НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ПОЛИ(ПАРАДИГИДРОКСИ- ПАРАФЕНИЛЕН)ТИОСУЛЬФОКИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ РЕГУЛЯТОРА МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И АНТИГИПОКСАНТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕЕ ОСНОВЕ

НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ПОЛИ(ПАРАДИГИДРОКСИ- ПАРАФЕНИЛЕН)ТИОСУЛЬФОКИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ РЕГУЛЯТОРА МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И АНТИГИПОКСАНТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕЕ ОСНОВЕ


RU (11) 2257202 (13) C2

(51) 7 A61K31/185, A61P3/00 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2000129927/15 
(22) Дата подачи заявки: 2000.12.01 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.12.01 
(43) Дата публикации заявки: 2002.10.20 
(45) Опубликовано: 2005.07.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2105000 С1 20.02.1998. RU 2124888 С1 20.01.1999. RU 2032661 С1 10.04.1995. RU 2098085 С1 10.12.1997. SI 9011538 A 31.08.1998. US 5371088 A1 06.12.1994. WO 9730703 A1 28.08.1997. 
(72) Имя изобретателя: Медведев Ю.В. (RU); Соболев Д.В. (RU); Александрова А.Е. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Соболев Дмитрий Владимирович (RU) 
(98) Адрес для переписки: 191186, Санкт-Петербург, а/я 230, "АРС-Патент", пат.пов. С.В. Новоселовой, рег.№ 622 

(54) НАТРИЕВАЯ СОЛЬ ПОЛИ(ПАРАДИГИДРОКСИ- ПАРАФЕНИЛЕН)ТИОСУЛЬФОКИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ РЕГУЛЯТОРА МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И АНТИГИПОКСАНТА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕЕ ОСНОВЕ
Изобретение относится к фармакологии и медицине, а также может быть использовано в косметологии и пищевой промышленности, и касается препаратов, регулирующих метаболизм отдельно взятых клеток и их сообщества в биологических тканях.Предложена натриевая соль поли (пара-дигидрокси-пара-фенилен) тиосульфокислоты общей формулы



где n = 2-6,

в качестве регулятора метаболизма клеток и антигипоксанта. Также предложена фармацевтическая композиция на основе указанного соединения. Использование соединения обеспечивает выраженный антигипоксический эффект. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 10 табл., 4 ил.






ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к фармакологии и медицине, а также может быть использовано в косметологии и пищевой промышленности, и касается препаратов, регулирующих метаболизм отдельно взятых клеток и их сообщества в биологических тканях. 

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исследования последних трех десятилетий показали, что в регулировании клеточного гомеостаза особо важное значение имеет поддержание баланса между энергопродуцирующими и энергопотребляющими функциями клеток. Особенно остро данная проблема возникает в случае возникновения в тканях или в организме в целом состояния гипоксии, связанного с недостаточным поступлением кислорода или нарушением механизмов его утилизации. Показано, что гипоксия вызывает сильнейший клеточный стресс и приводит к появлению обратимых или необратимых клеточных повреждений в зависимости от продолжительности и силы воздействия стрессового фактора (Deguchi J., Negoro S., Kishimoto S. // Biochem. & Biophys. Communs., 1987, Vol.149, No.3, p.1093-1098, [1]). Восстановление снабжения кислородом тканей после гипоксии (реоксигенация) сопровождается дополнительным повреждением элементов клеточных структур.

Для защиты тканей от повреждающего воздействия гипоксии или реоксигенации предложено использовать антигипоксанты. В настоящее время выделяют 5 типов подобных препаратов (Смирнов А.В., Криворучко Б.И. Сб.: Применение инфузионных антигипоскантов и искусственных переносчиков кислорода в хирургии, - СПб.: 1999, с.53-62, [2]). 

К первой группе относят препараты типа гутимина и амтизола, которые усиливают гликолиз и повышают синтез аденозинтрифосфата (АТФ) в результате процесса анаэробного окисления субстрата.

Вторую группу антигипоксантов составляют вещества макроэргической природы (креатинфосфат, АТФ).

