гематиновому препарату перед парентеральным использованием было бы непрактичным, и, более того, оно не оказывало бы никакого воздействия на деградированные АГЧ, которые до этого не переходили в стадию фильтруемых агрегатов железа. Когда в образцах образуются значительные количества агрегатов железа и анализ гематиновых препаратов становится самым важным, фильтрование образца является необходимым для получения рабочих характеристик и обслуживания инструмента ЖХВД. Кроме того, необходимо заметить, что, если остаток агрегатов железа или другого коллоидного материала удерживается на мембранном фильтре в результате приготовления АГЧ для анализа с помощью ЖХВД, количественная характеристика агрегатов на фильтре должна рассматриваться вместе с ЖХВД анализом как взаимодополняющие показатели распада продукта. Когда в гематиновых препаратах присутствуют только небольшие количества фильтруемого материала, или когда они отсутствуют, а частицы имеют размеры менее 10 нм в диаметре, способ на основе ЖХВД более точно служит в качестве предпочтительного способа для мониторинга качества гематинового препарата.

Результаты примера 10 показаны на фиг 10. В этом примере применен предпочтительный способ анализа с помощью ЖХВД на основе ПП и РЛС к АГЧ, которые повторно растворяются из состояния после сушки вымораживанием. Поскольку об АГЧ, выделенных из комплекса железо-сахарид, никогда ранее не сообщалось, их способность к сушке вымораживанием и повторному растворению без разложения, деградации или образования агрегатов железа является особенно неопределенной. Исходный образец объемом 2,5 мл комплекса железо-сахарид SFGCS после выпуска, взятый из герметичной стеклянной ампулы, разделяется на фракцию 1 и фракцию 2 в соответствии со способом хроматографии низкого давления для приготовления АГЧ, по существу не содержащих наполнителей. Фракция 1, содержащая АГЧ, подвергается сушке вымораживанием, как описано выше. Через одну неделю после сушки вымораживанием она повторно растворяется до своего исходного объема (2,5 мл) с помощью воды с чистотой «для ЖХВД». Объем 500 микролитров из 2,5 мл повторно растворенного раствора затем разбавляется до 20,0 мл, и 200 микролитров последнего вводится для анализа с помощью ЖХВД на основе ПП и РЛС, как описано выше. Полученный в результате хроматографический профиль показан на фиг.10. Заметно, что как сигналы РЛС, так и сигналы ПП, не только перекрываются в соответствии с хроматографическими профилями, наблюдаемыми на фиг.1, но и не существует никаких доказательств какого-либо формирования агрегатов железа или АГЧАП, как это наблюдается на фиг.6-9. Посредством настоящего примера демонстрируется также, что ЖХВД с детектированием на основе ПП и РЛС является пригодной для использования при мониторинге качества АГЧ, полученных сушкой вымораживанием.

Пример 11 осуществляется для сравнения реакции на сушку вымораживанием необработанного гематинового препарата в сравнении с обработанным. Три образца комплекса железо-сахарид SFGCS после производства, содержащие АГЧ, сахарозу и остаточные наполнители, подвергаются сушке вымораживанием. Все три образца взяты из одной и той же промышленной партии, но из разных стеклянных ампул. Используемый способ сушки вымораживанием является таким же, как тот, который применяется к гематиновому препарату в примере 10, но, в противоположность примеру 10, АГЧ дают возможность оставаться вместе с их наполнителями в ходе сушки вымораживанием. Целью эксперимента является наблюдение того, появятся ли какие-либо различия по массе у конечного продукта, полученного сушкой вымораживанием, из-за присутствия гидрофильных наполнителей по сравнению с тем же продуктом, полученным сушкой вымораживанием в отсутствие таких гидрофильных наполнителей. Результаты представлены для гематинового препарата, высушенного вместе с его наполнителями, в таблице A.

Таблица A 
№ Образца Масса образца (г) Удаленная вода (%)* Масса после сушки вымораживанием (г) 
1 10,414 77,3 2,373 
2 10,330 79,9 2,169 
3 9,481 78,2 2,070 
Среднее±среднеквадратичная дисперсия 10,075±0,421 78,5±1,1 2,204±0,126 


* Выражается как процент от исходной массы образца

Три дополнительных образца от той же партии гематинового препарата и из того же источника, который используется в таблице A, получают из различных неоткрытых ампул и подвергают обработке в хроматографической колонке низкого давления, как описано выше. Фракция 1 каждого образца (содержащая АГЧ, но без ассоциированных гидрофильных наполнителей, включая сахарозу) затем подвергается сушке вымораживанием, как описано выше. Результаты представлены в таблице B:

Таблица B 
№ Образца Масса образца (г) Удаленная вода (%)* Масса после сушки вымораживанием (г) 
1 9,500 93,50 0,613 
2 7,840 93,70 0,498 
3 3,200 91,47 0,273 
Среднее±среднеквадратичная дисперсия 6,847±2,667 92,89±0,10 0,461±0,140 


* Выражается как процент от исходной массы образца

Результаты исследования ясно показывают, что значительно больший процент воды удаляется из образцов, подвергшихся выделению в колонке и сушке вымораживанием в идентичных условиях.

