ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТАРЧЕСКОГО СЛАБОУМИЯ

ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТАРЧЕСКОГО СЛАБОУМИЯ


RU (11) 2248800 (13) C2

(51) 7 A61K31/715, A61P25/28 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.03.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2001130882/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.05.12 
(30) Приоритетные данные: M199A001066 1999.05.14 IT 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.05.12 
(43) Дата публикации заявки: 2003.08.27 
(45) Опубликовано: 2005.03.27 
(56) Аналоги изобретения: ЕР 0293974 А, 07.12.1988. RU 2125047 C1, 20.01.1999. RU 2070042 C1, 10.12.1996. RU 2106864 C1, 20.03.1998. US 4847338 А, 07.11.1989. US 4351938 A, 28.09.1982. 
(72) Имя изобретателя: КОРНЕЛЛИ Умберто (IT); ДЕ АМБРОЗИ Луиджи (IT); ХАНИН Израэль (US); ФЭРИД Джоид (US); ЛИ Джон (US); ЛОРЕНС Стэнли (US); МЕРВИС Роналд Ф. (US) 
(73) Имя патентообладателя: КОРНЕЛЛИ Умберто (IT) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2001.12.14 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: EP 00/04311 (12.05.2000) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 00/69444 (23.11.2000) 
(98) Адрес для переписки: 107023, Москва, ул. Б.Семеновская, 49, оф.404, Центр "ИННОТЭК", пат.пов. Т.А.Вахниной 

(54) ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТАРЧЕСКОГО СЛАБОУМИЯ
Изобретение относится к фармакологии. Используют гликозаминогликаны со средней молекулярной массой 2400 Д для приготовления фармацевтической композиции для лечения старческого слабоумия и неврологических церебральных поражений, возникших в результате внезапного приступа или травмы. Предложенное решение расширяет арсенал лекарственных средств. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 8 табл., 2 ил.






ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к гликозаминогликанам с низкой молекулярной массой, подходящим для лечения старческого слабоумия и церебральных неврологических поражений в результате внезапного приступа и травм.

ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Старческое слабоумие, в частности в форме болезни Альцгеймера, в основном отличается церебральными отложениями амилоидного вещества в кровяных пластинках или в церебральных сосудах (сосудистый амилоид), или в церебральном веществе (церебральный амилоид), оба определены как амилоид или А. Другое типичное отличие старческого слабоумия на патофизиологическом уровне состоит в присутствии в нейронах фибриллярных сплетений, обозначенных NFT (нейрофибриллярные сплетения).

Известно, что протеогликаны (PGs) и, в частности, протеогликан гепарансульфат (HSPG), участвуют или в полимеризации А, или в агрегации NFTs, так же, как и в других патологических случаях, связанных с болезнью Альцгеймера и вообще со старческим слабоумием (Snow AD; Sekiguchi R; Nicholin D et al. "An Importal Role of Heparan Sulfate Proteoglycan (Perlakan) in a Model System for the Deposition and Persistance of Fibrillar Beta Amyloid in Rat Brain". Neuron 1994; 12: 219-234) и (Perry G;

Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al. "Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimers Disease". J. Neurosci. 1991; 11: 3679-3683).

Кроме того, в оригинальной статье Snow (Willmer JP; Snow AD; Kisilevski R. "The Demonstration of Sulfate Glycosaminoglycans in Association with the Amyloidogenic Lesoins in Alzheimers Disease". J. Neuropath. Exp. Neurol. 1986; 45: 340-346) обнаруживает наличие протеогликанов (PGs) и гликозаминогликанов (GAGs) в церебральных амилоидных бляшках у пациентов, страдающих старческим слабоумием. 

В некоторых исследованиях показано (Kalaria RN; Kroon SN; Grahovak I; Perry G. "Acetylcholinesterase and its Association with Heparan Sulfate Proteoglycans in Cortical Amyloid Deposits of Alzheimers Disease". Neuroscience 1992; 51: 177-184), что ассоциация между PGs и амилоидом может быть вызвана или прямым связыванием с предшественником амилоида (АРР), или связыванием с А 1-41, или с А 1-43, которые включают в себя нейротоксичные последовательности А. 

Доказано, что PGs увеличивают также полимеризацию белка Tau-2 (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M et al. "Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimers Disease". J. Neurosci. 1991; 11: 3679-3683), который является причиной образования нейрофибриллярных сплетений (NFT).

Более того, в исследовании, проведенном Lorens et al. (Lorens SA: Gushawan BS:

Van De Kar L: Walegnga JM; Fareed J. "Behavioural, Endocrine, and Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatment in the Aged Fischer 344 Male Rat". Semin Thromb. Haemost. 17 Suppl. 1993; 2: 164-173) на взрослых крысах, показано, что происходит улучшение поведенческого дефицита после перорального введения гликозаминогликанов с высокой молекулярной массой (GAP или полисульфатированных гликозаминогликанов или Ateroid®).

