ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТИЗМА, СПОСОБ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТИЗМА, СПОСОБ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ


RU (11) 2302879 (13) C2

(51) МПК
A61K 36/815 (2006.01)
A61K 36/43 (2006.01)
A61K 36/296 (2006.01)
A61K 36/18 (2006.01)
B01D 15/08 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 15.02.2008 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(21) Заявка: 2004132185/15 
(22) Дата подачи заявки: 2002.04.09 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.04.09 
(43) Дата публикации заявки: 2005.06.10 
(45) Опубликовано: 2007.07.20 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: CN 1098933 А, 22.02.1995. CN 1178697 А, 15.04.1998. RU 2152211 C1, 10.07.2000. 
(72) Автор(ы): ДЕНГ ВЕНЛОНГ (CN) 
(73) Патентообладатель(и): СЫЧУАН ИНСТИТУТЕ ОФ ЧАЙНИЗ МАТЕРИА МЕДИКА (CN); ГУАНДЖОУ ЧЕН ЛИ ДЖИ ФАРМАЦЕУТИКАЛ ФАКТОРИ (CN) 
(85) Дата соответствия ст.22/39 PCT: 2004.11.09 
(86) Номер и дата международной или региональной заявки: CN 02/00246 (09.04.2002) 
(87) Номер и дата международной или региональной публикации: WO 03/086425 (23.10.2003) 
Адрес для переписки: 117279, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 55А, ЗАО "Фирма "Центр патентных услуг", пат.пов. Е.А.Харченко 

(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТИЗМА, СПОСОБ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
Изобретение относится к медицине. Композиция приготовлена из сырьевых лекарственных материалов Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch, Горянки крупноцветковой, Ягод дерезы и Семян повилики, взятых при следующем массовом соотношении: 1-4; 1-4; 1-4; 1-4 соответственно. Способ включает следующие операции: взвешивание и измельчение Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch и Горянки крупноцветковой, раздельное их отваривание в воде 3 раза, замачивание Ягод дерезы, Семян повилики теплой водой при температуре 80-95°С 1-3 раза, раздельное сливание отваров и жидкостей, раздельное пропускание их через адсорбционную колонку, промывание водой до осветления вытекающей жидкости, элюирование 30-99,3% этиловым спиртом, смешение элюата со спиртовой жидкостью, при этом общий вес элюата в 1-8 раз тяжелее веса сырьевых лекарственных средств, рециклирование элюента каждого из сырьевого лекарственного средства, концентрирование до удельного веса 1,10, сушку экстрактов и их смешивание. Фармацевтическую композицию применяют при лечении ревматизма, ревматоидного артрита, хронического нефрита. Изобретения позволяют реализовать указанное назначение. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 21 табл.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Данное изобретение относится к противоревматическому средству, в частности касается фармацевтической композиции, способа ее приготовления и применения.

Ревматизм и ревматоидный артрит (RA) представляет собой трудноизлечимую болезнь, около 18,000,000 больных стали инвалидами из-за RA. Исследование новых средств против RA уже продолжается около ста лет, аспирин является первым общеупотребляемым средством против RA. Средства против RA в основном могут разделяются на два вида: нестероидное противовоспалительное средство (NSAIDs) и иммунодепрессант. NSAIDs включает в себя DICLOFENAC SOD или индометацин и адренокортикогормон. Клиническое исследование показывает, что NSAIDs - эффективное средство; иммунодепрессант и цитотоксическое средство включают в себя аметоптерин, циклофамид, пеницилламин и так далее. В последние годы иммунологическая регуляция употребляется при лечении ревматической болезни. Все противоревматические средства оказывают сравнительно серьезное побочное действие, до настоящего времени высокоэффективное средство с гипотоксичностью еще не было получено.

В исследовании и развитии противоревматических средств существует три направления. Первое направление включает в себя NSAIDs и антагонист клеточного фактора, например рекомбинационный растворимый антагонист некротических опухолевых факторов, ингибитор интерлейкина-1 и активный фактор тромбоцитов. Второе направление представляет собой новый иммунодепрессант или иммуномодулятор, например циклоспорин А. Третье направление представляет собой сложный медикамент.

В области китайской традиционной медицины для лечения Би-синдрома (непроходимость) (RA) использовались "Ma-син-ши-гань-тан (отвар эфедры китайской, абрикоса обыкновенного, гипса и солодки уральской)", "Фан-цзи-хуан-ци-тан (отвар стефании четырехтычинковой и астрагала)" и "У-тоу-тан (отвар аконита сычуаньского)" медицинско-фармацевтическим специалистом Чжан чжун-цзина древнего Китая. "Цветы-факел" представляет собой дикое растение в провинции Сычуань, которое при пробном применении в клинической практике в регионах (провинции Сычуань) доказало в определенной степени эффективность для ревматиков. К сожалению, было выявлено много неконтролируемых эффектов и серьезное побочное действие на половую систему человека.

Существует длительная история в китайском традиционном лечении Би-синдрома, причем китайское традиционное лечение Би-синдрома показывало высокую эффективность, и существует много лекарств. В Словарях китайской фармации издания 1995 и издания 2000 упоминается не менее 80 народных средств и 29 готовых лекарств. Но еще существует ряд проблем, в основном: эффективность лечение для тяжелых Би-синдромов, например ревматоидного артрита, еще не была достаточно высокой; лекарственная форма фармацевтического препарата не удовлетворяет требованию современной жизни, некоторые лекарства имеет высокую эффективность лечения, но с серьезным побочным действием, например фармацевтический препарат из Tripterygium wilfordii.

Известна фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, воспаления и боль, включающий Tripterygium wilfordii (Патент CN 1098933 от 22.02.95).

Композиция имеет высокую эффективность лечения, но оказывает серьезное побочное действие.

Поэтому разработка противоревматического средства с высокой эффективностью и гипотоксичностью, лекарственная форма которого соответствует формам применения лекарства и современной жизни, особенно противоревматического средства, эффективность лечения которого близка к синтетическим противоревматическим лекарствам, но со слабым токсико-побочным действием, необходима.

Целью настоящего изобретения является разработка сложной противоревматической композиции с высокой эффективностью и гипотоксичностью и удобством применения.

Другой целью данного изобретения является разработка способа приготовления противоревматической композиции.

Цель заявленного изобретения достигается путем подбора сырьевых лекарственных материалов, из которых готовят фармацевтическую композицию в различных лекарственных формах, включающую:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch

и по меньшей мере один из материалов таких, как

Горянка крупноцветковая (Epimedium brevicornum Maxim.),

Ягоды дерезы (Lycium barbarum L.),

Семена повилики (Cuscuta chinensis Lam., Cuscuta australis R. Br.)

или их смесь.

Фармацевтическая композиция получается из вышеуказанных сырьевых лекарственных материалов, взятых в различных массовых соотношениях.

Заявленная композиция может состоять из Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch и по меньшей мере из одного из трех упомянутых лекарственных материалов.

Оптимальное массовое соотношение названных сырьевых лекарственных материалов согласно данному изобретению составляет:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1˜4 
Горянка крупноцветковая 1˜4 
Ягоды дерезы 1˜4 
Семена повилики 1˜4 


Также предлагается композиция, состоящая из оптимального массового соотношения сырьевых лекарственных материалов согласно изобретению:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Горянка крупноцветковая 2 
Ягоды дерезы 1 
Семена повилики 1 


Предлагается также композиция, приготовленная из двух сырьевых лекарственных материалов при массовом соотношении:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1˜4 
Горянка крупноцветковая 1˜4 


Композицию предлагается готовить из названных сырьевых лекарственных материалов при следующем массовом соотношении:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Горянка крупноцветковая 2 


Предлагается композиция, приготовленная из сырьевых лекарственных материалов, взятых при массовом соотношении:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1˜4 
Горянка крупноцветковая 1˜4 
Ягоды дерезы 1˜4 


Оптимальное массовое соотношение сырьевых лекарственных материалов для приготовления заявленной композиции может составлять:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Горянка крупноцветковая 2 
Ягоды дерезы 1 


Оптимальное массовое соотношение сырьевых лекарственных материалов для приготовления заявленной композиции может составлять:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1˜4 
Горянка крупноцветковая 1˜4 
Семена повилики 1˜4 


Оптимальное массовое соотношение сырьевых лекарственных материалов для приготовления заявленной композиции может составлять:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Горянка крупноцветковая 2 
Семена повилики 1 


Совокупное содержание икариина С 33Н40О15 вышеуказанных лекарственных составов не менее 2.0 мг.

Оптимальное массовое соотношение сырьевых лекарственных материалов для приготовления заявленной композиции может составлять:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1˜4 
Ягоды дерезы 1˜4 и/или 
Семена повилики 1˜4 


Оптимальное массовое соотношение сырьевых лекарственных материалов для приготовления заявленной композиции может составлять:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Ягоды дерезы 1 и/или 
Семена повилики 1 


Используя вышеуказанные сырьевые лекарственные материалы в названом соотношении и применяя обычную фармацевтическую технологию, получают любые лекарственные формы, приемлемые в клинической практике, например пилюля, порошок, паста, таблетка, капсула, например твердая капсула и мягкая капсула, гранула, инъекция и так далее.

Другая цель настоящего изобретения достигается применением способа приготовления вышеназванной фармацевтической композиции, включающим следующие операции: взвешивание сырьевых лекарственных материалов и измельчение Triptervgium livpoglaucum (Levl.) Hutch и названной Горянки крупноцветковой, раздельное их отваривание в воде 3 раза, замачивание названных Ягод дерезы, Семян повилики водой при температуре 80-95°С 1-3 раза, раздельное пропускание полученных отваров и полученных жидкостей через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, промывание водой смоляной колонки до осветления вытекающей жидкости, элюирование 30-99,3% этиловым спиртом до вытекания жидкости темного цвета, собирание элюента до того, как его цвет переходит от темного к светлому, выведение спиртовой жидкости из колонки водой, смешение элюата со спиртовой жидкостью, при этом общий вес элюата в 1-8 раз тяжелее веса названных сырьевых лекарственных средств, рециркулирование элюента каждого из сырьевого лекарственного материала до извлечения спирта, концентрирование до удельного веса 1,10, сушка экстрактов каждого сырьевого лекарственного материалов в отдельности или в сочетании, смешивание их равномерно или смешивание в пропорции с получением лекарственной формы, приемлемой в клинической практике.