Хотя настоящее изобретение описано здесь со ссылкой на конкретные варианты воплощения, необходимо понять, что эти варианты воплощения являются только иллюстрациями принципов и применений настоящего изобретения. По этой причине необходимо понять, что могут быть проделаны многочисленные модификации иллюстративных вариантов воплощения и что могут быть созданы другие конфигурации без отклонения от духа и рамок настоящего изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ мониторинга продукта железо-сахаридного комплекса, полученного в процессе производства и содержащего по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, причем указанный мониторинг осуществляют в течение времени, выбранного из группы, состоящей из (а) во время процесса производства указанного комплекса, (b) при завершении процесса производства указанного комплекса, и (с) после производства указанного комплекса, включающий в себя стадии, на которых (1) анализируют указанный комплекс для получения результата анализа, характеризующего указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц в указанном комплексе, и (2) сравнивают результат анализа указанного по меньшей мере одного вида активных гематиновых частиц со стандартом, соответствующим указанному по меньшей мере одному виду частиц.

2. Способ по п.1, в котором указанный результат анализа получают с использованием по меньшей мере одного аналитического метода, выбранного из группы, состоящей из жидкостной хроматографии, усиленной рассеянием света, ультрафиолетовой спектроскопии, спектроскопии видимого света, объединенной ультрафиолетовой спектроскопии и спектроскопии видимого света, ультрафиолетовой спектроскопии с использованием фотодиодных матриц, спектроскопии видимого света с использованием фотодиодных матриц и объединенной ультрафиолетовой спектроскопии и спектроскопии видимого света, каждая из которых использует фотодиодные матрицы, инфракрасной спектроскопии, электронного парамагнитного резонанса, импульсной полярографии, энергодисперсионного рентгеновского анализа, кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения, флуоресцентной спектроскопии, поляриметрии, пиролитической масс-спектрометрии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса, дифференциальной сканирующей калориметрии, жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии, лазерной десорбции из вспомогательной матрицы/ионизационной масс-спектрометрии, капиллярного электрофореза, спектрометрии индуктивно связанной плазмы, атомной абсорбции, электрохимического анализа, анализа с использованием радиоактивных изотопов, включая радиоактивное железо, антител к гематиновым веществам, удержания твердых продуктов после фильтрования через мембранный фильтр, имеющий пористость в пределах от около 0,02 до около 0,45 мкм, жидкостной хроматографии высокого давления, объединенной с рассеянием света, и жидкостной хроматографии высокого давления, объединенной с рассеянием света и использующей чувствительный к массе детектор.

3. Способ по п.2, в котором по меньшей мере один из указанных аналитических методов используют для определения по меньшей мере одной характеристики гематиновой композиции, содержащей очищенный железо-сахаридный комплекс, во время производства указанной композиции и во время завершения производства указанной композиции, а также, необязательно, в один или несколько моментов времени после этого для проверки того, является ли указанная по меньшей мере одна характеристика указанной композиции по существу неизменной во время завершения производства или в один или несколько моментов времени после этого по сравнению со значением или присутствием указанной характеристики во время производства указанной композиции.

4. Способ по п.1, в котором указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц подвергают мониторингу с использованием жидкостной хроматографии высокого давления, объединенной с анализом рассеяния света, или жидкостной хроматографии высокого давления, объединенной с анализом рассеяния света и использующей чувствительный к концентрации детектор.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя стадию первоначального выделения указанного по меньшей мере одного вида активных гематиновых частиц перед получением указанного результата анализа, причем указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц выбирают из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III)-сахарозы, комплекса глюконата натрия-железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III). 

6. Способ по п.1, в котором указанный мониторинг осуществляют с использованием по меньшей мере одного метода, выбранного из группы, состоящей из анализа рассеяния света в сочетании с чувствительным к концентрации детектором, атомной абсорбции, рентгеновского анализа, электрохимического анализа, электронного парамагнитного резонанса, масс-спектрометрии и ультрацентрифугирования, причем указанный мониторинг способен указывать на присутствие агрегата железа.