Conti et al. (Conti L; Placidi GF; Cassano GB; "Ateroid® in the Treatment of Dementia; Results of a Clinical Trial (Eds. Ban E; Lehmann HE) Diagnosis and Treatment of Old Age Dementias" Mod. Probl. Pharmacopsychiatry. Basel, Larger 1989 vol. 2, pp. 76-84) показали, что после лечения Ateroid® у пациентов, страдающих старческим слабоумием, проявляется улучшение характеристик психопатологических параметров и социального поведения в значительно большей степени, чем у пациентов, принимавших плацебо. 

Pametti et al. (Pametti; Ban ТА; Senin U. "Glycosaminoglycan Polysulfate in Primary Degenerative Dementia". Neuropsychobiology 1995; 31: 76-80) показали, что Ateroid® может значительно улучшить некоторые биохимические параметры, измененные в связи со старческим слабоумием, такие как, например, уровни содержания моноаминоксидазы В кровяных пластинках и допамина и серотонина в цереброспинальной жидкости.

Эти наблюдения дают возможность предполагать, что Ateroid® может быть полезен для лечения старческого слабоумия, и уже в 1988 U.Cornelli и Т. Ваnn получили патент на использование этого продукта для лечения старческого слабоумия (ЕР 293974). 

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время неожиданно обнаружилось в эксперименте in vivo, что фракция гликозаминогликанов, полученная деполимеризацией гепарина и имеющая среднюю молекулярную массу 2400 Д, проявляет исключительную эффективность ингибирования образования амилоида и способствует нейронному росту.

Фракции, имеющие более низкую (640 Д) среднюю молекулярную массу или высокую (4800 Д) молекулярную массу, проявляют определенно более низкую или незначительную эффективность.

Следовательно, фракция гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 Д может быть использована для приготовления фармацевтических композиций, подходящих для лечения старческого слабоумия, в частности для лечения болезни Альцгеймера или старческого слабоумия типа болезни Альцгеймера (SDAT: Senile Dementia Alzheimers Type), и для лечения церебральных неврологических поражений в результате внезапного приступа и травм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 представляет ВЭЖХ-тест гликозаминогликана со средней молекулярной массой 2400 (±200), полученного по описываемому примеру. 

Фиг.2 представляет ЯМР-тест гликозаминогликана со средней молекулярной массой 2400 (±200), полученного по описываемому примеру.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению фракции гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 Д для приготовления фармацевтических композиций, подходящих для лечения старческого слабоумия, в частности для лечения болезни Альцгеймера или SDAT (Senile Dementia Alzheimers Type), и для лечения церебральных неврологических поражений в результате внезапного приступа и травм.

Указанную фракцию гликозаминогликанов получали деполимеризацией гепарина, предпочтительно по способу, состоящему из следующих стадий:

a) водный раствор гепарина обрабатывали гамма-излучением Со 60 в соответствии с патентом U.S.Р. 4987222;

b) раствор, полученный на стадии а), фракционировали гельпроникающей хроматографией на смоле Sephadex G/50 Medium;

c) смесь фракций с молекулярной массой от 1000 до 3000 Д подвергали ультрафильтрации с отсечением 600 Д, промывали и лиофилизировали;

d) лиофилизированный продукт растворяли и фракционировали гельпроникающей хроматографией на смоле Sephadex G/25 Medium;

e) фракции с молекулярной массой от 1920 до 2560 Д, соответствующей средней молекулярной массе 2400 Д, собирали и смешивали.

Для приготовления фракции гликозаминогликанов со средней молекулярной массой 2400 Д по предпочтительному способу настоящего изобретения 10%-й водный раствор гепарина сначала обрабатывали гамма-излучением Со 60 с интенсивностью 120-150 КГр при последующих дозах 25 КГр относительно молекулярной массы гепарина.

Облученный раствор подвергали ультрафильтрации с отсечением 300 Д, очищали, фильтровали в стерильных условиях и лиофилизировали, чтобы получить "маточный деполимеризованный" гепарин.

"Маточный деполимеризованный" гепарин растворяли в 0,3 М растворе NaCl и затем подвергали фракционированию гельпроникающей хроматографией на смоле Sephadex G/50 Medium. 

Фракции с молекулярной массой менее 3000 Д (10%) образуют исходный материал настоящего изобретения.

Первая обработка этой смеси заключалась в ультрафильтрации с отсечением 600 Д для удаления молекулярных фрагментов, образующихся в результате процесса деполимеризации.

Ультрафильтрованную смесь промывали 0,3 М NaCl до исчезновения положительной реакции на карбазол в пермеате.

Конечную смесь при концентрации 8% в дистиллированной воде фильтровали в стерильных условиях на мембранах 0,2 мкм и лиофилизировали.

Лиофилизированный продукт растворяли в 0,3 М растворе NaCl при концентрации 10-15%.

Для того чтобы получить фракцию с молекулярной массой 2400 Д, применяли вторую обработку гельпроникающей хроматографией с сохранением параметров первой гельпроникающей хроматографии, используя, однако, специфические свойства Sephadex G/25 Medium.

Применяли экспериментальную колонну типа ВР 252/15 со следующими характеристиками:

высота...................: 105 см,

объем смолы..............: 5200 мл,

поток....................: 1000 мл/ч.