Остальные три группы антигипоксантов составляют препараты, регулирующие активность главной энергопродуцирующей системы клеток - митохондриальной дыхательной цепи. В частности, в третью группу включены препараты, поддерживающие высокую активность одного из двух субстратных участков дыхательной цепи - сукцинатоксидазного. К этой группе относится янтарная кислота, оксибутират натрия, препараты мексидол и муфасол.

К четвертой группе антигипоксантов относят синтетические препараты с электроноакцепторными свойствами, представляющие собой производные хинонов.

В пятую группу антигипоксантов включены цитохром С и убихинон Q10 (коэнзим Q10), являющиеся естественными компонентами митохондриальной дыхательной цепи.

Среди перечисленных антигипоксантов особый интерес представляет убихинон Q10 , поскольку в митохондриальной цепи он играет ключевую роль в переносе электронов от субстратных участков (никотинамидадениндинуклеотид оксидазы (НАДН-оксидазы) или сукцинатоксидазы) на цитохромную цепь.

Дефицит убихинона Q10 блокирует перенос электронов по дыхательной цепи и ведет к прекращению синтеза АТФ.

При изучении соотношения между убихиноном и остальными партнерами по дыхательной цепи было обнаружено преобладание на порядок первого над остальными компонентами. Кажущаяся “расточительность” природы, использовавшей при конструировании дыхательной цепи большой избыток одного из элементов конструкции по сравнению с остальными, удалось понять, изучив более детально механизм функционирования коэнзима Q10. Оказалось, что реальным партнером, непосредственно участвующим во взаимодействии с субстратными участками дыхательной цепи, является не убихинон Q10 , а его полувосстановленная свободнорадикальная форма - убисемихинон (Nohl H. Free Rad. Res. Communs, 1990, Vol.8, No.4-6, р.307-315, [3]). Поскольку пордолжительность жизни убисемихинона крайне мала, и он диспропорционирует на убихинон Q10 и убихинол Q10 (восстановленную форму убихинона), избыток коэнзима необходим для поддержания оптимальной концентрации убисемихинона. 

Учитывая важную роль молекул, содержащих неспаренный электрон, в работе митохондриальной дыхательной цепи, одной из задач исследования было получение продукта, способного более продолжительное время по сравнению с убисемихиноном находиться в свободнорадикальном состоянии, и оценка эффективности его антигипоксической активности. 

Наиболее близким структурным аналогом предложенного соединения является натриевая соль [поли-(2,5-дигидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты (мета НПФ), состоящей из последовательно соединенных между собой в мета-положении гидрохиноидных звеньев, имеющих в крайнем звене заместитель в виде натриевой соли тиосульфокислоты. Продукт получают взаимодействием пара-бензохинона с тиосульфатом натрия в водно-спиртовой среде при температуре выше 65°С. Показано, что продукт влияет на метаболизм клеток (Патент РФ №2105000, МПК6: С 07 С 381/02, C 08 G 61/10, А 61 К 31/05, [4]).

В современной фармакологии известны почти две тысячи различных регуляторов клеточного метаболизма, из которых только около ста являются препаратами фенольного типа (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 13-е в двух томах. - Харьков: Торсинг, 1997, [5]).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является расширение спектра препаратов, регулирующих метаболическую активность клеток, в том числе проявляющих антигипоксическую активность. 

В результате проведенных исследований было показано, что желаемой активностью - способностью регулировать метаболизм клеток, в том числе регулировать их энергетический обмен - обладает натриевая соль поли(пара-дигидроски-пара-фенилен)тиосульфокислоты (далее также для краткости называемая “пара-НПФ”), имеющая следующую структурную формулу:



где n=2-6.

Брутто-формула продукта: C6n H4n+1O2n+3S2Na.

Продукт был получен в результате реакции пара-бензохинона с тиосульфатом натрия в водной среде при нагревании от 50 до 100°С. Образующийся в результате реакции продукт отделяют от растворителя, очищают от низкомолекулярных примесей с помощью диэтилового эфира и сушат от экстрагента под вакуумом при температуре 50°С. Более подробно условия синтеза продукта и его свойства описаны в нижеследующих примерах.