7. Способ по п.6, в котором указанный агрегат железа состоит по существу из железа, отличного от железо-сахаридного комплекса, и имеет среднюю формульную массу от около 200000 до около 3000000 Да.

8. Способ по п.6, в котором указанный мониторинг используют для вычисления доли железа, отличного от железо-сахаридного комплекса, причем указанная доля меньше или равна около 0,5.

9. Способ очистки композиции, содержащей железо-сахаридный комплекс и разбавитель, причем указанная композиция содержит по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц и по меньшей мере один наполнитель и пригодна для парентерального введения, включающий в себя стадии, на которых (1) по существу отделяют указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц от указанного по меньшей мере одного наполнителя, и, необязательно, (2) высушивают вымораживанием указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц.

10. Способ по п.9, в котором указанный по меньшей мере один наполнитель содержит негематиново активный компонент, выбранный из группы, состоящей из побочных продуктов реакции синтеза железо-сахаридного комплекса, непрореагировавших исходных материалов для синтеза железо-сахаридного комплекса, побочных продуктов деградации железо-сахаридного комплекса, примесей глюканов, полиглюканов, сахаридных лактонов, растворителя и разбавителя. 

11. Способ по п.9, дополнительно включающий в себя указанную стадию (2).

12. Способ по п.9, в котором указанная стадия отделения включает в себя обработку указанной композиции путем пропускания ее через хроматографическую колонку и разделения элюата из колонки на фракции.

13. Способ по п.12, в котором указанную колонку выбирают из группы, состоящей из колонки жидкостной хроматографии высокого давления и колонки эксклюзионной хроматографии, при этом каждая колонка содержит неподвижную фазу.

14. Способ по п.13, в котором, в дополнение к указанному по меньшей мере одному виду активных гематиновых частиц, указанная композиция также содержит агрегат железа, имеющий более высокую молекулярную массу, чем указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, а указанная стадия отделения дополнительно включает в себя (1) идентификацию профиля элюирования указанной композиции, причем указанный профиль элюирования содержит по меньшей мере первый элюат, содержащий указанный агрегат железа/ второй элюат, содержащий указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, и третий элюат, содержащий наполнители, имеющие меньшую молекулярную массу, чем указанный по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц, и (2) отделение указанных первого и третьего элюатов от указанного второго элюата.

15. Способ по п.14, в котором указанный профиль элюирования композиции определяют с использованием по меньшей мере одного детектора, выбранного из группы, состоящей из детектора рассеяния лазерного света, детектора проходящего ультрафиолетового - видимого света, детектора видимого света для детектирования на одной или нескольких заданных длинах волн и детектора показателя преломления.

16. Способ по п.9, в котором указанная гематиновая композиция имеет улучшенную стабильность при хранении.

17. Способ по п.12, в котором по меньшей мере одна из указанных фракций содержит указанные активные гематиновые частицы.

18. Композиция, содержащая активные гематиновые частицы, выбранные из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III)-сахарозы, комплекса глюконата натрия-железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III), причем указанная композиция по существу не содержит наполнителей с молекулярной массой менее около 5000 Да.

19. Композиция по п.18, в которой указанные наполнители включают в себя побочные продукты и непрореагировавшие исходные материалы от синтеза указанных активных гематиновых частиц, побочные продукты деградации и негематиново активные компоненты.

20. Композиция по п.18, содержащая более около 85 мас.% указанных активных гематиновых частиц и соответственно менее 15 мас.% указанных наполнителей.

21. Композиция по п.18, в которой указанные наполнители присутствуют в количестве менее около 5 мас.%.

22. Композиция по п.18, в которой указанные наполнители присутствуют в количестве менее около 2 мас.%.

23. Композиция по п.18, в которой указанные активные гематиновые частицы имеют абсолютную молекулярную массу, составляющую по меньшей мере около 100000 Да.

24. Композиция по п.18, которая по существу не содержит воды и обладает стабильностью при хранении.

25. Композиция по п.18, дополнительно содержащая по меньшей мере один растворитель, разбавитель или их смеси.

26. Композиция по п.25, в которой указанный растворитель, разбавитель или их смесь содержит воду, а указанная композиция пригодна для парентерального введения.

27. Композиция, содержащая активные гематиновые частицы, выбранные из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III)-сахарозы, комплекса глюконата натрия-железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III), при этом указанные активные гематиновые частицы имеют абсолютную молекулярную массу, составляющую по меньшей мере около 100000 Да, и указанная композиция по существу не содержит наполнителей.