Приспособленные параметры представлены:

Ve.......................: 17000 мл,

Ve/Vo....................: 1/R=1,26,

R........................: 0,79,

К........................: 0:09=(Ve-Vo):(Vt-Vo),

где Ve=объем элюирования,

t=общий объем смолы,

Vo=мертвый объем (начальный раствор в продукте), R= разрешающая способность (максимальная амплитуда).

При второй гельпроникающей хроматографии получали 10-12 фракций с молекулярной массой от 3000 Д до 1500 Д. Для приготовления фракции гликозаминогликанов по настоящему изобретению собирали и смешивали только фракции с молекулярной массой от 1920 Д до 2560 Д.

Полученный раствор подвергали ультрафильтрации с отсечением 300 Д для удаления хлорида натрия.

Раствор концентрировали до 10%, фильтровали через мембраны 0,2 мкм и лиофилизировали.

Эта фракция составляет 80% от фракций с молекулярной массой менее 3000 Д.

По способу настоящего изобретения нужную фракцию гликозаминогликанов получали с заслуживающим внимание показателем воспроизводимости, что касается выхода процесса или постоянства молекулярного состава.

Ниже приведены отличительные признаки фракции гликозаминогликанов настоящего изобретения.

ХИМИКО-ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Внешний вид.....................: порошок светло-желтого цвета. 

Средняя молекулярная масса......: 2400 Д (±200),

Распределение молекулярных масс.: 95% < 2560 Д-> 1920 Д,

Индекс полидисперсии............: < 1,20,

Органическая сера...............: 9,5-11,5%,

Отношение SО3 /СООН..............: 2,3-2,6,

Удельное вращение...............: > +35°.

ВЭЖХ............................: фиг.1 

ЯМР.............................: фиг.2

Средняя молекулярная масса была определена ВЭЖХ с использованием колонок для вытеснительной хроматографии по сравнению с LMW гепаринами for Calibration Reference Substance Batch no. 1a (PH.EUR.) с молекулярной массой = 3700.

ПРОЦЕНТНЫЕ СООТНОШЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАНИЯ 

Были проверены три образца с результатами, приведенными в таблице 1.

ТАБЛИЦА 1 
Десульфатированные уроновые кислоты % GlcNSO3 6SO3% GlcNAc% GlcNSO3 3,6SO 3% 
34 85 13 7 
33 85 13 6 
31 85 14 7 


Процентные значения подсчитаны по сумме двух площадей, взятых из ЯМР-анализа.

Десульфатированные уроновые кислоты: площадь сигналов 102,2 и 106 м.д. относительно всех уроновых кислот при 100,5 и 106 м.д.;

Глюкозамин.NSО3 -6-сульфатированный: площадь сигналов при 62,5 м.д. относительно площади гликозамин-6-сульфатированного при 68 м.д.;

Глюкозамин.N ацетилированный: площадь сигналов при 55,5 м.д. относительно площади сигналов от 61 до 54 м.д.;

Глюкозамин.N, 3 сульфатированный: площадь сигнала при 59 м.д. относительно площади сигналов от 61 до 54 м.д.

Показатели сульфатирования С.6 глюкозамина оказались более низкими, чем у фракций с молекулярной массой 4500 Д (84 среднее).

Это обусловлено тем, что со снижением молекулярной массы увеличивается количество вторичных спиртовых групп в восстановленных концевых звеньях, сигналы которых попадают в зону С6 глюкозаминов 6 десульфатированных.

СТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

На фиг.1 представлен график, полученный при ВЭЖХ фракции гликозаминогликанов с распределением молекулярных масс для 95% от 2560 Д до 1920 Д, соответствующих 4-5 составляющим дисахаридам.

На фиг.2 представлен ЯМР-график той же фракции, в котором обращает на себя внимание отсутствие сигналов от параметра 84-85 м.д. места связывания, которое было удалено деполимеризацией при гамма-излучении. Отщепление цепи галактозида и его азотсодержащих компонентов представляет специфическое свойство этой сахаридной фракции, обеспечивающее действие без влияния, обычно патологического характера, происходящего из-за присутствия пептидных структур, имеющих отличный аминокислотный состав.

При ЯМР-анализе, однако, обнаружено, что в концевых зонах существуют только интактные кольца или состоящие в конечном счете из алифатических "остатков". 

Кольца восстановленного конца никогда не десульфатируются. 

Глюкуроновые структуры, десульфатированные на восстановленных концах, не указаны, так как они разрушаются гамма-излучением. 

В кольцах невосстановленных концов трудно отличить концевые группы С4 от неконцевых групп С4, так как они попадают в одну и ту же зону; единственные группы, которые однозначно идентифицируются, это те группы NS, 3S глюкозамина, которые смежны глюкуроновой кислоте активного пентамера.

Структурные ядра соответствуют исходному гепарину с практически неизмененными показателями сульфатирования. 

Аномерные сигналы восстановленных групп GlсNSO3 6SO3 и IdоА2SO3 определяют фракцию гликозаминогликанов в соответствии с изобретением, как вещество с концевыми звеньями, подобными звеньям фрагментов природного гепарина.