Принципиальное отличие предложенного соединения от его аналога заключается в том, что известное соединение состоит из звеньев гидрохинона, соединенных между собой в мета-положении, тогда как в предложенном соединении эти звенья расположены в пара-положении. Как известно, изменение химической структуры вещества неизбежно связано с изменением его свойств. Из химии ароматических соединений известно, что заместители, расположенные в мета-положении ароматического ядра, оказывают слабое взаимное влияние друг на друга, тогда как заместители, расположенные в пара-положении, сильно влияют друг на друга и на молекулу в целом. Наиболее ярким проявлением особых свойств продукта, предложенного в соответствии с настоящим изобретением, по сравнению с аналогом является проявление характерного сигнала, регистрируемого с помощью метода спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектроскопии), свидетельствующего о наличии в образцах пара-НПФ неспаренных электронов, которые не были зафиксированы в образцах аналога (Фиг.1). Важно отметить также, что в отличие от малостабильного убисемихинона, для регистрации спектра которого применяют замораживание, ЭПР-спектры образцов пара-НПФ сохраняют устойчивость месяцами в условиях комнатной температуры. Наличие стабильного сигнала ЭПР в образцах пара-НПФ связано с проявлением сильного взаимодействия между всеми фенильными ядрами, соединенными друг с другом в пара-положении, при этом образуется достаточно протяженная система сопряжения, обеспечивающая эффективную стабилизацию неспаренного электрона в пределах молекулы. Спектр ЭПР наблюдается как для твердого пара-НПФ (кривая 1 на Фиг.1), так и для его водного раствора (кривая 2 на Фиг.1).

Проверка возможного влияния пара-НПФ на аэробный энергетический метаболизм проводилась на изолированных митохондриях скелетных мышц. Оценивалось влияние препарата на скорости эндогенного дыхания митохондрий (V0), дыхания митохондрий в метаболических состояниях 3 (V3) и 4 (V4) по Чансу, а также скорость разобщенного дыхания в присутствии разобщителя - 2,4-динитрофенола (VДНФ ). Рассчитывался коэффициент дыхательного контроля по Чансу-Вильямсу (ДКч-в) и коэффициент фосфорилирования (АДФ/О) (Краковский М.Э., Аширметов А.X., Иноятова Ф.X. Вопр. мед. химии, 1986, т.32, №6, с.66-70, [6]). Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1

Влияние препарата пара-НПФ на дыхание и фосфорилирование изолированных митохондрий скелетных мышц крыс 
Показатели Контроль Конц пара-НПФ (мкМ/л) 
1,2 2,4 6,0 
V 0 15,0 16,1 17,9 22,6 
V3 113,0 85,7 83,9 60,4 
V 4 46,3 26,0 22,3 21,7 
VДНФ 82,4 62,5 54,5 52,8 
ДК Ч-В 2,4 3,3 3,8 2,8 
АДФ/О 1,75 1,94 2,63 1,85 


Из Таблицы 1 следует, что пара-НПФ активно влияет на аэробный энергетический метаболизм, при этом достигаемый эффект зависит от дозы препарата. Значения дыхательного контроля (ДКЧ-В ) и коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирования и дыхания (АДФ/О) по мере увеличения концентрации пара-НПФ вначале растут, что соответствует более эффективной энергопродуцирующей функции митохондрий, а затем падают (разобщающий эффект).

При внесении пара-НПФ в состав глюкозо-минеральной питательной среды, содержащей (г/л) глюкозу - 4, Na2HPО4 - 7, КН2РО4 - 3, NH4Cl - 1, NaCl - 0,5, MgSO4 - 0,2, СаСl2 - 0,02, никотиновую кислоту - 0,005, пара-НПФ - 0,02, при культивировании факультативных аэробов Escherichia coli штамм М-17 время генерации микробной популяции на стадии логарифмического роста культуры сокращалось на 24±12% по сравнению с контролем (эффект стимуляции роста). Внесение 50 мг/л пара-НПФ в культуральную жидкость замедляет развитие микробных клеток (эффект ингибирования роста).