Еще одна цель настоящего изобретения достигается тем. что предлагается способ приготовления названной фармацевтической композиции заключающийся в том, что Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch крошат на мелкие куски, экстрагируют три раза раздельно в 13-, 10-, 10-кратных водах в течение одного часа. Горянку крупноцветковую крошат на сегменты, экстрагируют раздельно три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах в течение одного часа. Ягоды дерезы дробят в грубый материал и замачивают в 20-кратных водах при температуре 80-95°С в течение одного часа. Семена повилики крошат в крупнозернистый порошок, замачивают в 31-кратных водах при температуре 80°С в течение одного часа, фильтруют раздельно экстракты или жидкости замачивания названных четырех сырьевых лекарственных материалов, затем пропускают через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, подвергают элюированию 70% этиловым спиртом до вытекания элюента темного цвета, который собирают до того, как его цвет переходит от темного к светлому, элюент каждой из названных сырьевых средств рециркулируют до извлечения спирта, концентрируют, сушат, полученные лекарственные порошки экстрактов смешивают равномерно или в пропорции с получением лекарственной формы, приемлемой в клинической практике.

Исследование фармакодинамики данного изобретенного средства (Фэншипин-капсула из названных фармацевтических композиций для лечения ревматизма) свидетельствует о том, что применение Фэншипин путем перфузии может заметно ингибировать первичные и вторичные травмы артрита от вспомогательного средства (АА) большой мыши; заметно ингибировать запаздывающую гиперсенситивную реакцию (DTH) ушей маленькой мыши, вызванную 2,4-динитрофторбензолом (DNFB); заметно ингибировать антителообразование гемолизина маленькой мыши и активность макрофага, спленоцита 1L-1, 1L-2, 1L-6, TNF маленькой мыши. Фэншипин может заметно ингибировать трансформацию лимфоцитов, индуцированную ConАом. Фэнщипин также может заметно ингибировать клетки CD4, CD8, в частности заметно для CD4, и не заметно влияет на соотношение CD4/CD8. Вышеуказанные действия Фэншипина обладают видимой линейной зависимостью реакции от дозы. Минимальная эффективная доза 12˜18 (лекарственное сырье) г/кг. Фэншипин также может заметно ингибировать активность клетки NK. Однако при эффективной дозе Фэншипин не вызывает атрофию тимуса, селезенки и других иммунных органов, она также не ингибирует активность макрофага.

Фэншипин может заметно ингибировать воспалительную реакцию, она может ингибировать повышенную капиллярную проницаемость брюшной полости маленькой мыши, вызванную уксусной кислотой, ингибировать ушное опухание маленькой мыши, вызванное кротоновым маслом, ингибировать плеврит маленькой мыши и агрегацию лейкоцитов в капсуле CMC большой мыши, вызванные желатином из глазкового хондруса, однако Фэншипин имеет слабую ингибицию для опухания ног и ногтя, вызванного желатином из глазкового хондруса, и тампонновую гиперплазию грануляционной ткани большой мыши. Кроме того, Фэншипин может заметно ингибировать реакцию теловой крутки маленькой мыши, вызванную уксусной кислотой.

Экспериментальный пример 1.

Влияние на артрит от вспомогательного средства (АА)

1.1 Профилактическое действие на АА большой мыши

Выбирают 72 больших мышей SD одного помета, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, вес тела 180˜220 g, произвольно разделяют на 6 групп, в каждой группе 12 мышей. В каждой клетке живут 6 мышей. Измеряют точной узкой измерительной лентой максимальные периметры ног и голеностопного сустава левого и правого заднего когтя в качестве нормального значения. Всем мышам вливают заявленное средство одинакового объема соответствующей концентрации или им делают инъекции раствором гуммитраганта (Xihuangqi) одинакового объема. Через 1 час проводят внутрикожную инъекцию полным адъювантом Фрейнда (Freund-FCA) по 0.1 мл каждой мыши в левой заднюю подошву. Вливают средство 1 раз в день, непрерывно в течение 30 дней, каждый день одинаковым методом измеряют периметры ног и голеностопного сустава левого и правого заднего когтя большой мыши. В этом эксперименте подсчитывают степень опухания по изменению периметров, измеряемых до инъекции FCA и после инъекции FCA, результаты представлены в таблице 1.1, 1.2. По истечении срока взвешивают вес основных органов животных разных групп, результаты представлены в таблице 1.3, 1.4.

1.1 Влияние Фэншипина на степень опухания голеностопного сустава левого когтя и стопы после инъекции FCA большой мыши, заболевшей 
группа доза (г/кг) степень опухания 3d 9d 12d 14d 16d 
Id 2d 
контрольная - 0.69±0.17 0.69±0.12 0.92±0.18 0.84±0.41 1.10±0.30 1.65±0.68 2.10±0.55 
Фэншипин 7.5 0.74±0.12 0.66±0.074 0.83±0.13 0.77±0.27 1.11±0.45 1.34±0.53 1.91±0.61 
Фэншипин 15 0.80±0.24 0.62±0.13 0.76±0.18 0.49±0.17* 0.73±0.34* 1.00±0.48* 1.38±0.67* 
Фэншипин 30 0.75±0.19 0.67±0.19 0.87±0.28 0.63±0.22 0.73±0.34* 0.82±0.43** 1.05±0.53** 
Triplerygium hypoglalaucum (Levl.) 5 0.72±0.11 0.68±0.16 0.91±0.18 0.66±0.23 0.88±0.29 1.03±0.36* 1.37±0.33* 
Hutch преднизон 0.01 0.64±0.14 0.64±0.16 0.50±0.26 0.46±0.25 0.72±0.46* 0.87±0.46** 1.28±0.69* 

группа доза (г/кг) степень опухания 22d 24d 26d 28d 
18d 20d 
контрольная - 2.18±0.44 2.05±0.46 2.00±0.46 2.04±0.57 1.92±0.65 1.83±0.67 
Фэншипин 7.5 1.74±0.73 1.81±0.55 1.81±0.52 1.77±0.55 1.65±0.55 1.55±0.49 
Фэншипин 15 1.32±0.59** 1.28±0.58** 1.34±0.61* 1.33±0.67* 1.20±0.64* 1.08±0.58** 
Фэншипин 30 0.95±0.50** 0.87±0.51** 0.95±0.54** 0.89±0.59** 0.90±0.57** 0.86±0.51** 
Tripterygium hypoglaucum 5 1.47±0.43** 1.50±0.43** 1.49±0.43* 1.42±0.53* 1.40±0.56* 1.32±0.57 
(Levl.) Hutch преднизон 0.01 1.18±0.7**6 1.03±0.67** 1.05±0.69* 0.90±0.64** 0.86±0.65** 0.85±0.59** 
По сравнению с контрольной группой *Р 0.05, **Р<0,01 (одинаково в следующем) 


1.2 Влияние Фэншипина на степень опухания голеностопного сустава левого когтя и стопы после а инъекция FCA для большой мыши, заболевающей 
группа доза (r/кг) степень опухания 14d 16d 18d 
2d 9d 12d 
контрольная - 0.14±0.05 0.06±0.10 0.34±0.36 0.80±0.52 1.43±0.67 1.36±0.61 
Фэншипин 7.5 0.18±0.06 0.10±0.14 0.26±0.36 0.82±0.52 1.31±0.64 1.28±0.71 
Фэншипин 15 0,15±0.08 0.02±0.06 0.13±0.10* 0.37±0.31* 0.90±0.56* 0.79±0.60* 
Фэншипин 30 0.18±0.09 0.06±0.06 0.16±0.08* 0.29±0.20** 0.49±0.41** 0.33±0.29** 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hulch преднизон 5 0.16±0.07 0.01±0.07 0.11±0.10 0.44±0.19** 0.87±0.56* 0.84±0.67* 
0.01 0.20±0.06 0.08±0.08 0.21±0.16 0.44±0.43 0.99±0.63 0.84±0.74* 

группа доза (г/кг) степень опухания 24d 26d 28d 
20d 22d 
контрольная - 1.28±0.57 1.38±0.64 1.35±0.75 1.20±0.78 1.12±0.63 
Фэншипин 7.5 1.33±0.71 1.31±0.73 1.27±0.73 1.16±0.73 1.07±0.65 
Фэншипин 15 1.74±0.57* 1.92±0.61* 0.95±0.64* 0.88±0.58* 1.83±0.55 
Фэншипин 30 0.27±0.30** 0.34±0.31** 0.32±0.33** 0.31±0.32** 0.34±0.32** 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hulch 5 0.82±0.65* 0.89±0.70* 0.80±0.67* 0.83±0.68 0.75±0.69 
преднизон 0.01 0.82±0.72* 0.79±0.74* 0.75±0.67** 0.68±0.64* 0.71±0.67 


1.3 Влияние Фэншипина на изменение веса тела больших мышей, заболевающих 
группа доза (г/кг) изменение весов тела (г) 
начальный вес тела вес тела через 1 месяц заболевания АА увеличение весов тела 
контрольная - 228±34 231±52 3 
7.5 229±34 220±46 -9 
Фэншипин 15 223±40 232±34 9 
30 224±37 256±60 32 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 5 226±45 230±43 4 
преднизон 0.01 264±55 244±31 -21 
1.4 Влияние Фэншипина на весы иммунных органов (профилактиктический эксперимент) большой мыши, заболевающей: 
группа доза (г/кг коэффициент органов (г ткань/100 г вес тела) 
печень селезенка вилочковая железа надпочечная железа 
контрольная - 3.92±0.65 0.34±0.10 0.098±0.040 0.027±0.01 
Фэншипин 7.5 3.73±0.29 0.31±0.09 0.078±0.038 0.027±0.008 
Фэншипин 15 3.48±0.32 0.38±0.10 0.100±0.034 0.023±0.005 
Фэншипин 30 3.38±0.28* 0.44±0.12* 0.100±0.032 0.022±0.007 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 5 3.21±0.30** 0.36±0.05 0.052±0.011** 0.026±0.009 
преднизон 0.01 3.04±0.20** 0.32±0.08 0.050±0.060** 0.02±0.004* 


1.2 лечебное действие на АА большой мыши

Выбирают 50 больших мышей SD мужского пола, случайно разделяют их на 5 групп, обрабатывают их одинаковым методом, однако начинают вливать средство в мышей через 12 дней после воспаления, вызванного инъекцией адъювантом FCA, один раз в день, непрерывно в течение 2 недель, подсчитывают степень опухания так: периметр на дату измерения минус периметр на текущий день начала вливания средства. Результаты представлены в таблице 1.5.1.6. весы основных органов представлены в таблице 1.7.