Особенно подходит для использования по настоящему изобретению фракция гликозаминогликанов, имеющая среднюю молекулярную массу 2400 Д с индексом полидисперсии менее 1,20 при общем отсутствии пептидных компонентов, не имеющая десульфатированных звеньев на восстановленном конце и полученная без ресульфатирования и в отсутствие катализаторов. 

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Ph. Е. гепариновая активность = отсутствует,

USP гепариновая активность = отсутствует,

Активность anti Ха = < 50 е аХа/мг,

Активность anti IIа = < 50 е alla/мг.

Из вышеприведенных характеристик оказывается, что фракция гликозаминогликанов по настоящему изобретению подтверждает отсутствие гепариновой активности относительно параметров коагуляции, несмотря на сохранение структурных характеристик гепариновой молекулы явно со значительно меньшей молекулярной массой гепарина.

ПРИМЕР

100 г натрийгепарина из слизистой оболочки кишечника свиньи, имеющего молекулярную массу 14000 Д и активность 190 е/мг, растворяли в 1 л дистиллированной и деаэрированной воды. Раствор разливали в емкости из стекла пирекс, которые закрывали стеклянными пробками после барботирования аргона.

Раствор подвергали общей обработке гамма-излучением Со 60 при дозе 130 кГр и последующих дозах 25 кГр для деполимеризации гепарина.

Облученный раствор подвергали ультрафильтрации с отсечением 300 Д, очищали, пропускали через 3% NaCl и лиофилизировали после концентрирования до 10%.

"Маточный деполимеризованный" гепарин растворяли при 10% в 0,3 М растворе NaCl и фракционировали гельпроникающей хроматографией с колонкой, содержащей Sephadex G/50 Medium.

После разделения компонентов, имеющих молекулярную массу более 8000 Д, и аликвот, приписываемых гепарину 4500 Д, извлекали фракции с молекулярной массой менее 3000 Д.

Фракции очищали ультрафильтрацией с отсечением 600 Д для удаления молекулярных фрагментов, образующихся в результате процесса деполимеризации. 

После трех промывок в 0,3 М растворе NaCl до отсутствия положительной реакции на карбазол в пермеате, смесь концентрировали до 8% и раствор, отфильтрованный через мембраны 0,2 мкм, лиофилизировали. 

Лиофилизированный продукт растворяли в 0,3 М растворе NaCl в таком количестве, чтобы получить конечную концентрацию 10%. Раствор фракционировали гельпроникающей хроматографией на колонке, содержащей Sephadex G/25 Medium.

Фракции, имеющие молекулярную массу от 1920 Д до 2560 Д, собирали.

Полученный раствор очищали ультрафильтрацией с отсечением 300 Д, чтобы удалить хлорид натрия.

Раствор концентрировали до 10% и лиофилизировали. 

Выход: около 9 г порошка светло-желтого цвета.

Анализ: средняя молекулярная масса = 2400 (±200); органическая сера = 9,9%.

Отношение сульфаты/карбоксильные группы = 2,5; активность anti Xa = 45 е anti Ха/мг.

ВЭЖХ-тест, фиг.1. 

ЯМР-тест, фиг.2.

В целях сравнения таким же способом получали следующие фракции гликозаминогликанов:

- Фракцию со средней молекулярной массой 640 Д (от 320 до 1600 Д);

- Фракцию со средней молекулярной массой 4800 Д (от 3350 до 6060 Д).

Благодаря фармацевтическим свойствам, выявленным в приведенных ниже экспериментах, гликозаминогликаны со средней молекулярной массой 2400 Д можно использовать для приготовления фармацевтических композиций, подходящих для лечения старческого слабоумия, и, в частности, болезни Альцгеймера или SDAT (Senile Dementia Alzheimers Type), для лечения церебральных неврологических поражений в результате приступа и травм и лечения дегенерации нервных волокон.

Указанные композиции включают в себя фармацевтически эффективное количество указанных гликозаминогликанов в смеси с фармацевтически приемлемыми разбавителями или наполнителями; композиции могут быть приготовлены в форме, подходящей для подкожного, внутримышечного, внутривенного и перорального введения.

Указанные композиции содержат 50-200 мг указанных гликозаминогликанов на унифицированную дозу.

Настоящее изобретение также включает в себя терапевтический способ лечения пациентов, страдающих старческим слабоумием, и, в частности, болезнью Альцгеймера или SDAT и церебральными неврологическими поражениями в результате приступа и травмы, заключающийся во введении 10-400 мг/день гликозаминогликанов, имеющих среднюю молекулярную массу 2400 Д. В частности, для подкожного, внутримышечного и внутривенного введения количество гликозаминогликанов составляет 10-200 мг/день, а для перорального введения 25-400 мг/день.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Для исследования фармакологической активности фракции гликозаминогликанов по настоящему изобретению экспериментальную модель применяли для крысы с воспроизведением некоторых поражений, обычно старческого слабоумия (Sigurdsson ЕМ; Lorens SA; Hejna MJ; Dong WX; Lee JM. "Local and Distal Histopathological Effects of Unilateral Amyloid- 25-35 Injections into the Amygdala of Young F344 Rats"."Neuro Biol Aging 1996; 17: 893-901).