Представленные результаты показывают, что пара-НПФ участвует в регуляции метаболических процессов как в случае прокариотических, так и эукариотических клеток. Возможность повышения сопряженности процессов фосфорилирования и дыхания, подтвержденная на модели изолированных митохондрий скелетных мышц, позволяет рассматривать пара-НПФ в качестве активного антигипоксанта прямого действия. 

Предложенная в соответствии с настоящим изобретением натриевая соль поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты может быть применена в качестве антигипоксического препарата в составе фармацевтической композиции в любой подходящей фармацевтической форме, известной специалистам в данной области, например в форме таблетки, капсулы или раствора. Фармацевтическая композиция также может включать известные фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители, связующие вещества и носители. Доза фармацевтической композиции должна содержать, в зависимости от назначения, по меньшей мере, терапевтически или профилактически эффективное количество активного соединения - натриевой соли поли(пара-дигидрокси-пара-фенилен)тиосульфокислоты. 

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 изображен спектр электронного парамагнитного резонанса (ЭПР-спектр) молекулы натриевой соли поли(пара-дигидроски-пара-фенилен)тиосульфокислоты (пара-НПФ). Кривая 1 представляет собой ЭПР-спектр порошка пара-НПФ, а кривая 2 - ЭПР-спектр, полученный при 20-кратном разбавлении пара-НПФ водой (ЭПР-спектр 5%-ного водного раствора пара-НПФ). 

На Фиг.2 представлен ИК-спектр пара-НПФ в таблетке КВг. 

На Фиг.3 изображены УФ-спектры поглощения водного раствора пара-НПФ (кривая 3) и водного раствора гидрохинона (кривая 4). 

На Фиг.4 изображен 13С-ЯМР спектр пара-НПФ в твердой фазе.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ 

Для лучшего понимания сути изобретения приведены следующие примеры.

Пример 1.

В аппарат емкостью 2 л, снабженный мешалкой и рубашкой, помещают 76,6 г (0,31 М) тиосульфата натрия в 1 л дистиллированной воды. Раствор нагревают до температуры 50°С и при интенсивном перемешивании вводят 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 2,5 часа процесс прекращают и образовавшийся продукт сушат на распылительной сушилке. Сухой порошкообразный продукт помещают в аппарат Сокслетта и удаляют примеси с помощью диэтилового эфира в качестве экстрагента. Время экстракции - 24 часа. Затем продукт сушат под вакуумом при температуре 50°С. Выход целевого продукта 102,7 г. Молекулярная масса, определенная криоскопическим методом, равна 440. Содержание серы по данным элементного анализа составляет 16,2%.

На Фиг.2 представлен ИК-спектр образца в таблетке КВг. На нем видна широкая полоса поглощения в области 3600-2000 см-1, относящаяся к валентным колебаниям НО-групп; полосы при 1200 и 1040 см -1 относятся к валентным колебаниям SО3-групп. Набор полос в области 1600-1500 см-1 относится к валентным колебаниям связей С=С в ароматическом кольце, а полоса при 830 см-1 связана с неплоскими деформационными колебаниями связи С-Н в тетразамещенном бензольном кольце.

На Фиг.3 представлены УФ-спектры растворов пара-НПФ (кривая 3) и гидрохинона (кривая 4) в воде. Гидрохинон можно рассматривать в качестве модельного соединения для элементарного звена пара-НПФ. Два слабо выраженных пика в области 45000 и 33000 см-1, наблюдаемые в спектре пара-НПФ, смещены в более низкочастотную область по сравнению с характерными полосами поглощения гидрохинона 45200 и 32780 см-1. Подобное смещение, а также непрерывное поглощение образца от ультрафиолетовой (УФ-) до видимой области спектра свидетельствует об эффективном сопряжении в синтезированном продукте.

Пример 2.