1.5 Лечебное действие Фэншипина на опухание голеностопного сустава левого когтя после инъекции адъювантом FCA для большой мыши, заболевающей 
группа доза (г/кг) опухание 1d 2d 4d 6d 
контрольная - 1.81±0.27 1.92±0.19 2.12±0.22 2.16±0.27 
Фэншипин 7.5 1.68±0.50 1.64±0.54 1.70±0.57 1.82±0.61 
Фэншипин 15 1.44±0.41* 1.51±0.36** 1.65±0.34** 1.74±0.31** 
Фэншипин 30 1.50±0.56 1.48±0.41** 1.51±0.44** 1.59±0.51** 
преднизон 0.01 1.78±0.51 1.70±0.51 1.63±0.50* 1.58±0.50** 

группа доза (г/кг) опухание 8d 10d 12d 14d 
контрольная - 1.92±0.32 1.87±0.34 1.92±0.39 1.78±0.44 
Фэншипин 7.5 1.67±0.68 1.60±0.71 1.61±0.77 1.58±0.71 
Фэншипин 15 1.46±0.37** 1.48±0.30* 1.28±0.37** 1.22±0.38** 
Фэншипин 30 1.29±0.58** 1.29±0.65** 1.26±0.67** 1.20±0.68* 
преднизон 0.01 1.27±0.46** 1.09±0.54** 0.94±0.50** 0.94±0.42** 


1.6 Лечебное действие Фэншипина на опухание голеностопного сустава правого когтя после инъекциии адъювантом FCA для большой мыши, заболевающей 
группа доза (г/кг) опухание 2d 4d 6d 8d 
контрольная - 0.36±0.26 0.45±0.25 0.55±0.34 0.47±0.29 
Фэншипин 7.5 0.12±0.25 0.34±0.32 0.48±0.41 0.28±0.38 
Фэншипин 15 0.21±0.18 0.38±0.27 0.44±0.33 0.21±0.33* 
Фэншипин 30 0.10±0.48 0.06±0.28** 0.11±0.24** 0.06±0.27** 
преднизон 0.01 0.10±0.13* 0.15±0.28* 0.11±0.25** -0.08±0.34** 
группа доза (г/кг) опухание 10d 12d 14d 
контрольная - 0.48±0.25 0.46±0.31 0.40±0.36 
Фэншипин 7.5 0.35±0.30 0.30±0.29 0.30±0.35 
Фэншипин 15 0.19±0.45* 0.06±0.31** -0.06±0.34** 
Фэншипин 30 0.02±0.39** 0.05±0.38* -0.02±0.41** 
преднизон 0.01 -0.13±0.28** -0.26±0.36** -0.33±0.39** 
n=10, по сравнению с контрольной группой, *Р<0.05, **Р<0.01 


1.7 Влияние Фэншипина на вес тела и иммунных органов(профилактика) большой мыши, заболевающей 

группа доза (r/кг) коэффициент органов(г ткань/100 г вес тела) 
печень селезенка вилочковая железа надпочечная железа 
контрольная - 0.35±0.23 0.35±0.061 0.073±0.014 0.026±0.0071 
Фэншипин 7.5 3.21±0.52 0.33±0.091 0.071±0.026 0.024±0.0085 
Фэншипин 15 3.40±0.54 0.36±0.014 0.067±0.022 0.023±0.0048 
Фэншипин 30 2.79±0.43 0.32±0.083 0.069±0.029 0,023±0.0072 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 5 3.92±0.59 0.35±0.100 0.075±0.034 0.027±0.0060 
преднизон 0.01 3.52±0.35 0.28±0.047* 0.05±0.011* 0.02±0.0043* 


Таблицы 1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 показывают, что для большой мыши, заболевающей АА, Фэншипин может сильно ингибировать первичное повреждение сустава после инъекции адъювантом FCA и вторичное повреждение сустава большой мыши после инъекции адъювантом FCA. Вливание заявленного средства было эффективно как одновременно с началом воспаления, так и через 2 недели после воспаления. Это указывает то, что Фэншипин имеет заметное профилактическое и лечебное действие на артрит АА большой мыши. Анализ влияния Фэншипина на специфическое иммунное опухание голеностопного сустава задних конечностей и неспецифическое опухание когтя большой мыши показывает, что действие Фэншипина на опухание голеностопного сустава сильнее. Этот результат указывает, что основной эффект Фэншипин заключается в ингибировании иммунной воспалительной реакции.

Результаты в таблицах 1.3, 1.4 и 1.7 показывает то, что в ходе всего эксперимента вес тела большой мыши, заболевающей АА, не увеличился заметно. В группе, получавшей эффективную дозу Фэншипина, было замечено увеличение веса большой мыши. При лечении преднизоном и в профилактической группе замечено уменьшение веса тела большой мыши, выявлена заметная атрофия вилочковой железы и надпочечной железы. В группе Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch также замечена атрофия вилочковой железы, однако в трех группах, принимающих различные дозы Фэншипина, не было замечено заметного влияния на вилочковую и надпочечную железу.

1.3 Патологическое изменение от АА при лечении заявленным средством большой мыши

Выбирают 45 больших мышей SD и разделяют их на 6 групп, вес тела 180±20 г, после образования АА за счет применения адъюванта Фрейнда начинают лечение вливанием в желудок Фэншипина. Вливания продолжаются в течение 5 дней. Через 1 час после последнего применения средства оценивают и подсчитывают показатели сустава большой мыши. Сустав задней конечности большой мыши, подвергнувшийся вторичному повреждению, зафиксирован формальдегидом. После окраски тканей НЕ под микроскопом были исследованы изменения состава синовиальной оболочки и хряща. Результаты показателей составов разных групп большой мыши представлены в таблице 1.8.

1.8 Влияние Фэншипина на показатели суставов большой мыши, заболевающей 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) показатель сустава 
контрольная группа - 8 0** 
образцовая группа АА - 7 6.2±0.49 
Фэншипин 7.5 9 4.86±0.90** 
Фэншипин 15 7 4.71±0.95** 
Фэншипин 30 7 4.56±1.13** 
Glucosidorum Tripterygll Totorum 0.006 7 4.57±0.79** 
По сравнению с образцовой группой **Р<0.01 


По степени опухания каждого сустава оцениваем в отдельности показатели сустава на 0-4 балла, по совокупность четырех баллов определяется показатель сустава. Норма оценки четырех конечностей и суставов в следующем: 0 балла - нормально, 1 балл - только красно, 2 балла - красно и легкое опухание, 3 балла - тяжелое опухание, 4 балла - деформация сустава и ригидность.

При исследовании под микроскопом замечена гиперплазия синовиального слоя сустава задней конечности большой мыши образцовой группы, увеличение коллагенового волокна, образование заметной гранулемы из-за инфильтрации лимфоцитов и плазмоцитов; денатурация синовиальной клетки, покраснение цитоплазмы и пикноз клеточного ядра, эксфолиация эпителия синовиальной оболочки в некоторых зонах; атрофия хряща, его поверхность грубая и неровная, незначительная гиперплазия хондроцитов. После лечения Фэншипином разной дозовой группы можем заметить облегчение воспаления синовиальной ткани сустава, увеличение образования коллагенового волокна; эксфолиацию части синовиальной клетки; гиперплазию поверхностных клеток хряща, его поверхность становится ровной, хрящ находится в состоянии восстановления.

У большой мыши контрольной группы можем заметить гиперплазию синовиального слоя, увеличение коллагенового волокна, образование заметной гранулемы из-за инфильтрации лимфоцитов и плазмоцитов, денатурацию синовиальной клетки, покраснение цитоплазмы и пикноз клеточного ядра, эксфолиацию эпителия синовиальной оболочки в некоторых зонах. После лечения Фэншипином разной дозовой группы отмечается облегчение воспаления синовиальной ткани сустава, увеличение образования коллагенового волокна, эксфолиация части синовиальной клетки, гиперплазия поверхностных клеток хряща, его поверхность становится ровной, хрящ находится в состоянии восстановления.

Экспериментальный пример 2: влияние на запаздывающую гиперсенситивную реакцию (DTH) ушей маленькой мыши, вызванную 2, 4-дининтрохлорбензолом (2,4-DNFB)

Выбирают 50 маленьких мышей NIH, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 5 групп. Проводят сенсибилизацию 1% раствором ацетона 2.4-DNFB в дозе 0.025 мл для каждой мыши на эпиляционном месте в живот. Через три дня усиливают сенсибилизацию тем же методом. Через 5 дней после сенсибилизации намазывают правое ухо маленькой мыши 1% раствором пищевого масла DNFB в дозе 0.01 мл для каждой мыши для агрессии, после 24 часов убивают маленькую мышь, взвешивают на крутильных весах веса левого и правого уха, разница между ними (mg) представляет собой интенсивность реакции DTH маленькой мыши. Эксперименты проводятся в разных процессах иммунизации и приема средства.

2.1 влияние приема средства во всем процессе на DTH

Процесс иммунизации и приема средства в следующем:



таблица 2.1.