В частности, исследовали следующие параметры:

- белок Таu-2, коррелированный по взаимодействию с -амилоидным веществом (косвенная реакционная способность);

- белок GFAP (глиальный фибриллярный кислотный белок), коррелированный с реакционной способностью астроцитов к -амилоиду (прямая реакционная способность).

МАТЕРИАЛЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ИССЛЕДОВАНИИ

- амилоид:

натриевая соль А 25-35 в растворе трифторуксусной кислоты (TFA) (VEH1) с содержанием пептидов 82-89% (ВАСНЕМ, Torrance, СА).

амилоид в соответствующем носителе (VEH1) разбавляли наночистой Н20 в таком количестве, чтобы получить концентрацию 5 нмоль/3,0 мл, непосредственно перед использованием и поддерживали при 4°С.

- Гликозаминогликаны, TGSS: использовали три типа TGSS (подобранные гликозаминогликаны), полученные, как описано выше, и имеющие различные молекулярные массы, как видно из следующей таблицы:

Таблица 2 
Тип TGSS Средняя молекулярная масса (Д) Среднее число моносахаридов 
C8 640(320-1600) 2 
С3 2400(1920-2560) 8 
С7 4800(3520-6060) 15 


Эти продукты представляют собой порошок светло-желтого цвета, который растворим в воде и который хранили в сушилке при комнатной температуре.

Для инъецирования крыс готовили растворы при концентрации 1 мг/мл в физиологическом растворе (VEH2).

Растворы сохраняли при температуре 4°С не более двух недель.

- VEH 1:

Трифторуксусная кислота (TFA) (10 нмолей в 3 мкл дистиллированной Н2O), носитель для амилоида.

- VEH 2:

Физиологический раствор, носитель для TGSS.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использованная для исследования модель основана на действии инъекций А 25-35 в центроцеребральную область миндалевидного тела.

Аминокислотная последовательность А 25-35 является последовательностью, рассматриваемой как нейротоксичная (Yankner BA; Duffy LK; Kirscner DA; 2Neurotrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid- Protein. Reversal by Tachykinin Neuropeptides". Science 1990: 250-282), так как она вызывает поражения аналогично А 1-41 или А 1-43.

Для исследований использовали мужские особи молодых (3-4 месяца) крыс штамма Fischer 344, которые получали интрацеребральную инъекцию 5 нмоль/3,0 мкл Ар 25-35 или соответствующего носителя (VEH 1) в правое миндалевидное тело.

TGSS или соответствующий носитель VEH 2 вводили 2 раза в день подкожно за 2 дня до интрацеребральной инъекции А и в течение 32 дней после указанной инъекции с дозировкой, определенной ниже.

Для гистологического анализа животным давали наркоз, пентобарбиталнатрий, и осуществляли перфузию артериальным (трансаортальным) способом 4%-ного раствора формальдегида.

Затем получали 5 венечных срезов (40 мкм) с интервалами 0,2 мм.

Срезы приводили в контакт с антителами на белок Таu-2 и глиальный фибриллярный кислотный белок (GFAP).

Крысы Fischer 344 были получены из Harian Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis In).

Во время появления они весили 250-300 г и были в возрасте 3-4 месяца.

Животных содержали в отдельных клетках с циклом день-ночь 12 час (день в 7 ч до полудня) в условиях помещения, утвержденных AAALAC (American Association Animal Laboratory and Care).

Крысы имели доступ к воде и корму по желанию и содержались в этих условиях 2-3 недели перед исследованием.

Интрацеребральную инъекцию А 25-35 проводили под наркозом пентобарбиталнатрием (50 мг/кг, внутрибрюшинно; Butler, Colombus, ОН).

При проведении наркоза животным также вводили внутримышечно атропинсульфат (0,4 мг/кг; Sigma, St. Louis, МО) и натриевую соль ампициллина (50 мг/кг; Sigma, St. Louis, МО). Интрацеребральную инъекцию в правое миндалевидное тело проводили с использованием стереотаксического (Korf) инструмента, установленного таким образом, чтобы глубина не превышала 3,3 мм ниже межушной линии.

Координаты для проведения инъекции определяли на основании атласа Paxinos и Watson, измеренных от теменной части черепа с координатами АР-3,0, ML-4,6 и DV-8,8. 

Переднезадние координаты (АР) позиционировали в более широкой части миндалевидного тела.

Среднебоковые координаты (ML) центрировали относительно медиального и базолатерального кора миндалевидного тела и дорсовентральные координаты (DV) центрировали на дорсовентральном пороге миндалевидного тела.

Инфузию инъецируемого объема в 3 мкл проводили в течение 6 мин, используя насос для микрошприцев типа СМА/100 (Carnegie Medici AD, Soln, Sweden). Канюлю удерживали in situ в течение 2 мин после инъекции и затем осторожно удаляли.

После операции животных помещали на нагретую плиту до момента, когда к ним возвращался установочный рефлекс.