В аппарат, описанный в примере 1, помещают 23 г (0,093 М) тиосульфата натрия в 1 л дистиллированной воды, раствор нагревают до 90°С и вводят при интенсивном перемешивании 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 1,5 часа реакцию прекращают и содержимое сушат на распылительной сушилке. Выделенный сухой продукт экстрагируют диэтиловым эфиром в течение 24 часов, затем сушат под вакуумом при температуре 50°С. Выход целевого продукта 80,2 г. По данным элементного анализа содержание серы составляет 10,8%, молекулярная масса полученного продукта равна 750.

Присоединение гидрохиноидных звеньев в синтезированном образце в пара-положении друг относительно друга подтверждается данными спектроскопии ядерного магнитного резонанса 13С-ЯМР по наличию полосы поглощения при 147,87 м.д., характерной для Саром.-Саром. связи между бензольными кольцами (Фиг.4).

Пример 3. Оценка влияния пара-НПФ на метаболизм клеток

Для оценки влияния пара-НПФ, полученного в примере 1, на метаболическую активность клеток была использована культура гриба Aspergillus oryzae, являющегося продуцентом амилолитических ферментов. Данный гриб относится к строгим аэробам и выращивается на плотных питательных средах. Из-за ограничений с диффузией кислорода воздуха внутрь “коржа” эффективность продуцирования амилолитических ферментов прогрессивно снижается по мере увеличения толщины слоя плотной питательной среды. В таблице 2 приведены данные по амилолитической активности гриба из проб, взятых из образцов с толщиной “коржа” 1, 3 и 4 см.

Таблица 2

Влияние пара-НПФ на амилолитическую активность гриба Aspergillus oryzae 
Толщина “коржа”, см Концентрация пара-НПФ, мг/л 
25 50 100 
Контроль Опыт Эффект, % Контроль Опыт Эффект, % Контроль Опыт Эффект, % 
1 394 362 -8 394 397 -1 327 370 15 
3 233 299 28 233 286 23 210 226 8 
4 168 156 -7 168 246 46 141 172 22 


Из таблицы 2 видно, что вблизи поверхности плотной питательной среды, где условия аэрации максимально благоприятны для развития культуры, добавка пара-НПФ мало сказывается на амилолитической активности гриба. Однако по мере увеличения толщины “коржа” с ростом ограничений по диффузии кислорода амилолитическая активность гриба снижается. В этих условиях добавление пара-НПФ в питательную среду заметно повышает амилолитическую активность гриба Aspergillus oryzae.

Пример 4. Оценка антигипоксической активности пара-НПФ 

В аппарат, описанный в примере 1, помещают 38,3 г (0,15 М) тиосульфата натрия в 1 л дистиллированной воды, раствор нагревают до 70°С и при интенсивном перемешивании вводят 100 г (0,93 М) пара-бензохинона. Через 2 часа реакцию прекращают и содержимое сушат на распылительной сушилке. Полученный продукт экстрагируют в течение суток диэтиловым эфиром и сушат от экстрагента под вакуумом при 50°С. Выход целевого продукта - 95,7 г. По данным элементного анализа содержание серы составляет 11,7%. Молекулярная масса полученного образца равна 650.

Оценку антигипоксического действия пара-НПФ проводили на модели гипоксической гипоксии при моделировании в барокамере подъема на высоту 12000 м над уровнем моря. В качестве подопытных животных использовались крысы. Использовалась барокамера с приточно-вытяжной вентиляцией, исключающей накопление углекислого газа. Был использован следующий режим “подъема” животных: первые 5000 м - за 3 минуты, каждые последующие 1000 м - за 1 минуту. На высоте 12000 м производили экспозицию крыс в течение 45 минут. Эффективность препарата оценивалась по следующим показателям: выживаемость животных (в %), продолжительность жизни на высоте (мин), коэффициент эффективности антигипоксического воздействия препарата (), определяемый по отношению продолжительности жизни на высоте животных, получивших препарат, к продолжительности жизни животных в контрольной группе контролю. В качестве эталонного препарата был использован убихинон Qio. Результаты опыта представлены в Таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная антигипоксическая активность пара-НПФ и убихинона Q10 в оптимальных дозах на модели гипоксической гипоксии (крысы) 
Условия опыта Число крыс Доза препарата, мг/кг Время введения препарата до подъема Выживаемость, % Продолжительность жизни крыс, мин 
Контроль 20 0 45 0 12±1,7 3,5±0,3 
Пара-НПФ 20 10 45 80 41,5±2,2 
Контроль 20 о 80 0 9,6±1,7 2,3±0,4 
Убихинон Q10 20 200 80 0 22,8±0,6 