Влияние Фэншинина на запаздывающую гиперсенситивную реакцию маленькой мыши NIH, вызванную 
группа доза (г/кг) срок приема средства (день) количество мышей (штука) процент опухания ушей (%) процент ингибирование (%) значение Р 
контрольная 10 34.20±3.77 
Фэншипин 27 0-5 10 26.24±3.34 23.3 0.01 
Фэншипин 40 0-5 10 12.99±4.96 62.0 <0.01 
Фэншипин 60 0-5 10 10.43±7.53 69.5 <0.01 
дексаметазон 0.003 0-5 10 13.93±4.41 59.3 <0.01 
контрольная 10 42.43±5.28 
Фэншипин 40 -2-0 10 31.50±10.52 25.0 <0.01 
Фэншипин 40 -2-2 10 30.88±7.92 27.2 0.01 
Фэншипин 40 -2-5 10 21.07±4.62* 50.3 0.01 
Фэншипин 40 5-6 10 32.00±9.37 41.7 0.01 
циклофамид 0.05 -2-2 10 39.40±10.78 8.1 >0.05 
циклофамид 0.05 -2-0 10 37.47±6.71 1 1.7 >0.05 
контрольная 10 38.50±4.67 
циклофамид 0.1×3 один раз и отдельности в 0, 2, 4 - день 10 23.00±7.65 40.3 0.01 
циклофамид 0.25 -3d 10 41.84±7.75 -8.7 <0.01 
Фэншипин Циклофамид 60 0-4 10 27.20±10.20 29.4 
+ Фэншипин 0.25+ -3,0-4 10 38.07±6.65 1.1 
60 
*по сравнению с другими группами Р<0.05 или Р<0.01 


Результаты в таблице 2.1 показывают, что Фэншипин может заметно ингибировать DTH маленькой мыши, вызванную DNFB, интенсивность ингибирования заметно зависит от дозы, при увеличении дозы ингибирование тоже усиливается, при дозе 60.9 г/кг процент ингибирование DTH составляет 69.5%.

2.2 Влияние разного срока приема заявленного средства на DTH маленькой мыши

Процессы иммунизации и приема средства и их результаты представлены в нижней графе таблицы 2.1. Средняя графа показывает за 2 дня до сенсибилизации и в тот же день сенсибилизации, за 2 дня до сенсибилизации и через 2 дня после сенсибилизации, за 2 дня до сенсибилизации и через 5 дней после сенсибилизации, до и после агрессии, прием средства может заметно ингибировать реакцию, однако прием средства во всем процессе до и после сенсибилизации, то есть за два дня до сенсибилизации и через 5 дней после сенсибилизации, показывает более сильное ингибирование. Это указывает то, что процесс и механизм действия Фэншипина на DTH могут быть связанны как с клетками, раннее участвующими в ингибировании реакции DTH, так и с поздними эффекторными клетками и промежуточными клетками ингибирования реакции DTH. Этот механизм отличается от действия циклофамида. За 2 дня до сенсибилизации и в тот же день сенсибилизации или через 2 дня после сенсибилизации малая доза циклофамида не повлияет на реакцию DTH.

Нижняя графа таблицы 2.1 показывает, что однократный прием циклофамида большой дозы за 3 дня до сенсибилизации не тольно не ингибирует реакцию DTH маленькой мыши, но и реакция усиливается из-за того, что функция клеток Th относительно активируется в результате сильного ингибирования циклофамидом клетки Ts. В это время, если циклофамид применяется совместно с Фэншипином, имеющим заметный эффект ингибирования на DTH, то эффект ингибирования Фэншипина может быть сведен на нет. Это указывает на то, что Фэншипин отличается от циклофамида в механизме действия на DTH, так как обладает высокой активностью при ингибировании ТН клеток.

Экспериментальный пример 3: влияние на гуморальный иммунитет

3.1 Влияние на антителообразование гемолизина нормальной маленькой мыши, вызванное иммунитетом куриного эритроцита (СКВС)

Выбирают 190 маленьких мышей с весом 18-22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 19 групп, каждую мышь иммунизируют инъекцией 5% CRBC в дозе 0.2 мл. Через 7 дней после иммунизации берут кровь удалением глазного яблока. После разбавления образцов крови физиологическим раствором определяют влияние Фэншипина на антителообразование гемолизина маленькой мыши разных групп. Вливание Фэншипина проводится в разные сроки иммунизации. Результаты представлены в таблицах 3.1, 3.2, 3.3.

таблица 3.1

влияние Фэншипина на антителообразование гемолизина маленькой мыши 
группа доза (г/кг) срок приема средства количество мышей (штука) значение гемолизина процент ингибирование (%) значение Р 
контрольная 10 169.0±62.0 
Фэншипин 18 0-7 10 46.0±15.6 72.8 <0.01 
Фэншипин 27 0-7 10 35.4±12.0 79.1 <0.01 
Фэншипин 40 0-7 10 28.2±5.9 83.3 <0.01 
Фэншипин 60 0-7 10 16.7±3.0 90.1 <0.01 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 13.3 0-7 10 121.0±88.0** 28.4 <0.015 
циклофамид 0.02 0-7 10 35.0±12.0 79.3 <0.01 
**по сравнению с Фэншипином с одинаковым содержанием (40 г/кг) Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch P<0.01 


таблица 3.2

Влияние Фэншипина на антителообразование гемолизина маленькой мыши 
группа доза (г/кг) срок приема средства количество мышей (штука) значение гемолизина процент ингибирование (%) значение Р 
контрольная - - 10 124.70±42.60 
Фэншипин 12 0-7 10 75.00±53.10 39.9 <0.05 
Фэншипин 18 0-7 10 45.60±22.70 63.4 <0.01 
Фэншипин 27 0-7 10 29.10±22.10 76.8 <0.01 
Фэншипин 40 0-7 10 28.20±5.30 77.4 <0.01 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 6.0 0-7 10 143.50±67.90** >0.05 
циклофамид 0.02 0-7 10 27.80±6.60 77.9 <0.01 
**по сравнению с Фэншипином одинаковой дозы (18 г/кг) P<0.0 


таблица 3.3

влияние Фзншипина на антителообразование гемолизина маленькой мыши 
группа доза (г/кг) срок средства приема количество мышей (штука) значение гемолизина процент ингибирование (%) значение Р 
контрольная - - 10 256.0±26.0 
Фэншипин 18 -7-7 10 198.0±50.0 22.7 <0.01 
Фэншипин 18 -3-7 10 156.0±85.0 39.1 <0.01 
Фэншипин 18 0-7 10 98.0±35.0 61.7 <0.01 
циклофамид 0.02 0-7 10 25.0±4.0 90.2 <0.01 


Результаты в вышеуказанных трех таблицах показывают то, что Фэншипин заметно ингибирует антителообразование гемолизина маленькой мыши разных популяций, действие усиливается с увеличением дозы. Существует хорошая зависимость реакции от дозы, минимальная доза ингибирования - 12 г/кг, по сравнению с Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch, являющимся главным составом Фэншипина, имеет более заметно сильное действие ингибирования на антителообразование. Результаты в таблице 3.1 показывают, что интенсивность действия Фэншипина в 2.25 раз выше Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch. Действие Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch при дозе 13.5 г/кг слабее, чем действие Фэншипина с содержанием Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch в дозет 6 г/кг.

3.2 Влияние на иммунологическую функцию гумора маленькой мыши, заболевающей АА

Выбирают маленьких мышей NIH с весом тела 20±2 g, проводят внутрикожную инъекцию адъювантом Фрейнда в палец правой задней ноги в дозе 0.05 мл для каждой мыши. Через 3 недели образуется модель АА маленькая мыши. После случайного разделения на 6 групп в отдельности вливают разные средства в течение 5 дней. Одновременно с приемом средства иммунизируют мышь инъекцией овечьих эритроцитов 10% (CRBC) в дозе 0.5 мл для каждой, через 5 дней их убивают, берут селезенку. После промывки жидкостью Hank's готовят суспензию лимфоцитов, регулируя концентрацию клетки до 2×107/ мл. Берут 1 мл лимфоцитной суспензии и помещают в пробирку, добавляя 1 мл 0.2% SRBC и 1 мл комплемента 1:30. Ее помещают в водяную баню и инкубируют в течение 1 час при 37°С, центрифугируют при 2000 ppm 5 минут, берут надосадочную жидкость и измеряют 722 спектрофотометром оптическую плотность при длине волны 415 нм. Значение представляет количество PFC.

Другую часть берут кровь вышеуказанной сенсибилизированной маленькой мыши, сепарируют сыворотку, тестом агглютинации определяют ее титр антитела, и представляется значением Log2, результаты в таблице 3.4.

таблица 3.4

Влияние Фэншипина на иммунологическую функцию гумора маленькой мыши, заболевающей 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) PFC (OD) lgM (Log2) 
контрольная группа - 8 0.819±0.013# 6.875±0.641 
образцовая группа АА - 10 0.940±0.019** 7.700±0.599* 
Фэншипин 5 8 0.834±0.012**# 6.875±0.641# 
Фэншипин 10 8 0.834±0.012**# 6.750±0.886# 
Фэншипин 20 8 0.830±0.014**# 6.375±0.518## 
Glucosidorum Tripterygll Totorum 0.012 10 0.835±0.015**# 6.950±0.597# 


По сравнению с контрольной группой *Р<0.05, **Р<0.01; по сравнению с образцовой группой # Р<0.05, ## Р<0.01.

Таблица 3.4 показывает то, что PFC, IgM маленькой мыши, заболевающей АА, заметно выше, чем у нормальной мыши. Фэншипин может заметно уменьшить количество антителообразующей клетки (PFC) и количество образования антитела (IgM) селезенки маленькой мыши, заболевающей АА.

Экспериментальный пример 4: влияние на кожную пассивную анафилактическую реакцию (РСА) большой мыши

Берут большую мышь и проводят внутримышечную инъекцию овальбумином в дозе 10 мг/кг, одновременно проводят инъекцию в брюшную полость Bacillus pertussis 2×1010/0.2 мл для иммунизации. Через 2 недели убивают большую мышь, берут кровь и сепарируют сыворотку в запас.

Снова выбирают 60 больших мышей с весом тела 150˜200 g, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 6 групп. При легком наркозе эфиром проводят внутримышечную инъекцию вышеуказанной сывороткой антиовальбумина (степень разбавления - 1:5 и 1:10, в отдельности представляется d1, d2) 0.1 мл на эпиляционном месте на спине мыши, по каждой степени разбавления берут 2 точки для инъекции. Через 48 часов проводят агрессию интравенозной инъекцией 0.5% физиологическим раствором синего Эванса в дозе 1 мл, содержащим 1 мг овальбумина. Через 20 минут убивают большую мышь декапитацией, поворачивают кожу спины мыши, на основании глубины цвета и площади синего пятна многие люди оценивают категорию синего пятна по степени экссудации красителя. Затем разрезают синюю кожу на мелкие куски и замачивают их в 5 мл 0.1% растворе сернокислонатриевого ацетона (7:3), через 48 часов проводят центрифугирование. Берут надосадочную жидкость и определяют оптическую плотность при 590 нм, подсчитывают степень реакции РСА большой мыши и процент ингибирования. Результаты представлены в таблице 4.

