СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНДИВИДУУМА С РИСКОМ СОСУДИСТОГО И РАКОВОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНДИВИДУУМА С РИСКОМ СОСУДИСТОГО И РАКОВОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ


RU (11) 2247389 (13) C2

(51) 7 G01N33/573, C12Q1/37 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 18.07.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2005.02.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002107982/15 
(22) Дата подачи заявки: 2000.08.30 
(30) Приоритетные данные: 19991836 1999.08.31 FI 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.08.30 
(43) Дата публикации заявки: 2003.11.10 
(45) Опубликовано: 2005.02.27 
(56) Аналоги изобретения: WO 9615456 A1, 23.05.1996. Болезни органов кровообращения. Лечение опухолевых заболеваний. Справочник практического врача. Изд-во “БАЯН”, 1994, с.34-52, 60-95. 
(72) Имя изобретателя: СИППОНЕН Пентти (FI); ХЯРКЕНЕН Матти (FI); СУОВАНИЕМИ Осмо (FI) 
(73) Имя патентообладателя: БИОХИТ ОЙЙ (FI) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2002.04.01 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: FI 00/00733 (30.08.2000) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 01/16356 (08.03.2001) 
(98) Адрес для переписки: 129010, Москва, ул. Б.Спасская, 25, стр.3, ООО "Юридическая фирма Городисский и Партнеры", пат.пов. Е.Е.Назиной 

(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНДИВИДУУМА С РИСКОМ СОСУДИСТОГО И РАКОВОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
Изобретение относится к области молекулярной фармакологии. Сущность его - это способ и набор для идентификации индивидуума, подверженного риску возникновения у него сосудистого и ракового заболевания. Способ включает стадии количественного определения концентрации аналита, пепсиногена I (PGI), в пробе сыворотки, взятой у данного индивидуума; определения метод-специфического граничного значения для указанного аналита; сравнения определенной таким образом концентрации аналита с метод-специфическим граничным значением для данного аналита; и определения концентрации гомоцистеина в пробе сыворотки, взятой у данного индивидуума. В наборе содержится комбинация отдельных компонентов, необходимых для количественного определения концентрации PGI. Технический результат - раннее выявление у пациента возможности возникновения сосудистого и ракового заболевания. 2 н. и 3 з.п. ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинированному диагностическому способу идентификации индивидуумов с риском возникновения коронарных и сосудистых заболеваний, а также раковых заболеваний.

Способ настоящего изобретения основан на комбинации двух тестов, проводимых на пробах крови или сыворотки в целях идентификации индивидуумов, у которых имеется предрасположенность к вырабатыванию или проявлению повышенных уровней гомоцистеина и которые, тем самым, подвержены риску развития у них заболеваний, вызываемых указанными повышенными уровнями, таких как болезни сердца и сердечно-сосудистые заболевания, включая атеросклероз и ишемический инсульт, а также раковые заболевания. 

Предпосылки создания изобретения

Раку желудка предшествует ряд различных желудочных заболеваний или состояний, таких как хронический атрофический гастрит, пернициозная анемия, язва желудка, полипоз желудка и болезнь Менетрие (гигантский гипертрофический гастрит). Четко идентифицируемыми изменениями слизистой оболочки являются дисплазия и аденома. Было установлено, что почти при всех заболеваниях риск возникает вследствие развития хронического атрофического гастрита.

Хронический гастрит характеризуется длительным воспалительным состоянием слизистой желудка. Это заболевание может быть приближенно разделено на поверхностную и атрофическую форму. При поверхностном гастрите зона воспалительного клеточного инфильтрата концентрируется ниже поверхностного эпителия. В случае, когда воспаление прогрессирует и распространяется между специфическими желудочными секреторными железами, то оно может быть отнесено к хроническому атрофическому гастриту. В этом случае нормальные железистые структуры слизистой желудка, по крайней мере частично, подвергаются метапластическим изменениям.