На модели гипоксической гипоксии преимущество пара-НПФ по сравнению с убихиноном Q10 проявилось как в увеличении продолжительности жизни животных при экспозиции “на высоте” 12000 м, так и в выживаемости 80% крыс, тогда как все контрольные животные и животные, получившие убихинон Q10, погибли.

В таблице 4 представлены результаты сравнительной эффективности пара-НПФ и убихинона Q10 на модели гистотоксической гипоксии. В эксперименте использовали мышей, которым вначале вводили внутрибрюшинно антигипоксанты, а через 45 минут - летальную дозу цианида калия, составляющую 15 мг/кг массы.

Таблица 4

Сравнительная антигипоксическая активность пара-НПФ и убихинона Q10 на модели гистотоксической гипоксии (доза цианида калия 15 мг/кг, внутрибрюшинно) 
Условия опыта Число животных Доза препарата, мг/кг Число выживших животных Продолжительность жизни животных, мин 
Контроль 68 0 0 2,53±0,18 - 
Пара-НПФ 14 15 0 3,81±0,26 1,5 
10 35 1 5,08±0,51 2,0 
45 70 18 5,38±0,48 2,1 
Убихинон Q 10 12 100 0 2,55±0,14 1,0 
16 200 0 3,43±0,20 1,4 


Таким образом, защитный эффект пара-НПФ при введении летальной дозы цианистого калия оказался более высоким по сравнению с убихиноном Q10.

В Таблице 5 представлены результаты сравнительной эффективности пара-НПФ и убихинона Q10 на модели циркуляционной гипоксии, вызванной кровопотерей. Опыты поставлены на крысах, у которых из общей сонной артерии отбирали кровь в объеме 3 мл крови на 100 г массы животного. Препараты вводили внутрибрюшинно за 45 мин до кровопотери. Отслеживали количество выживших животных через 6, 12 и 24 часа после кровопотери.

Таблица 5

Сравнительная антигипоксическая активность пара-НПФ и убихинона Q10 на модели циркуляционной гипоксии, вызванной кровопотерей 
Условия опыта Число крыс Выживаемость крыс после кровопотери, % 
6 час 12 час 24 час 
Контроль 30 0 0 0 
пара-НПФ 30 70 60 60 
Убихинон Q10 30 20 0 0 


Нетрудно видеть, что на модели циркуляционной гипоксии, вызванной кровопотерей, антигипоксический эффект пара-НПФ существенно превосходит аналогичный эффект убихинона Q10.

Пример 5. Оценка острой и хронической токсичности пара-НПФ

Острую токсичность препарата определяли на мышах-самцах массой 20-25 г при внутрибрюшинном введении 7%-ного водного раствора пара-НПФ. Летальную дозу ЛД50 рассчитывали по методу Беренса. Оказалось, что летальная доза зависит от молекулярной массы препарата. Для образца пара-НПФ, описанного в примере 1 (молекулярная масса М=440), летальная доза ЛД50 составляет 520 мг/кг, для образца пара-НПФ, описанного в примере 2 (М=750), летальная доза ЛД50 составляет 920 мг/кг, а для образца пара-НПФ, описанного в примере 4 (М=650), летальная доза ЛД 50 составляет 810 мг/кг.

Хроническую токсичность препарата определяли на крысах-самцах. При введении образца пара-НПФ, описанного в примере 4 (М=650), в дозе 20 мг/кг ежедневно в течение 1 года видимых изменений в поведении животных не выявлено. Проведенные гистологический исследования образцов легких, сердца, печени, почек, селезенки, щитовидной железы, скелетной мышцы не выявили патологических изменений по сравнению с контролем.