таблица 4

Влияние Фэншипина на РСА большой мыши 
группа доза (г/кг) отметка d1 d2 коэффициент света d1 поглощения d2 
контрольная - 5.60±1.78 2.40±2.46 0.191±0.129 0.096±0.106 
Фэншипин 12 7.50±2.51 4.20±2.49 0.402±0.213* 0,192±0.175 
Фэншипин 24 7.10±2.13 4.10±1.79 0,310±0.177 0.137±0.099 
Фэншипин 48 6.00±1.83 1.70±1.95 0.121±0.109 0.024±0.026* 
Tripterygium

hypoglaucum

(Levl.) Hutch 8 6.11±1.27 2.56±1.67 0.223±0.122 0.074±0.045 
Кетотифен 0.1 2.78±1.64** 0.67±1.41 0.033±0.024** 0.027±0.019* 
По сравнению с контрольной группой *Р<0.05, **Р<0.01 


Таблица 4 показывает то, что Фэншипин слабо ингибирует РСА большой мыши, только при большой дозе по сравнению с контрольной группой существует заметная разница.

Экспериментальный пример 5: влияние на клеточный фактор

5.1 Влияние на TNF , IL-2 маленькой мыши

Берут 60 маленьких мышей ICR с весом тела 18˜22 g, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 6 групп, в отдельности вливают в них Фэншипин в разных дозах или другие средства. Вливание проводят один раз в день, непрерывно в течение 10 дней, через 24 часов после последнего приема средства убивают их. При асептических условиях берут макрофаг или спленоцит из брюшной полости маленькой мыши, промывают раствором Hank's 2 раза, раствором RPIM 1640 без сыворотки 1 раз, готовят 2×108 /мл клеточной суспензии с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640, в отдельности добавляют LPS 10 ng/мл или ConAlong/мл. Проводят культивирование при температуре 37°С в условиях 5% СО 2 48 часов, определяют TNF или IL-2.

Определение TNF :

Берут планку, покрытую моноклональным антителом TNF- маленькой мыши. В планку добавляют культуральный супенатант в дозе 50 l/отверстие. Через 60 минут нахождения планки при комнатной температуре добавляют меченое антитело биотина, при 25°С на 2 часа, потом добавляют энзимомеченое streptavidin, через 30 минут добавляют субстрат. Через 30 минут добавляют раствор обрыва, определяют значение OD при длине волны 450 нм. На основании значений OD подсчитывают содержание TMF- (нг/мл) на стандартной кривой.

Определение IL-2:

Берут находящиеся в логарифмический периоде роста CTLL клетки, рост которых зависит от IL-2, готовят 1×10 5/мл клеточную суспензию с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640. Вливают CTLL клеточную суспензию в плоскодонную планку культивирования клеток с 96 отверстиями 100 l/отверстие и вливают надосадочную жидкость для культивирования 100 l/отверстие, копируют каждый образец на 3, одновременно сравнивают стандартный образец rHIL-2 разной степени разбавления с питательной жидкостью. При условиях 37°С 5% СО 2 культивируют 24 часов, за 6 часов до окончания культивирования центрифугируют, выделяют надосадочную жидкость 110 l/отверстие, добавляют МТТ 10 l/отверстие, при 37°С через 3 часов определяют значение OD при 570 нм и значение OD при 630 нм. Конечное значение OD каждого образца лежит в диапазоне OD при 570 нм - OD при 630 нм.



таблица 5.1

Влияние Фэншипина на TNF и 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) TNF (пг/мл) 1L-2 (lU/мл) 
контрольная - 10 87.80±14.63 26.30±4.22 
12 10 62.14±13.13** 16.00±2.89** 
Фэншипин 24 10 58.60±9.63** 18.80±2.86** 
36 10 54.40±10.88** 18.20±2.86** 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 8 10 58.25±10.32** 16.00±2.88** 
циклофамид 0.02 10 42.20±9.57** 10.10±3.00** 
*P<0.05, **P<0.01 


Результаты в таблице 5.1 показывают то, что Фэншипин заметно ингибирует TNF , при дозе 12 г/кг действие ингибирования очень заметно, действие усиливается с увеличением дозы, однако кривая зависимость реакции от дозы пологая. Для IL-2 Фэншипин тоже имеет заметное действие ингибирования, однако зависимость реакции от дозы неочевидная.

5.2 Влияние на IL-1, IL-6

Берут 70 маленьких мышей NIH с весом тела 18˜22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 7 групп. В каждую вливают Фэншипином разной дозы или другие средства один раз в день, непрерывно 10 дней, через 24 часов после последнего приема средства, их убивают, берут макрофаг или спленоцит из брюшной полости и определяют IL-1 и IL-6.

Определение IL-1:

При асептических условиях берут макрофаг или спленоцит из брюшной полости, промывают раствором Hank's 2 раза, раствором RPIM 1640 без сыворотки 1 раз, готовят 4×10 6/мл клеточной суспензии с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640. Берут 1 мл суспензии и вливают в центрифугальную трубу с круглым дном, при условиях 37°С 5% СО2 культивируют 1 час, выделяют неприлипшие клетки, добавляют растворы 5% FCS-RPMI 1640 и LPS (10 нг/мл), при условиях 37°С 5% СО2 культивируют 72 часа, многократно повторяют замерзание и таяние, сохранять при 4°С. Снова берут маленькую мышь С57, при асептических условиях берут тимоциты, готовят 1×106/мл клеточную суспензию с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640.

Берут 100 l клеточной суспензии тимоцитов и 100 l надосадочной жидкости, проходившие многократное замерзание и таяние, и помещают их в плоскодонную планку культивирования клеток с 96 отверстиями, копируют каждый образец на 3, одновременно сравнивают стандартный образец rHIL-1 разной степени разбавления с питательной жидкостью, потом добавляют ConA 2 нг/отверстие, при условиях 37°С 5% СО2 культивируют 72 часа, за 14 часов до окончания культивирования добавляют 3Н-TdR 0.1 Ci/отверстие, собирают клетки многоствольным прибором для сбора клеток, определяют значение cpm.



Определение IL-6:

При асептических условиях берут спленоцит маленькой мыши, промывают раствором Hank's на 2 раза, раствором RPIM 1640 без сыворотки 1 раз, готовят 2×10 6/мл клеточной суспензии с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640. Берут 1 мл и помещают в центрифугальную трубу с круглым дном, добавляют ConA (10 нг/мл), при условиях 37°С 5% СО 2 культивируют 72 час.

Находящиеся в логарифмический периоде роста CTLL клетки, рост которых зависит от IL-6, вводят в 1×105/мл клеточной суспензии с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640.

Помещают МН60 клеточную суспензию в плоскодонную планку культивирования клеток с 96 отверстиями 100 l/отверстие, и вливают надосадочную жидкость для культивирования 25 l/отверстие, дополняют раствором 5% FCS-RPMI 1640 200 l/отверстие, копируют каждый образец на 3, одновременно сравнивают стандартный образец rHIL-6 разной степени разбавления с питательной жидкостью. При условиях 37°С 5% СО 2 культивируют 72 часов, за 6 часов до окончания культивирования центрифугируют, выделяют надосадочную жидкость 110 l/отверстие, добавляют МТТ 10 l/отверстие, при 37°С через 3 часа определяют значение OD при 570 нм и значение OD при 630 нм. Конечное значение OD каждого отверстия определяют в интервале OD при 570 нм - OD при 630 нм.



таблица 5.2

Влияние на IL-1 и IL-6 маленькой мыши 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) IL-1 (нг/мл) IL-6 (IU/мл) 
контрольная - 10 78.7±7.1 94.6±6.8 
7.5 10 59.3±4.9** 64.9±4,8** 
Фэншипин 15 10 53.3±5.7** 60.5±4.3** 
30 10 54.4±4.8** 56.0±4.6** 
60 10 47.0±16.6** 56.6±6.1** 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 5 10 57.6±4.7** 65.7±4.9** 
циклофамид 0.02 9 44.5±7.7 49.6±6.7** 


Результаты в таблице показывают то, что Фэншипин сильно ингибирует образование макрофагов при продуцировании IL-1 и образование спленоцитов брюшной полости при продуцировании IL-6 маленькой мыши, причем действие усиливается с увеличением дозы.

5.3 Влияние на плазму крови NO большой мыши, заболевающей артритом от вспомогательного средства АА

Берут 60 больших мышей SD с весом тела 160˜200 g, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 6 групп. Мыши в контрольной группе подвергаются внутрикожной инъекции NS 0.5 мл в правом заднем пальце ноги. Образцовая группа, группы Фэншипина большой, средней и маленькой дозы, группа Glucosidorum Tripterygll Totorum проводят внутрикожную инъекцию полным адъювантом Фрейнда (FCA) 0.5 мл каждой мыши в правом заднем пальце ноги. Через 18 дней после образования артрита от вспомогательного средства (АА) большой мыши начинают вливать в желудок средство 1 раз в день, непрерывно продолжают 5 дней, дают перегонную воду холостой контрольной группе и образцовой группе; в отдельности дают Фэншипин большой, средней и маленькой дозы группам большой, средней и маленькой дозы, дают таблетки Glucosidorum Tripterygll Totorum группе положительной контрольной группе. Через 1 час после последнего применения средства берут 2 мл крови из брюшной аорты, сепаририруют плазму крови и сохраняют ее при - 70°С для определения. Определение NO проводится в соответствии с объяснительной запиской реактивной коробки NO: берут 0.1 мл плазмы крови и добавляют 0.6 мл реактива С и смешивают равномерно, потом добавляют 0.4 мл двукратной перегонной воды и смешивают равномерно, добавляют 0.1 мл реактива D и смешивают равномерно, инкубируют на льду 60 минут, центрифугируют при 12000 оборотах 2 минуты. Берут 0.6 мл надосадочной жидкости и добавляют 0.4 мл двукратной перегонной воды и 0.1 мл реактива А, инкубируют в ледяной воде 15 минут, потом добавляют 0.1 мл реактива В, помещают при комнатной температуре на 1 час, при колориметрировании 545 нм определяют значение OD. На основании значений OD образцов подсчитывают содержание NO no стандартной кривой, результаты представлены в таблице 5.3.