Через 35 дней обработки животным проводили наркоз пентобарбиталнатрием (100 мг/кг, внутрибрюшинно) и затем трансаортальную перфузию 250 мл 0,1 М буферного раствора фосфата натрия/калия (РВ) при рН 7,4.

Затем проводили перфузию формальдегида при 4% в 500 мл РВ со скоростью 500 мл/ч при комнатной температуре. 

Непосредственно после начала перфузии 1 е/г гепарина (Upjohn Kalamzoo. MI) инъецировали трансаортально.

После перфузии изолировали головной мозг и фиксировали в 20%-м растворе сахарозы в течение 1 ч, затем рассекали на блоки 6 мм вокруг места инъекции и хранили при температуре 4°С в растворе 20% сахарозы и 0,1% азида натрия и с 0,01% бацитрацина в РВ в течение 24 ч.

Тканевые блоки в конце концов переносили в раствор 20% глицерина и 2% диметилсульфоксида в 0,1 М натрий-фосфатного буферном растворе и хранили при температуре 4°С до момента рассечения на срезы. 

Венечные срезы 40 мкм разрезали в количестве 5 на расстоянии 0,2 мм один от другого и проводили гистологический анализ белков Таu-2 и GFAP.

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Крезил Фиолетовый 

Срезы очищали ксилолом и гидратировали спиртом и водой. Окрашивание осуществляли, приводя срез в контакт с раствором, содержащим 200 мл 0,2 М уксусной кислоты, 133 мл 0,2 ацетата натрия и 67 мл ацетата крезил фиолетового при 0,1%. Затем срезы дегидратировали этанолом и очищали ксилолом. Окрашенный срез накрывали предметным стеклом для последующих исследований под микроскопом.

Конго красный

Срезы очищали и гидратировали с использованием нескольких обработок спиртом и водой.

Окрашивание осуществляли, приводя срез в контакт с раствором, содержащим 1% конго красного и 50% этанола, в течение 1 ч.

Затем срезы окунали в раствор, насыщенный карбонатом лития, и промывали в проточной воде в течение 15 мин. Контрастирующее окрашивание проводили в гематоксилине Harris в течение 2 мин и позже добавляли воду и 1%-й спиртовой раствор кислоты. Срезы промывали в воде, окунали в водный раствор сульфата аммония и снова промывали в проточной воде. В конце концов срезы дегидратировали этанолом и очищали ксилолом. Таким образом окрашенные срезы покрывали предметным стеклом для последующих исследований под микроскопом. 

Белок Tau-2

Срезы 40 мкм очищали от криопротектора и хранили в течение ночи в буферном растворе PBS при 4°С. 

Утром срезы приводили в контакт на 30 мин с 0,3% раствором H2O2; в буферном растворе при рН 7,6 (PBS) и потом промывали 3 раза, по 10 мин, раствором с 0,3% тритона Х-100 в PBS. Срезы затем инкубировали 24 ч с антителом на Tau-2 (Sigma), разбавленным 1:500, при комнатной температуре.

Разбавитель для антитела содержит 2% тритона Х-100, 0,1% азида натрия, 0,01% бацитрацина, 2% сывороточного альбумина и 10% обычной лошадиной сыворотки в PBS.

В конце концов ткань промывали 3 раза, по 10 мин, раствором, содержащим 0,3% тритона Х-100 в PBS, и инкубировали в течение 1 ч антителом на иммуноглобулин (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Buriingame CA), разбавленным 1:200 в растворе 0,3% тритона Х-100 в PBS. После 2 промывок раствором с 0,3% тритона Х-100 в PBS, в течение 15 мин в сумме, ткань инкубировали в течение 1 ч авидин-пероксидазой хрена (Vector), разбавленной 1:200 раствором с 0,3% тритона Х-100 в PBS.

Срезы затем промывали в PBS в течение 1 ч и снова промывали в течение 15 мин натрий-ацетатным буфером (0,2 М при рН 6,0). Потом срезы обрабатывали 3-3 диаминобензидинтетрагидрохлоридом (DAB) и сульфатом аммония-никеля (35 мг DAB, 2,5 г сульфата аммония-никеля на 100 мл натрий-ацетатного буфера с 0,3% H2O 2).

Срезы затем помещали в натрий-ацетатный буфер и потом в PBS при температуре 4°С и хранили в течение ночи. 

После этой процедуры срезы сушили и покрывали предметным стеклом для последующего исследования под микроскопом.

Белок GFAP

Окрашивание осуществляли способом, использованным для Таu-2, с той разницей, что антитело разбавляли в овечьей сыворотке, а не в лошадиной сыворотке.

Основное антитело на GFAP (DAKO, Denmark) использовали при разбавлении 1:500.

Срезы, окрашенные крезил фиолетовым, анализировали, измеряя размеры отложений А. 

Площадь отложений А измеряли с интервалами 0,2 мм. Отложения А также анализировали на преломляющую способность излучения золотисто-зеленого цвета, используя поляризованный свет предметных стекол, окрашенных консо красным.