28. Композиция по п.27, в которой указанные наполнители включают в себя побочные продукты и непрореагировавшие исходные материалы от синтеза указанных активных гематиновых частиц, побочные продукты деградации и негематиново активные компоненты.

29. Композиция по п.27, дополнительно содержащая по меньшей мере один растворитель, разбавитель или их смеси.

30. Композиция по п.29, в которой указанный растворитель, разбавитель или их смесь содержит воду, а указанная композиция пригодна для парентерального введения.

31. Композиция, пригодная для парентерального введения после восстановления влагосодержания, содержащая по меньшей мере один вид лиофилизированных активных гематиновых частиц и по существу не содержащая наполнителей.

32. Композиция по п.31, в которой указанные лиофилизированные активные гематиновые частицы выбраны из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III)-сахарозы, комплекса глюконата натрия-железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III), и имеют абсолютную молекулярную массу, составляющую по меньшей мере около 100000 Да.

33. Способ приготовления гематиновой композиции с восстановленным влагосодержанием путем объединения воды и композиции по любому из пп.24, 27 и 31.

34. Способ очистки композиции, содержащей железо-сахаридный комплекс и разбавитель, причем указанная композиция содержит по меньшей мере один вид активных гематиновых частиц (АГЧ) и по меньшей мере один наполнитель и пригодна для парентерального введения, включающий в себя стадии, на которых (1) по существу отделяют указанный по меньшей мере один вид АГЧ от указанного по меньшей мере одного наполнителя с получением АГЧ-содержащей фазы, и (2) по существу высушивают указанный по меньшей мере один вид АГЧ.

35. Способ по п.34, в котором указанный по меньшей мере один наполнитель представляет собой негематиново активный компонент, выбранный из группы, состоящей из побочных продуктов реакции синтеза железо-сахаридного комплекса, непрореагировавших исходных материалов для синтеза железо-сахаридного комплекса, побочных продуктов деградации железо-сахаридного комплекса, примесей глюканов, полиглюканов, сахаридных лактонов, растворителя и разбавителя.

36. Способ по п.34, в котором указанная стадия (2) включает в себя сушку вымораживанием.

37. Способ по п.34, в котором указанная стадия отделения включает в себя обработку указанной композиции путем пропускания ее через хроматографическую колонку и разделения элюата из колонки на фракции.

38. Способ по п.37, в котором по меньшей мере одна из указанных фракций содержит указанные АГЧ.

39. Способ по п.37, в котором, в дополнение к указанному по меньшей мере одному виду АГЧ, указанная композиция также содержит агрегат железа, имеющий более высокую молекулярную массу, чем указанный по меньшей мере один вид АГЧ, а указанная стадия отделения дополнительно включает в себя (1) идентификацию профиля элюирования указанной композиции, причем указанный профиль элюирования содержит по меньшей мере первый элюат, содержащий указанный агрегат железа, второй элюат, содержащий указанный по меньшей мере один вид АГЧ, и третий элюат, содержащий наполнители, имеющие меньшую молекулярную массу, чем указанный по меньшей мере один вид АГЧ; и (2) отделение указанных первого и третьего элюатов от указанного второго элюата.

40. Способ по п.34, в котором на стадии высушивания удаляют воду до такой степени, которая выбрана из группы, состоящей из от около 85 до по меньшей мере около 99%, от около 90 до по меньшей мере около 97%, от около 92 до по меньшей мере около 95%.

41. Изделие производства, содержащее герметичный контейнер с содержащимися в нем по существу сухими активными гематиновыми частицами (АГЧ), пригодными для восстановления влагосодержания и парентерального введения.

42. Изделие по п.41, в котором указанный герметичный контейнер представляет собой герметичный мешочек или герметичную ампулу.

43. Изделие по п.41, в котором указанные АГЧ выбраны из группы, состоящей из комплекса гидрата окиси железа(III)-сахарозы, комплекса глюконата натрия-железа(III) в сахарозе и комплекса сахарата железа(III).

44. Композиция, содержащая активные гематиновые частицы (АГЧ) и по существу не содержащая побочных продуктов реакции синтеза, непрореагировавших исходных материалов и ненормальных АГЧ, причем указанные, ненормальные АГЧ выбраны из группы, состоящей из деградировавших АГЧ, агрегированных АГЧ и их смесей.

45. Композиция по п.44, пригодная для парентерального введения после восстановления влагосодержания.