таблица 5.3

влияние Фэншипина на плазму крови NO большой мыши, заолеваюшей артритом от вспомогательного средства 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) содержание NO ( mol/L) у (у=Lgx) 
контрольная группа - 8 13.55±1.11* 1.131±0.032 
образцовая группа АА - 9 17.56±4.15 1.235±0.097 
Фэншипин 12 7 0.985±0.087 
Фэншипин 24 7 1.001±0.067 
Фэншипин 48 7 1.026±0.062 
Glucosidorum Tripterygll Totorum 0.006 7 15.25±3.48 1.173±0.099 
По сравнению с образцовой группой *Р<0.05, **Р<0.01; по сравнению с группой Glucosidorum Tripterygll Totorum 


Таблица 5.3 показывает то, что уровень плазмы крови NO большой мыши образцовой группы заметно выше холостой контрольной группы. Фэншипин может заметно уменьшать уровень плазмы крови NO большой мыши, заболевающей АА, таблетка Glucosidorum Tripterygll Totorum также может уменьшать уровень плазмы крови NO большой мыши, заболевающей артритом, однако действие заметно слабее.

Экспериментальный пример 6: Влияние на лимфоциты Т, клетки NK, CD4, CD8 маленькой мыши

6.1 Влияние на трансформацию лимфоцитов нормальной маленькой мыши

Берут 80 маленьких мышей NIH, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 8 групп, в отдельности вливают их разными средствами, один раз в день, непрерывно продолжают 10 дней, через 24 часов после последней приема средства их убивают, при асептических условиях берут спленоцит маленькой мыши, промывают раствором Hank's на 2 раза, раствором RPIM 1640 без сыворотки на 1 раз, готовят 2×106/мл клеточной суспензии с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640. Вливают клеточную суспензию в плоскодонную планку культивирования клеток с 96 отверстиями 100 l/отверстие, копируют каждый образец на 3, в два отверстия из них вливают раздражитель (ConA 2 ng/отверстие) в качестве трансформационного отверстия, а в другое отверстие не добавляют раздражитель в качестве контрастного отверстия. При условиях 37°С 5% СО2 культивируют на 72 часов, за 14 часов до окончания культивирования добавляют 3Н-TdR 0.1 Ci/отверстие. Собираю клетки многоствольным прибором для сбора клеток, определяют значение cpm, подсчитывают среднее значение копированных отверстий. Непосредственно сравнивают cpm разных групп или показатели раздражения, показатели раздражения подсчитывают по следующей формуле:



Результаты представлены в таблице 6.1.

таблица 6.1

Влияние на трансформацию лимфоцитов маленькой мыши, вызванную ConA 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) cpm показатель раздражения 
контрольная - 10 20433±3579 25.87±3.06 
7.5 10 13566±1779** 27.29±7.67 
Фэншипин 15 10 12708±1692** 18.04±3.76 
30 10 12809±2575** 16.17±4.37 
60 10 12090±1706** 19.05±3.80 
Tripterygium 2.5 10 18038±3359 17.11±2.60 
hypoglaucum (Levl.) Hutch 5 10 12081±1039** 17.58±4.37 
циклофамид 0.02 9 9922±1145** 13.66±2.28 
По сравнению с контрольной группой *Р<0.05, **Р<0.01 


Таблица 6.1 показывает то, что Фэншипин может заметно ингибировать трансформацию лимфоцитов, вызванную ConA, и существует определенная зависимость реакции от дозы.

6.2 Влияние на клетки NK и CD 4, CD8 нормальной маленькой мыши

Эксперимент одинаков с 5.1, через 24 часов после остановки приема средства готовят 2×108/мл клеточной суспензии маленькой мыши с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640. Определяют CD4, CD8 и их соотношение и клетки NK.

Определение CD 4 и CD8:

Берут 50 l суспензии спленоцитов маленькой мыши, добавляют их в предметное стекло, покрытое полилизином, и делают клеточный мазок. Применяют клетки Т, выделенные нейлоновыми пушками в качестве положительного контроля. После фиксации ацетоном блокируют клеточный мазок сывороткой нормальной маленькой мыши, добавляют биотиномеченое антитело против CD4, CD 8, при 37°С инкубируют 2 часа, добавляют энзимомеченое streptavidin, при комнатной температуре сохраняют 10 минут, потом добавляют субстрат, через 10 минут промывают, проводят сложную окраску гематоксилином 2 минуты. После градиентной дегидратации спиртом блокируют мазок желатиновым глицерином, под микроскопом с большим увеличением считают 200 клеток.



Определение клетки NK:

Приготовление клетки ЕС: при асептических условиях берут спленоциты маленькой мыши, промывают раствором Hank's 2 раза, раствором RPIM 1640 без сыворотки 1 раз, готовят 2×108/мл клеточную суспензию в качестве ЕС с применением 5% раствора FCS-RPMI 1640.

приготовление клетки ТС: берут находящиеся в логарифмический периоде роста Yack-1 клетки, сенситивные к клеткам NK маленькой мыши, готовят 4×104 мл клеточную суспензию в качестве ТС.

определение: вливают 100 l ЕС и 100 l ТС в плоскодонную планку культивирования клеток с 96 отверстиями, копируют каждый образец на 3, одновременно сравнивают ЕС и ТС (контроль ЕС:ЕС100 l+5% FCS RPMI 1640 100 l; контроль ТС:ТС100 l+5% FCS RPMI 1640 100 l). При условиях 37°С 5% СО2 культивируют 24 часа, за 6 часов до окончания культивирования центрифугируют, выделяют надосадочную жидкость 110 l/отверстие, добавляют МТТ 10 l/отверстие, при 37°С через 3 часов определяют значение OD при 570 нм и значение OD при 630 нм. Значение OD каждого отверстия лежит в интервалах OD при 570 нм - OD при 630 нм.





Результаты в таблице 6.2 показывают то, что Фэншипин имеет определенное действие ингибирование на CD 4 и CD8, также существует зависимость реакции от дозы, однако кривая зависимости реакции от дозы пологая. Для CD4 эффективная доза составляет 24 г/кг, а для клетки CD8 только при большой дозе - 36 г/кг действие ингибирования заметное. Соответственно на соотношение CD4/CD8 . Фэншипин незаметно влияет. Циклофамид имеет сильное действие ингибирования на CD4 и CD 8, а действие на CD8 более сильное, в результате чего соотношение CD4/CD 8 значительно увеличивается.

Для клетки NK Фэншипин тоже имеет заметное действие ингибирования, однако зависимость реакции от дозы неочевидная, однако циклофамид имеет сильное действие ингибирования, между действием циклофамида при дозе 20 мг/кг и действиями Фэншипина при дозе 12, 24, 36 г/кг существуют очень значительная разница.

6.3 Влияние на количество и функцию лимфоцитов Т маленькой мыши, заболевающей АА

Берут маленькую мышь NIH с весом 20±2 g, проводят внутрикожную инъекцию полным адъювантом Freund's в палец правой задней ноги в дозе 0.05 мл, через 3 недели образуется артрит от вспомогательного средства АА. Для отрицательной контрольной группы, проводят внутрикожную инъекцию физиологическим раствором в палец правой задней ноги в дозе 0.05 мл. Средство вливают один раз в день, непрерывно 5 дней. Через 5 дней берут в отдельности периферическую кровь маленькой мыши разной группы и делают мазок крови, проводят окраску липазой. Под иммерсионным объективом наблюдают процент положительных клеток, окрашенных липазой (именно процент клеток Т в периферической крови). После наркоза маленькой мыши берут селезенку и готовят одноклеточную суспензию, промывают раствором PBS один раз, выделяют надосадочную жидкость, добавляют 4 мл раствора эритроцитов, полностью встряхивают 2-3 минуты, после полного растворения эритроцитов центрифугируют, выделяют надосадочную жидкость, промывают. После центрифугирования выделяют надосадочную жидкость, урегулировав концентрации клеток до 1×106/мл, добавляют в отдельности разбавленное антитело против CD 4, CD8 50 l no каждой трубе, при 4°С инкубируют 1 час, после промывки флюоресцентной промывной жидкостью 2 раза добавляют 2 мл фиксирующего раствора. Фильтруют сетью с 400 ячейками на трубу FCA, анализируют через Flow cytometer, результаты представлены в таблице 6.3.



Таблица 6.3 показывает то, что между разными группами положительной клетки ANAE не существует заметной разницы, однако клетки CD4 маленькой мыши, заболевающей АА, увеличиваются, а клетки CD8 значительно уменьшаются, соотношение CD4/CD 8 заметно повышается, лечение Фэншипином может восстановить аномалию CD4, CD8 , CD4/CD8 до нормального уровня.

Экспериментальный пример 7: Влияние на фагоцитарную функцию макрофагов брюшной полости маленькой мыши

Берут 50 маленьких мышей NIH с весом 18˜22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 5 групп, в отдельности вливают лекарственную жидкость одинакового объема разной дозы, один раз в день, непрерывно 7 дней. Через 1 час после последнего приема средства проводят инъекцию 10% куриными эритроцитами в брюшную полость 0.2 мл по каждой, через 4 часа убивают их, берут брюшную жидкость, путем капельного вливания под микроскопом наблюдают и считают количество макрофагов, фагоцитирующих CRBC, и количество CRBC, фагоцитированных одним макрофагом, результаты представлены в таблице 7.

таблица 7

Влияние Фэншипина на функцию фагоцитирования CRBC брюшной полости маленькой мыши 
группа доза (г/кг) количество мышей (штука) процент фагоцитирования (%) показатель фагоцитирования 
контрольная - 10 25.75±9.40 1.28±0.20 
Фэншипин 27 10 33.20±12.77 1.46±0.36 
Фэншипин 40.5 10 35.20±10.16 1.21±0.20 
Фэншипин 60.9 10 37.78±20.14 1.53±0.32 
дексаметазон 0.005 10 8.33±10.13* 1.10±0.18 
*Р<0.05 


Таблица показывает то, что при дозе 27, 40.5 и 60,9 г/кг Фэншипин незначительно влияет на фагоцитарную функцию макрофагов брюшной полости маленькой мыши.