Был оценен относительный риск возникновения рака желудка у пациентов, страдающих атрофическим гастритом в области тела желудка, который, как было вычислено исходя из финской статистики заболеваемости раком, примерно в 4-5 раз превышает риск заболевания раком у лиц со здоровой слизистой желудка. Кроме того, риск заболевания раком существует и у пациентов с пернициозной анемией, обусловленной дефицитом внутреннего фактора и нарушением абсорбции витамина В12. При тяжелой атрофии в области привратниковой полости риск повышается даже в 18 раз. Если атрофические изменения наблюдаются как в области привратниковой полости, так и в области тела желудка (пангастрит), то риск возрастает уже в 90 раз.

В публикации WO 96/15456 описан метод скрининга для определения риска заболевания раком желудка, в соответствии с которым атрофию слизистой тела или привратниковой полости желудка, либо того и другого определяют путем измерения уровней аналитов, то есть пепсиногена I (PGI) и гастрина-17 (G-17), в пробе сыворотки, и сравнения определенных таким образом уровней с метод-специфическим граничным значением для соответствующего аналита. Измеренные уровни также предпочтительно сравнивают с метод-специфическим эталонным значением для соответствующего аналита.

Значение PGI в сыворотке, которое ниже специфического граничного значения для PGI, указывает на атрофический гастрит в области тела желудка. Если концентрация G-17 в сыворотке ниже ее граничного значения, то атрофия локализуется в области привратниковой полости желудка. При пангастрите, концентрация PGI в сыворотке имеет значение ниже граничного, а концентрация G-17 в сыворотке приближается к нижнему пределу его эталонного значения.

Метилентетрагидрофолат-редуктаза (MTHFR) представляет собой внутриклеточный фермент, необходимый для реметилирования гомоцистеина с образованием метионина. Нарушение функционирования этого фермента обусловлено дефектами в структуре гена MTHFR или дефицитом микроэлементов, например фолата, витамина В6 и/или витамина В12. Нарушение функционирования фермента MTHFR приводит к повышению уровня гомоцистеина в сыворотке/плазме (гомоцистеинемии) и к гомоцистеинурии. Многие исследования показали, что повышенные уровни гомоцистеина в сыворотке/плазме ассоциируются с повышенным риском возникновения различных коронарных и сосудистых заболеваний, причем высокий уровень гомоцистеина в сыворотке/плазме, превышающий эталонное значение, представляет собой серьезный независимый фактор риска возникновения коронарных и сосудистых заболеваний и ишемического инсульта1-5.

Предполагается, что атерогенное влияние гомоцистеина основано на повышенном продуцировании реакционноспособных молекул кислорода, которые приводят к перокислению липидов. Обеспечение достаточного уровня витамина В12 необходимо для метаболизма фолата и нормального продуцирования элементов крови, а также для функционирования нервных клеток. Витамин В12 образует комплекс с белком, внутренним фактором, продуцируемым слизистой оболочкой в области тела желудка, где этот комплекс ресорбируется в нижней части подвздошной кишки. Указанный комплекс является предпочтительной формой ресорбции витамина В12.

Дефицит внутреннего фактора, как следствие атрофического гастрита или рака желудка, особенно в области тела желудка, в конечном счете, приводит к дефициту витамина В12, а следовательно, и к повышению концентрации гомоцистеина. Таким образом, было бы чрезвычайно важно выявить тех индивидуумов, у которых имеется дефицит витамина В12 или существует высокий риск возникновения дефицита витамина В12, обусловленный атрофическим гастритом, и которые поэтому могут иметь повышенный уровень гомоцистеина в сыворотке или плазме. Раннее введение дополнительного витамина В12 этим индивидуумам должно благоприятствовать предупреждению у них сосудистых заболеваний. Кроме того, было бы чрезвычайно важно выявить тех индивидуумов, у которых имеется риск возникновения рака вследствие сверхпродуцирования внутриклеточных кислородных радикалов, и для которых может оказаться благоприятным дополнительное введение витамина В12 или другое лечение.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу комбинирования анализа для определения маркера для атрофического гастрита в пробе сыворотки, с анализом на гомоцистеин для облегчения диагностики или для выявления риска возникновения сосудистых, а также раковых заболеваний у индивидуума, где термин "сосудистый" имеет широкое значение и относится к любому коронарному или сосудистому заболеванию, которое может развиваться в результате атерогенного влияния гомоцистеина.