Пример 6. Сравнение биологической активности пара-НПФ и мета-НПФ

Задачей исследования было сравнение биологической активности соединения согласно изобретению (пара-НПФ) и его ближайшего структурного аналога - мета-НПФ, описанного в упомянутом выше патенте РФ №2105000. Биологическая активность мета-НПФ описана также в патенте РФ № 2124888. В качестве экстремального фактора была выбрана острая гипоксическая гипоксия.

Методика

Исследование выполнено на беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г в условиях хронического эксперимента. Предварительно у крыс исследовали индивидуальную устойчивость к острой гипоксической гипоксии. Для этого изучали время выживания их "на высоте" 12000 м, скорость "подъема" на высоту составляла 75 м/с. Согласно методике В.А.Березовского, определяли время устойчивости от момента достижения высоты 12000 м и до появления атонального дыхания или приступа судорог. Животные, имеющие низкую устойчивость к гипоксии, из эксперимента исключались. За неделю до основного эксперимента ежедневно внутрибрюшинно крысам I (контрольной) группы вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (15 животных), II группы - мета-НПФ 1 мл 4% раствора (14 животных), III группы - пара-НПФ 1 мл 4% раствора (16 животных). Для всех трех препаратов доза составила 40 мг/кг. Доза мета-НПФ и пара-НПФ была предварительно подобрана в тесте физической работоспособности. Через три дня после теста с гипоксической гипоксией у животных изучали в крови маркеры неспецифической резистентности.

В нижеследующих таблицах количество животных в группе обозначено “п”.

Результаты 

Приведенные в Таблице 6 результаты исследования показали, что пара-НПФ проявляет большую эффективность в отношении устойчивости к гипоксической гипоксии.

Таблица 6 
Группы Количество животных Время устойчивости к гипоксии (с) 
Минимальное Максимальное Среднее Ошибка среднего Процент от контроля 
I (контроль) 15 31 144 77,3 19,05 100 
II (мета-НПФ) 14 44 217 114,2 23,44 147 
III (пара-НПФ) 16 48 219 128 23,7 166 


Результаты исследования показателей нейроэндокринной регуляции представлены в Таблице 7, белков сыворотки крови - в Таблице 8, углеводного обмена - в Таблице 9, процессов пероксидации и состояния антиоксидантной системы - в Таблице 10.

Таблица 7

Показатели нейроэндокринной регуляции (X±х) 
Показатели Группы животных 
I (контроль)

п=15 II (мета-НПФ)

п=14 III (пара-НПФ)

п=16 
Катехоламины (мкг/л) 2,13±0,14 2,67±0,06 1,72±0,13 
Адреналин (мкг/л) 1,1+0,08 0,92±0,05 1,06±0,13 
Норадреналин (мкг/л) 1,83±0,07 1,05±0,05 1,56±0,07 
Норадреналин (усл. ед.) Адреналин 1,86±0,08 2,0±0,16 1,59±0,2 
Ацетилхолин (мкг/л) 2,14±0,06 2,11±0,04 1,90±0,05 
Катехоламины (усл. ед.) Ацетилхолин 1,67±0,08 0,80±0,03 1,47±0,06 
Ацетилхолин (усл. ед.) Норадреналин 1,43±0,05 2,01±0,08 1,14±0,09 
Примечание: - различия достоверны 


Таблица 8

Содержание белков в сыворотке крови (Х±х) 
Показатели Группы животных 
I (контроль)

п=15 II (мета-НПФ)

п=14 III (пара-НПФ)

п=16 
Общий белок (г/л) 68,7±1,4 73,2±1,8* 79,8±1,5* 
Альбумин (г/л) 32,8±1,0 40,8±1,8* 36,3±1,7* 
1 - глобулины (%) 4,3±0,4 4,5±0,5 5,3±0,2 
2 - глобулины (%) 12,2±0,8 12,1±0,9 11,6±0,3 
- глобулины (%) 12,3±0,6 12,5±0,7 12,1±0,4 
- глобулины (%) 20,3±0,5 19,5±0,6 22,8±0,6 
1 - глобулины (%) 4,3±0,4 4,5±0,5 5,3±0,2 
2 - глобулины (%) 12,2±0,8 12,1±0,9 11,6±0,3 
- глобулины (%) 12,3±0,6 12,5±0,7 12,1±0,4 
- глобулины (%) 20,3±0,5 19,5±0,6 22,8±0,6 
Примечание: - различия достоверны 
Таблица 9