Экспериментальный пример 8: Влияние на повышенную проницаемость капилляров брюшной полости маленькой мыши

Берут 90 маленьких мышей NIH с весом 18˜22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 9 групп, в отдельности вливают лекарственную жидкость одинакового объема разной дозы один раз, или один раз в день и непрерывно 3 дня. Через 1 час после последнего приема средства проводят инъекцию 0.7% физиологического раствора НАС в брюшную полость, одновременно проводят инъекцию 0.5% физиологическим раствором синего Эванса в дозе 0.1 мл/10 г веса тела, через 30 минут убивают мышь выпадением шейных позвонков, срезают брюшную полость, промывают брюшную полость несколько раз физиологическим раствором 5 мл для каждой мыши, потом выкачивают промывную жидкость и сливают. Затем добавляют физиологический раствор до объема 8 мл/мышь, после центрифугирования при 3000 pnm берут надосадочную жидкость, определяют значение OD при 590 нм, результаты представлены в таблице 8.

таблица 8

Влияние Фэншипина на повышенную проницаемость капилляров брюшной полости маленькой мыши, вызванную уксусной кислотой 
группа доза (r/кг) частота приема средства количество мышей (штука) количество выпота краски (OD) значение Р 
контрольная - - 10 0.29±0.13 
Фэншипин 27 qd×1 10 0.26±0.14 >0.05 
Фэншипин 40 qd×1 10 0.25±0.10 >0.05 
Фэншипин 60 qd×1 10 0.25±0.09 >0.05 
контрольная - - 10 0.28±0.15 
Фэншипин 27 qd×3 10 0.25±0.12 >0.05 
Фэншипин 40 qd×3 10 0.18±0.10 <0.05 
Фэншипин 60 qd×3 10 0.15±0.13 <0.05 
дексаметазон 0.15 qd×3 10 0.11±0.07 <0.01 


Результаты в таблице 8 показывают то, что для повышенной проницаемости капилляров брюшной полости маленькой мыши, вызванную уксусной кислотой, после одной приема средства Фэншипин незаметно действует, а после непрерывного приема средства 3 дня он имеет заметное действие ингибирования на нее.

Экспериментальный пример 9: Влияние на экссудацию плеврита и агрегацию воспалительной клетки маленькой мыши, вызванные желатином из глазкового хондруса

После случайного разделения на разные группы в отдельности проводят инъекцию 0.5% физиологическим раствором синего Эванса по 0.1 мл/10 г веса тела в копчиковую вену, поверхностно обезболивают маленькую мышь эфиром. Инъекцию делают специальной иглой 1% раствором желатина из глазкового хондруса в правую грудную полость в дозе 0.03 мл каждой мыши. В отдельности через 4 часов и через 32 часов после воспаления убивают декапитацией маленьких мышей, срезают брюшко, обнажают диафрагму. Шприцом с объемом 1 мл два раза делают инъекцию в брюшко промывной жидкостью, совокупность которой - 2 мл, потом собирают промывную жидкость в пробирку. Берут 20 мл вышеуказанного элюата и добавляют его в 400 мл лейкоцитарной разводящей жидкости, под микроскопом считают количество лейкоцитов. Центрифугируют остаточную жидкость при 3000 pnm 10 минут, берут надосадочную жидкость и определяют оптическую плотность при 600 нм, применяют основной раствор промывной жидкости грудной полости для проверки нулевой точки. Результаты представлены в таблице 9.

таблица 9

Влияние Фэншипина на агрегацию плевритической клетки маленькой мыши, вызванные желатином из глазкового хондруса 
группа доза (г/кг) количество лейкоцитов (2×105) экссудация краски (OD) 
4 час 32 час 4 час 32 час 
контрольная - 46.0±6.9 16.0±9.6 0.156±0.066 0.109±0.019 
Фэншипин 27 26.8±4.5* 14.2±8.0 0.121±0.062 0.116±0.031 
Фэншипин 40.5 10.9±4.0** 17.3±4.6 0.100±0.048 0.153±0.032 
Фэншипин 60 8.0±5.5** 6.6±4.7* 0.129±0.066 0.092±0.051 
дексаметазон 0.05 12.7±10.2** 4.4±4.0* 0.085±0.045 0.063±0.017 
*Р<0.05, **Р<0.01 


Таблица 9 показывает то, что Фэншипин может заметно ингибировать агрегацию лейкоцитов плеврита маленькой мыши, данное действие для ранней агрегации особенно сильное. На момент 4 ч получается уравнение регрессии у=44.13-2.01х, r=-0.9625, для поздней агрегации действие слабое, только при дозе 20 г/кг возникает заметное действие, а для экссудации плеврита действует неочевидно.

Экспериментальный пример 10: Влияние на агрегацию лейкоцитов в капсуле CMC большой мыши

Берут 64 больших мышей SD с весом 150˜180 g, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 8 групп, в отдельности вливают лекарственную жидкость одинакового объема разной дозы один раз или один раз в день и непрерывно 3 дня. В день проведения эксперимента делают инъекцию 20 мл 1% раствора CMC в баллон, образованный предварительной инъекцией 20 мл воздухом в спину большой мыши в предыдущий день. Через 3.5 ч и 7.5 ч в отдельности выкачивают 0.1 мл и вливают в 0.01% раствор бриллиантового крезолового синего PBS для окраски, потом под микроскопом считают количество лейкоцитов в капсульной жидкости CMC. Результаты представлены в таблице 10

Таблица 10

Влияние Фэншипина на количество лейкоцитов в капсуле карбоксиметилцеллюлозы большой мыши 
группа доза (r/кг) количество (штука) количество WBC (×107/L) 
3.5 часов 7.5 часов 
контрольная - 8 9.7±4.2 57.7±17.3 
Фэншипин 27×1 8 8.5±3.5 39.4±16.5 
Фэншипин 40×1 8 8.7±7.3 35.3±23.2 
Фэншипин 60×1 8 6.6±3.3 18.1±8.6** 
контрольная - 8 10.97±6.7 35.6±11.2 
Фэншипин 27×3 8 15.4±9.7 38.6±15.5 
Фэншипин 40×3 8 4.8±3.4** 18.4±12.2** 
Фэншипин 60×3 8 3.0±2.8** 11.0±9.2* 
кортизон 0.1×3 8 14.2±8.0 41.7±16.0 
контрольная - 8 10.9±3.0 41.3±6.9 
Фэншипин 18×7 8 6.2±3.0* 11.4±6.4* 
Фэншипин 27×7 8 3.7±1.7** 6.4±3.1** 
Фэншипин 40×7 8 2.5±1.9** 5.9±3.9** 
кортизон 2 мг ×1 8 1.5±0.7** 3.0±1.0** 
По сравнению с контрольной группой **Р<0.01 


Таблица 10 показывает то, что Фэншипин может заметно ингибировать агрегацию лейкоцитов в капсуле CMC большой мыши, существует очевидная зависимость реакции от дозы. С увеличением срока приема средства действие усиливается, непрерывный прием средства 7 дней при дозе 18 г/кг может очень заметно ингибировать миграцию лейкоцитов, инъекция кортизоном в капсулу также имеет сильное действие ингибирования.

Экспериментальный пример 11: Влияние на опухание уха маленькой мыши, вызванное кретоновым маслом

Берут 60 маленьких мышей NIH с весом 18-22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 6 групп, в отдельности вливают лекарственную жидкость или слизью гуммитраганта одинакового объема разной дозы один раз в день и непрерывно 3 дня. Через 1 час после последнего приема средства намазывают равномерно два бока ушной раковины левого уха 2% микстурой кротонового масла 0.02 мл каждой мыши. Через 4 часа убивают мышь выпадением шейных позвонков, срезают левое и правое ухо, взвешивают вес поспаленного и вес контрольного уха, разница между ними, выраженная в мг, представляется как степень опухания уха, результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11

Влияние Фзншипина на опухание уха маленькой мыши, вызванное кротоновым маслом 
группа доза (г/кг) количество (штука) степень опухания уха (мг) процент ингибирование (%) значение Р 
контрольная - 10 44.38±9.40 
Фэншипин 27 10 39.05±12.33 12.00 >0.05 
Фэншипин 40 10 36.65±5.83 17.64 <0.05 
Фэншипин 60 10 34.91±9.71 21.34 <0.05 
дексаметазон 0.003 10 14.13±5.75 68.16 <0.01 


Результаты в таблице 11 показывают то, что Фэншипин заметно ингибирует опухание уха маленькой мыши, вызванное кретоновым маслом, причем существует зависимость реакции от дозы, однако кривая зависимость реакции дозы пологая, при дозе 13.5 г/кг действие ингибирование очень заметно.

Экспериментальный пример 12: влияние на реакцию теловой крутки маленькой мыши, вызванную уксусной кислотой

Берут 60 маленьких мышей куньминского рода с весом 18-22 г, в том числе половина женского пола и половина мужского пола, случайно разделяют на 6 групп, в отдельности вливают лекарственную жидкость или слизь гуммитраганта разной дозы. Через 1 час после приема средства делают инъекцию 0.7% физиологическим раствором НАС в брюшную полость 0.2 мл каждой мыши. Кладут маленькую мышь в стеклянный горшок и наблюдают латентный период возникновения реакции теловой крутки разных мышей и количества теловой крутки в течение 20 минут, результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12

Влияние Фэншипина на количество теловой крутки маленькой мыши, вызванной уксусной кислотой 
группа доза (г/кг) количество (штука) количество теловой крутки латентный период (минута) 
контрольная - 10 34.6±14.1 3.13±0.80 
Фэншипин 27 10 28.2±5.76 3.82±0.85 
Фэншипин 40 10 31.0±18.4 3.86±2.00 
Фэншипин 60 10 20.7±12.3* 3.95±1.42 
Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 20 10 25.1±11.9 3.60±0.93 
хлористоводородный морфин 10 мг/кг 10 0.0±0.0 0.00±0.00 


Результаты в таблице 12 показывают то, что при относительно большой дозе Фэншипин может замедлить возникновение реакции теловой крутки маленькой мыши, вызванной уксусной кислотой, и заметно уменьшить количество теловой крутки маленькой мыши в течение 20 минут. Это указывает, что Фэншипин имеет определенное болеутоляющее действие.