В контексте этих гистохимических данных клетки, реакционноспособные к Таu-2, были сосчитаны во всех венечных срезах, в то время как был определен реактивный астроцитоз, с индексом от 0 до 2.

Животные рассматривались положительными, если они проявляли положительное окрашивание от 1 до 2.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА И РЕЗУЛЬТАТЫ

Для каждого эксперимента использовали четыре различные группы крыс:

1. Группа VEH1+VEH2: крыс инъецировали в миндалевидное тело носителем VЕН1(трифторуксусная кислота) и инъецировали подкожно носителем VEH2 (физиологический раствор);

2. Группа А+VEH2: крыс инъецировали А 25-35 в миндалевидное тело и подкожно носителем VEH2 (физиологический раствор);

3. Группа А+TGSS: крыс инъецировали А 25-35 в миндалевидное тело и подкожно TGSS.

4. Группа VEH1 + TGSS: крыс инъецировали в миндалевидное тело носителем VEH1 (трифторуксусная кислота) и инъецировали TGSS подкожно.

Каждый блок экспериментов был предназначен по меньшей мере для 6 животных в группе.

Следуя этой схеме обработки использовали три типа TGSS с тремя различными средними молекулярными массами: 

С3-2400 Д, 2,5 мг/кг, подкожная доза

С8-640 Д, 2,5 мг/кг, подкожная доза

С7-4800 Д, 2,5 мг/кг, подкожная доза. 

Каждый TGSS исследовали в двух различных экспериментах для подтверждения результатов.

Таблица 3

Для каждого типа обработки анализировали следующее число животных 
Обработка Число животных 
1. VEH1+VEH2 30 
2. A+VEH2 36 
3а. А+С3 23 
3b. А+С8 17 
3с. А+С7 21 
4. VEH1 + TGSS (С3 или С7 или С8) 30 


Животные, обработанные VEH1, инъекция внутрь миндалевидного тела (контроль без амилоида), и каким-либо TGSS (С3 или С8 или С7), всегда показывали результаты, идентичные контролю группы 1, обработанной только носителями VEH1+VEH2.

а) Реакционная способность к белку Таu-2 (число реакционноспособных клеток): средние значения ± стандартное отклонение.

Таблица 4 
Обработка Число случаев Число реакционноспособных клеток/тканевого среза 
1. VEH1+VEH2 30 11±5 
2. А+VEH2 36 66±12 
3а. А+С3 23 25±16 р < 0,05 Vs А+VEH2 (тест Newman-Keuls) 
3b. А+С8 17 60±14 
3с. А+С7 21 22±17 р < 0,05 Vs А+VEH2 (тест Newman-Keuls) 
4. VEH1+TGSS (С3 или С7 или С8) 30 10±3 


Из этой серии экспериментов оказывается, что С3 и С7 оба активны в снижении реакционной способности к белку Таu-2, в то время как С8, имеющий более низкую молекулярную массу, соответствующую дисахариду, не проявляет активности.

Контрольные группы, не обработанные А, вели себя идентичным способом при инъецировании подкожно физиологического раствора (группа 1) или TGSS (группа 4).

Значительное уменьшение реакционной способности к белку Таu-2 из-за действия С3-соединения подтверждено также тестами, в которых С3 вводили крысам перорально. 

Экспериментальная модель и методология отбора идентичны тем, которые описаны выше, с той разницей, что С3 вводили перорально, а не подкожно, при дозе 20 мг/кг.

Ведение С3 осуществляли один раз в день, начиная за три дня до инъекции А 25-35, и в течение четырнадцати дней после инъекции.

Через четырнадцать дней после инъекции А 25-35 крыс умерщвляли.

Полученные результаты представлены в следующей таблице, из которой видно, что С3 уменьшает реакционную способность к белку Таu-2 в большей степени у крыс, обработанных А 25-35.

Таблица 5 
Обработка Число случаев Число реакционноспособных клеток/тканевого среза 
А+VEH2 6 52 ±7 
А+С3 6 9±2 р < 0,01 (испытание по t-критерию Стьюдента) 


b) Реакционная способность астроцитов (% животных, представленных реакционной способностью +1 или +2): средние значения.

Таблица 6 
Обработка Число случаев % животных, представленных реакционной способностью +1 или +2 
1. VEH1+VEH2 30 37 
2. А+VEH2 36 87 
3а. А+С3 23 35 р < 0,05 Vs А+VEH2 ( 2 sec. Fischer) 
3b. А+С8 17 88 
3с. А+С7 21 67 
4. VEH1+TGSS (С3 или С7 или С8) 30 26 


Поскольку дело идет о реакционной способности астроцитов, единственным продуктом, проявляющим значительную активность, является С3 (группа 3а). Продукты С8 и С7 (группы 3b и 3с) не проявляют активности.

Из анализа этих результатов неожиданно выясняется, что СЗ TGSS со средней молекулярной массой 2400 Д имеет более высокую активность, чем TGSS с более высокой и более низкой молекулярной массой. В частности, средняя молекулярная масса 2400 Д является оптимальной для уменьшения реакционной способности, указанной в случае белка Таu-2, и для уменьшения реакционной способности в случае реакции астроцитов.