Показатели углеводного обмена (Х±х) 
Показатели Группы животных 
I (контроль)

п=15 II (мета-НПФ)

п=14 III (пара-НПФ)

п=16 
Глюкоза (ммоль/л) 2,7±0,07 4,51±0,09 4,28±0,08 
Лакт (ммоль/л) 183±18,5 185,0±20,0 151,0±17,0 
Пируват (ммоль/л) 9,7±1,89 10,31±0,81 13,3±1,6 
Гликоген (отн. ед.) 0,28±0,09 0,15±0,01 0,19±0,01 
Г-6ФДГ(отн. ед.) 53,2±3,9 54,0±6,0 43,5±3,8 
ЩФ (отн. ед.) 121±6,5 121,0±2,0 105,0±6,08 
Примечание: - различия достоверны 


Таблица 10

Показатели процессов пероксидации и состояния антиоксидантной системы(Х±х) 
Показатели Группы животных 
I (контроль)

п=15 II (мета-НПФ)

п=14 III (пара-НПФ) 

п=16 
Малоновый диальдегид (мкмол/л) 3,3±0,13 3,6±0,15 6,1±0,36 
Супероксиддисмутаза (уел. ед.) 1,83±0,06 2,09±0,24 2,1±0,19 
Витамин “Е” (мкмоль/л) 3,7±0,16 5,31±0,51 7,6±0,35 
Дегидроаскорбиновая кислота (мкмоль/л) 4,2±0,17 7,6±0,62 6,8±0,34 
Аскорбиновая кислота (мкмоль/л) 3,9±0,14 17,7±1,31 17,66±0,78 
Общая аскорбиновая кислота (мкмоль/л) 18,6±1,2 29,3±1,25 24,6±1,62 
Аскорбиновая / Дегидроаскорбиновая кислота (усл.ед.) 2,1±0,12 3,12±0,38 3,21±0,24 
Бета-каротин (мкг/дл) 12,3±0,9 17,9±4,15 21,3±0,59 
Ретинол (мкг/дл) 8,7±0,7 7,7±1,29 12,5±3,1 
Восстановленный глутатион (мкмоль/л) 1,0±0,06 1,1±0,03 1,39±0,07 
Окисленный глутатион (мкмоль/л) 3,1±0,5 2,6±0,02 1,7±0,06 
Общий глутатион (мкмоль/л) 12,5±0,5 13,4±0,04 18,6±0,07 
Примечание: - различия достоверны 


ВЫВОДЫ

1. Пара-НПФ обеспечивает более выраженный антигипоксический эффект, чем мета-НПФ.

2. Действие экстремального фактора после введения в организм мета-НПФ или пара-НПФ приводит к увеличению неспецифической резистентности, при этом повышение неспецифической резистентности более выражено при использовании пара-НПФ, что свидетельствует о том, что пара-НПФ обладает более выраженным стресспротективным действием.

3. Механизм действия пара-НПФ при действии экстремальных факторов заключается в оптимизации нейроэндокринной регуляции, усилении белкового синтеза, анаэробного окисления.

4. Пара-НПФ обладает более выраженным защитным противоокислительным действием, чем мета-НПФ.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Натриевая соль поли(парадигидрокси-парафенилен)тиосульфокислоты общей формулы



где n = 2 ÷ 6,

в качестве регулятора метаболизма клеток.

2. Натриевая соль поли(парадигидрокси-парафенилен)тиосульфокислоты по п. 1 в качестве антигипоксанта.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала терапевтически или профилактически эффективное количество антигипоксанта, отличающаяся тем, что в качестве антигипоксанта используют натриевую соль поли(пара-дигидрокси-парафенилен)тиосульфокислоты, как она определена в п.1 или 2.

4. Фармацевтическая композиция по п. 3, отличающаяся тем, что дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, связующее вещество или инертный наполнитель.