Способ настоящего изобретения представляет собой способ идентификации индивидуума с риском возникновения сосудистого и ракового заболевания, где указанный способ включает стадии:

- количественного определения концентрации аналита, пепсиногена I (PGI), в пробе сыворотки, взятой у данного индивидуума,

- выбора метод-специфического граничного значения для указанного аналита,

- сравнения определенной таким образом концентрации аналита с метод-специфическим граничным значением для данного аналита и

- определения концентрации гомоцистеина в пробе сыворотки, взятой у данного индивидуума, и ее сравнения с метод-специфическим эталонным значением для гомоцистеина.

Настоящее изобретение также позволяет идентифицировать индивидуума, имеющего концентрацию пепсиногена I в сыворотке ниже метод-специфического граничного значения для сывороточного пепсиногена I и концентрацию гомоцистеина в сыворотке выше эталонного значения для гомоцистеина, как индивидуума с повышенным риском возникновения сосудистого и/или ракового заболевания, или предрасположенного к этим заболеваниям.

Определение концентраций PGI и гомоцистеина в сыворотке может быть осуществлено в любом порядке в целях одновременного получения данных об уровнях как PGI, так и гомоцистеина в сыворотке для облегчения диагностики сосудистых заболеваний или рака, или для оценки риска возникновения этих заболеваний. Однако в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения сначала определяют концентрацию PGI в сыворотке и сравнивают ее с определенным или выбранным метод-специфическим граничным значением, и для последующего установления диагноза отбирают индивидуума, у которого концентрация PGI в сыворотке ниже метод-специфического граничного значения. В этом варианте осуществления изобретения на гомоцистеин исследуют лишь тех индивидуумов, в сыворотке которых присутствуют низкие уровни PGI, указывающие на атрофию слизистой тела желудка.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения определяют также концентрацию В12 в сыворотке указанного индивидуума и сравнивают ее с метод-специфическим эталонным граничным значением для витамина В12.

Настоящее изобретение включает стадию сравнения измеренных концентраций аналита с метод-специфическим граничным значением или эталонным значением для указанных аналитов. Выбор таких значений хорошо известен специалистам и зависит от специфичности и чувствительности, выбранных для тест-метода, используемого для определения концентраций аналита, см. например, William J. Marshall, Clinical Chemistry, Third Edition, 1995, Mosby.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, настоящее изобретение, главным образом, направлено на выявление таких индивидуумов, которые еще не имеют дефицита витамина В12, то есть которые имеют, в основном, нормальные уровни витамина В12, но которым, вследствие низких значений PGI, был поставлен диагноз атрофии в области тела желудка, и которые также имеют высокие уровни гомоцистеина в сыворотке. Такая идентификация дает возможность уже на ранней стадии прибегнуть к предупредительным мерам, например, к введению дополнительного В12 для противодействия развитию заболеваний, асссоциированных с повышенными уровнями гомоцистеина. Подробное описание изобретения

1. Определение пепсиногена I (PGI)

Способ определения PGI в пробе сыворотки может быть осуществлен, как описано в публикации WO 96/15456, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Указанный способ, предпочтительно, включает стадии использования поли- или моноклональных антител против пепсиногена I в иммунологическом методе для определения пепсиногена I. Обычно реакцию осуществляют на подходящем носителе, таком как пластиковый, стеклянный или целлюлозный носитель, например на микропланшете. Иммунологические методы могут быть осуществлены известным способом, например, методом оптического поглощения, люминесцентным методом или флуоресцентным методом для измерения концентрации указанного пепсиногена I в образце.