В другом исследовании на крысах изучалась способность продукта С3 преодолевать гематоэнцефалический барьер после внутривенного введения.

Для этой цели использовали продукт, меченный тритием (3H).

Метка соответствует 700000 распадов в мин/мг 3H-С3.

После внутривенного введения 2,5 мг/кг крыс умерщвляли под наркозом пентобарбиталнатрием через фиксированное время 45 мин.

Уровни метки анализировались в крови, в цереброспинальной жидкости (CSF) и в головном мозге (после медленной инфузии, чтобы удалить кровь из сосудов).

CSF забирали стеклянной капиллярной трубкой из четвертого желудочка (всегда в количестве более 200 мкл после полного обескровливания животного).

DPM (распадов в минуту) определяли сцинтилляцией, разбавляя 20 мкл гомогената (головного мозга) в 5 мл физиологического раствора.

Результаты, представленные в нижеследующей таблице, показывают, что 3H-С3 способен преодолевать гематоэнцефалический барьер в значительной степени.

Таблица 7 
Ткань Число случаев Распадов в мин/мл 
сыворотка 5 404±138,3 
цереброспинальная жидкость 5 85±13,0 
головной мозг 5 217±217,2 


У контрольных животных значения распадов в мин/мл всегда ниже 41 во всех анализируемых тканях.

На основе этих результатов проводили контроль присутствия активности anti Xa в сыворотке, в цереброспинальной жидкости (CSF) и в головном мозге.

Известно, что фактор Xa (фактор Х коагуляции) ингибируется только содержащими серу олигосахаридными фракциями, имеющими более четырех сахаридов.

В группе крыс, обработанных, как в предыдущем случае, наблюдали, что через 45 мин после обработки С3 дозой 2,5 мг/кг внутривенно, активность anti Xa проявляется существенным образом в плазме, в цереброспинальной жидкости (CSF) и в церебральной ткани.

Это является дополнительным подтверждением, что продукт, преодолевающий гематоэнцефалический барьер, содержит С3 и не содержит неактивных продуктов расщепления, таких как дисахариды или тетрасахариды.

Для крыс, подвергнутых инъецированию А 25-35, или обработанных СЗ, или без активных обработок, также анализировали нейронный рост.

Для этой цели использовали способ окрашивания Rapid Golgi, который из-за сложности применяли только к ограниченному числу животных.

Как уже было определено, С3 вводили в дозе 2,5 мг/кг подкожно дважды в день, начиная за два дня до интрацеребральной инъекции А 25-35 и в течение 32 последующих дней.

Анализировали церебральные нейроны V слоя поясной извилины головного мозга.

Тест предполагал измерения длины дендритов и отношения между числом концевых ответвлений и числом первичных ответвлений (отношение Т/В). Чем выше отношение Т/В, тем выше комплексующая способность и число соединений нейронов. 

Результаты представлены в следующей таблице

Таблица 8 
Обработки Число случаев Длина дендритов % Отношение Т/В 
VEH1+VEH2 7 100±2,1 4,3±0,15 
А+VEH2 8 94±2,0 4,0±0,16* 
А+С3 6 110±3,0 4,7±0,19** 
* р < 0,05 А+VEH2 Vs VEH1+VEH2

** р < 0,05 А+VEH2 Vs А+С3 


Из таблицы видно, что А вызывает повреждение нейронного роста и что С3 вылечивает такое повреждение. Кроме того, замечено, что С3 имеет активность типа нейротрофической, подходящей в случае деградации нервных волокон или травмы, предполагающей нейронное повреждение.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Использование гликозаминогликанов со средней молекулярной массой (2400±200) Д для приготовления фармацевтической композиции, пригодной для лечения старческого слабоумия и неврологических церебральных поражений в результате внезапного приступа и травм. 

2. Использование по п.1, отличающееся тем, что указанное старческое слабоумие состоит из болезни Альцгеймера или старческого слабоумия типа болезни Альцгеймера (STAD).

3. Фармацевтические композиции, пригодные для лечения старческого слабоумия и неврологических церебральных поражений в результате внезапного приступа и травм, содержащие эффективное количество гликозаминогликана, имеющего среднюю молекулярную массу (2400±200) Д, в смеси с фармацевтически приемлемыми разбавителями или наполнителями.

4. Композиции по п.3, отличающиеся тем, что указанный гликозаминогликан имеет среднюю молекулярную массу (2400±200) Д, индекс полидисперсии менее 1,20, не содержит пептидных компонентов и не имеет десульфатированных звеньев на восстановленных концах.

5. Композиции по п.3, отличающиеся тем, что указанный гликозаминогликан получают деполимеризацией гепарина при обработке гамма-излучением с последующей гельпроникающей хроматографией.

6. Композиции по п.3, отличающиеся тем, что они получены в форме, пригодной для подкожного, внутримышечного, внутривенного и перорального введения.

7. Композиции по п.3, отличающиеся тем, что они содержат количество указанного гликозаминогликана, равное 50-200 мг на унифицированную дозу.