Если концентрация пепсиногена I в сыворотке ниже граничного значения, которое зависит от специфичности и чувствительности, согласованных для рассматриваемого метода, и составляет 20-30 мкг/л, что соответствует приблизительно 450-690 пмоль/л, то это означает, что атрофия локализуется в области тела желудка. Нормальное или эталонное значение для PGI составляет в пределах от 25 до 120 мкг/л.

2. Определение гомоцистеина

Уровни гомоцистеина в сыворотке могут быть определены любыми известными per se методами, которые используются для этих целей, и которые также являются коммерчески доступными, например, в форме набора. Известным методом для количественного определения общего гомоцистеина в плазме или сыворотке является жидкостная хроматография высокого разрешения с радиоактивной, флуоресцентной или электрохимической детекцией. Кроме того, был разработан метод иммуноферментного анализа (ИФА) (Bio-Rad Laboratories; Axis-Shield A/S), а также метод флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (ФПИА)(FPIA; Abbott Laboratories), где указанный иммуноанализ включает предварительную обработку образцов дитиотреитолом и аденозином с последующим проведением ферментативной стадии с получением S-аденозил-L-гомоцистеина, и где общий гомоцистеин определяют с использованием моноклональных антител против S-аденозил-L-гомоцистеина, см., например, патент США 5631127.

Эталонные значения для гомоцистеина являются до некоторой степени метод-специфическими, но обычно, они варьируются в пределах приблизительно от 5 до 15 мкмоль/л. Уровень гомоцистеина в сыворотке, превышающий метод-специфический эталонный уровень для гомоцистеина, рассматривается как составляющая фактора риска, как объясняется выше. В большинстве случаев, можно считать, что уровень гомоцистеина выше 15 мкмоль/л представляет собой такой повышенный уровень, который указывает на явный фактор риска.

3. Определение витамина В12

В соответствии с настоящим изобретением, способ диагностики включает, но необязательно, определение концентрации витамина В12 в образце сыворотки. Концентрация витамина В12 (кобаламина) может быть определена любым из методов, известных per se и используемых для этой цели. Такие известные методы предусматривают проведение микробиологического анализа для определения В12 в сыворотке с использованием микроорганизмов, таких как Euglena gracilis или Lactobaclllus leichmanii, которые для своего роста требуют присутствия кобаламина. Для определения В12 были также использованы анализы методом разведения радиоизотопами, и такие аналитические методы хорошо описаны в литературе, например, Lau et al. "Measurement of serum B12 levels using Radioisotope Dilution and Coated Charcoal", Blood, 26 (1965), 202. Методы разведения радиоизотопами являются более быстрыми и дают результаты, сравнимые с результатами анализа, например, с использованием Euglena, при условии, что связывающий белок является специфическим для биологически активного кобаламина. Стандартизированный препарат чистого или очищенного внутреннего фактора является наиболее подходящим в качестве связывающего белка, поскольку он специфически связывается с истинным кобаламином, а не с аналогами кобаламина. 

Анализ на B12 методом разведения радиоизотопами обычно включает стадию отделения эндогенного B12 от его природного связывающего белка, например, путем кипячения при выбранном рН с последующим добавлением измеренного количества радиоизотопа 57 Сo-В12 и ограниченного количества связывающего белка. Весь связывающий белок будет связываться с определенной формой B12, поскольку количество добавляемого меченного радиоизотопом B12 является достаточным для связывания небольшого количества белка. Поскольку как природный, так и радиоактивный B12 конкурируют за связывание со связывающим белком, то степень, до которой ингибируется количество радиоактивности связанного с белком B12, указывает на количество В12 в образце. Этот метод был модифицирован Lau, см. выше, путем отделения несвязанного В12 от В12, связанного с белком, с использованием покрытой белком угольной пыли, и подсчета радиоактивности надосадочной жидкости, содержащей смесь связанного радиоактивного В12 и связанного нерадиоактивного В12. Затем исходя из этого количества вычисляют концентрацию В12 в сыворотке, часто путем сравнения со стандартной кривой. Для осуществления этого метода существует коммерчески доступный набор для радиоизотопного анализа.

Дефицит витамина В12 может быть также определен с использованием, например, хемолюминесцентных рецепторных анализов (Wentworth S. et al., Clin. Chem., vol.40, 537-540), радиоиммунноанализов (Endres, D.B., et al. Clin. Chem., Vol.24, 460-465), а также анализов на неизотопное связывание, CEDIA, т.е. иммунноферментных анализов с использованием клонированного донора фермента (van der Weide, J. et al. Clin. Chem., Vol. 38, 766-768).

Эталонное значение для В12 варьируется в пределах от 200 до 900 нг/л, что соответствует приблизительно 170-700 пмоль/л.

В последней еще неопубликованной работе было обнаружено, что 50% индивидуумов, страдающих атрофией тела желудка (SPGI < 25 мкг/л), у которых концентрация витамина В12 в сыворотке была ниже нижнего предела эталонных значений (<170 пмоль/л), имели заметно повышенную концентрацию гомоцистеина в сыворотке (среднее значение 33,3 мкмоль/л, 16-157 мкмоль/л). Кроме того, 22% из этих индивидуумов, у которых концентрация витамина В12 в сыворотке составляла 180-230 пмоль/л (эталонные значения 170-700 пмоль/л), также имели повышенную концентрацию гомоцистеина (среднее значение 18,9 мкмоль/л, 16-25 мкмоль/л).

Настоящее изобретение также относится к набору для использования в способе настоящего изобретения, где указанный набор включает:

- средство для определения концентрации PGI в пробе сыворотки,

- средство для определения концентрации гомоцистеина в пробе сыворотки.

Набор настоящего изобретения может содержать комбинацию единичных компонентов, необходимых для количественного определения концентрации пепсиногена I и гомоцистеина в пробе сыворотки крови. Для этих целей указанный набор может содержать отдельные флаконы или контейнеры для необходимых компонентов, таких как антитела и субстраты, которые могут быть использованы для исследования аналита.

Ссылки

1. Boushey C.J., Beresford S.A.A., Omenn G.S., Motulsky A.G., JAMA 1995; 274:1049-57.

2. Graham I.M., Daly L.E., Rafsum H.M., et. al. The European Concerted Action Project, JAMA 1997; 277:1775-81.

3. Jacobsen O.W., Clin Chem 1998; 44:1833-43.

4. Mogadashian M.H., McManus B.M., Frohlich J.J., Arch Intern Med 1997; 157:2299-2308.

5. Rafsum H., Ueland P.M., O., Vollset S.E., Rev Medicine 1998; 49:31-62.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ определения риска возникновения у индивидуума сосудистого или ракового заболевания, который включает стадии количественного определения концентрации аналита, пепсиногена I (PGI) в пробе сыворотки, взятой у указанного индивидуума, выбора метод-специфического граничного значения для указанного аналита, сравнения определенной таким образом концентрации аналита с метод-специфическим граничным значением для данного аналита и определения концентрации гомоцистеина в пробе сыворотки, взятой у указанного индивидуума, и ее сравнения с метод-специфическим эталонным значением для гомоцистеина, причем концентрация сывороточного пепсиногена I, имеющая значение ниже ее метод-специфического граничного значения, и концентрация гомоцистеина в сыворотке, превышающая ее метод-специфическое эталонное значение, указывают на то, что у данного индивидуума имеется повышенный риск возникновения сосудистого и ракового заболевания.

2. Способ по п.1, включающий определение концентрации РGI в сыворотке и отбор индивидуума, у которого концентрация сывороточного PGI ниже его граничного значения, для дальнейшего определения у него концентрации гомоцистеина.

3. Способ по п.1 или 2, предусматривающий проведение дополнительной стадии определения концентрации витамина В12 в образце и ее сравнение с метод-специфическим эталонным значением.

4. Набор для проведения способа по п.1, включающий средство для определения концентрации PGI в пробе сыворотки, средство для определения концентрации гомоцистеина в пробе сыворотки. 

5. Набор по п.4, где указанные средства для определения концентрации пепсиногена I и гомоцистеина включают средство для иммунологического анализа.