Экспериментальный пример 13: Влияние на реологическое свойство крови большой мыши, заболевающей АА

Выбирают большую мышь SD с весом тела 180±20 g, делают внутрикожную инъекцию полным адъювантом Freund's в палец правой задней ноги 0.05 мл по каждой мыши и образуется образец артрита от вспомогательного средства. Делают внутрикожную инъекцию физиологическим раствором в палец правой задней ноги 0.05 мл каждой большой мыши отрицательной контрольной группы. Через 3 недели после образования образцов разделяют мышей на образцовую группу, группы большой, средней и малой дозы, отрицательную контрольную группу и положительную контрольную группу, дают таблетки Glucosidurum Tripterygll Totorum положительной контрольной группе. Дают средства вливанием один раз в день и непрерывно в течение 5 дней. Через 1 час после последнего приема средства берут 3 мл крови из брюшной аорты и вливают в антикоагулятивную пробирку с 1% гепарином, определяют вязкость цельной крови коническо-пластинчатым вязкометром типа NXE-1 при shear rate 230, 115, 46, 23, 11.5 и 5.75S-1. Определяют вязкость плазмы крови регулируемым изобарическим капиллярным вискозиметром типа WTP-B; определяют показатели гематокрита и агрегации эритроцитов гематокритной трубкой путем центрифугирования, жесткие показатели эритроцитов получается подсчетом вышеуказанных результатов, результаты представлены в таблице 13.



Таблица 13 показывает то, что реологическое свойство крови большой мыши, заболевающей АА, очевидно изменяется, вязкость цельной крови и плазмы крови увеличивается, гематокрит уменьшится, показатели агрегации эритроцитов и жесткие показатели повышаются, лечение Фэншипином может заметно улучшать вышеуказанные показатели реологии.

Вышеизложенные эксперименты свидетельствовали о фармакологическом действии Фэншипина, у многих важных фармакологических действий Фэншипина имеется хорошая зависимость реакции от дозы, это указывает, что в клинической практике можно регулировать дозу для достижения наилучшей эффективности лечения.

Исследование эффективности лечения Фэншипина в клинической практике было проведено в Китае, Японии и Австралии. Результаты наблюдения по международным стандартам диагноза, лечения и эффективности лечения соответствующих родов болезни показывают, что эффективность отдельного применения капсулы Фэншипин на RA составляет около 94%. Значимая эффективность составляет около 60%, капсула Фэншипин способна на быстрое улучшение утреннего окоченевания, опухания и других симптомов и соотвтетвующих показателей RA, результаты представлены в таблицах 14˜21.

Таблица 14

Сравнение эффективности лечения лечебной группы с контрольной группой 
группа количество примеров облегчение (клиническое

излечение) значимо эффективно эффективно не эффективно эффективность значимого действия (%) эффективность (%) 
лечебная 32 5 14 11 2 59.38 93.74 
контрольная 30 3 10 12 5 43.33 83.33 
Таблица 15

влияние на IgG, IgA, IgM (X±S) 
группа количество примеров IgG до после IgA до после W до после 
нормальная 32 12.45±1.48 2.37±1.00 1.58±0.59 
лечебная 32 16.92±3.49 14.17±1.39** 3.65±1.03 2.39±1.18** 1.89±0.88 1.48±1.01 
контрольная 30 17.03±4.12 15.14±2.21** 3.45±1.86 2.32±1.75** 2.03±0.95 1.76±1.28 
По сравнению с состоянием до лечения **Р<0.0 


Таблица 16

влияние на С3, С4 (X±S) 
группа количество примеров (штука) С3 С4 
до после до после 
нормальная 32 0.62±0.13 0.14±0.15 
лечебная 32 1.88±0.72 0.48±0.12 
1.25±0.66** 0.26±0.06* 
контрольная 30 2.13±0.64 0.40±0.16 
1.56±0.62** 0.25±0.07** 
По сравнению с состоянием до лечения *Р<0.05, **Р<0.01 
Таблица 17

влияние на ESR, CRP (X±S) 
группа количество примеров (штука) ESR до после CRP до после 
нормальная 32 8.37±5.26 4.12±1.88 
лечебная 32 66.58±9.01 30.31±6.53** 13.35±6.67 
8.86±3.34* 
контрольная 30 73.33±9.09 14.21±6.29 
35.83±11.61 ** 9.04±3.15** 
По сравнению с состоянием до лечения *Р<0.05, **Р<0.01 


Таблица 18

сравнение силы рук до и после лечения (Х±S) 
группа лечебная группа контрольная группа 
до после до после 
сила левой руки 39.13±20.24 (15) 24.00±17.63 (21) 
(mmHg) 80.47±34.61** (15) 55.15±23.27** (21) 
сила правой руки 35.85±22.46 (15) 22.80±12.32 (21) 
85.32±36.32** (15) 58.17±20.59** (21) 
По сравнению с состоянием до лечения *Р<0.05, **Р<0.01 


Таблица 19

Влияние на опухание и боль сустава и утреннее окоченение (X±S) 
предмет лечебная группа контрольная группа 
до после до после 
опухание и боль сустава продолжительность окоченения (минута) утреннего 5.79±0.52 3.14±0.83* 5.56±2.15 3.92±0.26* 
50.33±6.47 20.24±3.27** 48.75±8.34 27.50±3.78** 
По сравнению с состоянием до лечения *Р<0.05, **Р<0.01 
Таблица 20

Влияние на превращение RF в отрицательность 
группа количество примеров отрицательность RF 
до после процент превращения в отрицательность (%)

54.2

44.4 
лечебная 32 24 11

10 
контрольная 30 18 


Наряду с достижения заметного эффекта лечения, Фэншипин также может уменьшить S1L - 2R, STNF, SIL - 6R сыворотки крови больных, результаты представлены в таблице 21.

Таблица 21

влияние на основные показатели: SIL - 2R, STNF, SIL - 6R (X±S) 
группа количество примеров (штука) SlL-2R (u/ml) STNF R1 (ng/ml) SIL-6R (ng/ml) 
до после до после до после 
нормальная 32 299±68 1.56±0.48 72.05±18.26 
(n=32) (n=24) (n=22) 
Фэншипин 15 683±189 2.87±0.66 136.18±28.57 
381±157** 1.75±0.54** 90.15±20.12** 
контрольная 10 765±203 2.63±0.72 148.21±30.31 
412±167** 2.38±0.39 (n=8) 99.02±26.70** 
По сравнению с состоянием до лечения **Р<0.01 


ПРИМЕР 1

ЛЕЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОГО НЕФРИТА ПОЧЕЧНЫХ ГЛОБУЛ ФУНШИПИН НА ПРАКТИКЕ

Исследованы больные хроническим нефритом 60 человек, главные проявления: альбуминурия, кровавая моча. Свободно разделяют их на две группы: экспериментальная группа и сравнительная группа по 30 человек. Экспериментальной группе: 2 капсулы фуншипин каждый раз, три раза в сутки, прием после еды. Сравнительная группа: каждый раз 20 мг лэйгунтэнтуадэй, три раза в сутки, лечебный курс 8 недель. Записывают симптом и изменение тела больных, проверяют мочу: дозирование белка мочи в течение 24 часов (24h UPQ), белый белок плазмы (А), функцию печени (GPT), функцию почки (BUN SCr), закон крови (WBC). После 4 и 8 неделей лечения повторяют вышесказанные проверки, смотрят стандарт "принцип руководства изучения на практике нового китайского лекарства", оценивают эффект. В результате в экспериментальной группы из 30 человек 18 человек имеют полную ремиссию (60%), 9 человек имеют частную ремиссию (30%), 2 человека имеют влияние (6,7%), 1 человек без влияния (3,3%), общая эффективность 96.7%. В сравнительной группе 30 человек. 15 человек имеют полную ремиссию (50%), 6 человек имеют частную ремиссию (20%), 6 человек имеют влияние (20%), 2 человека без влияния (10%), общая эффективность 90%. Сравнивают значительную эффективность двух групп (полная ремиссия + частную ремиссия), Р<0.01. Кроме этого, показатель 24h UPQ (g) в экспериментальной группы быстрее и больше снижается, чем в сравнительной группе, перед лечением, в момент лечения 4 недели и в момент 8 неделей величины 2.63±0.72, 1.10±0.56 (Р<0.05), 0.42=0.28 (Р<0.01); величины в сравнительной группе 2.48±0.92, 1.78±0.64, 1.05±0.66 (Р<0.01). В экспериментальной группе у 3 человек после приема появлялось распухание в желудке, после еды принималось лекарство, симптом исчезает, в сравнительной группе у 4 человек распухание в желудке и тошнота, у 3 человека легкое разрушение функции печени, самая высокая величина GPT 68.5 U/L, у 12 больных женщин с регулами появилось уменьшение и дезорганизация регул.

ПРИМЕР 2

ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ С БОЛЕЗНЕЙ SLE СИСТЕМАТИЧЕСКИ АКТИВНОГО ПЕРИОДА (SLE).

60 больных свободно делят на две группы: экспериментальная группа принимает 2-3 капсулы фуншипин каждый раз, три раза в сутки, прием после еды; сравнительная группа: прием 50 мг в сутки преднизона (через каждые две недели уменьшить на 10 мг, когда дозировка ровно 30 мг, через каждые две недели уменьшить на 10 мг). Плюс инъекции в вену 0,2 г циклофосфамида, один раз в два дня. Непрерывно лечить 3 месяца. В результате в сравнительной группе 2 человека вылечили, 7 человек имеют значительную эффективность, 14 человек имеют влияние, 7 человек без влияния. В экспериментальной группе на практике вылечили 3 человека, у 8 человека значительная эффективность, у 13 человек есть влияние, у 6 человек нет влияния, больные двух групп получили хороший эффект. Активный показатель SLE больных (SLEDAI), осадки крови (ESR), дозирование белка в моче С 3 24h и величина капли антитела ds DNA значительно снижаются у двух групп без значительной разницы. В сравнительной группе у 5 человек белые клетки снижаются, у 2 человек тромобцитопения, у 5 человек тошнота, у 2 человек выпадение волос, у 2 человек увеличение показателя функции печени. В экспериментальной группе, принимающей фуншипин, маленькое и легкое недомогание, только у 2 человек боль в желудке и вздутие в верхней части желудка, у одного человека легкое падение белых клеток.

Пример 3

Женщина, 40 лет, боль в животе, диарея с кровью, низкая температура, уменьшение веса, точки в животе. При проверке рентгенометром с применением агента бария, внутреннего зеркала и осмотра причины болезни, определили болезнь клона с 6 лет.

После лечения гормонами и депрессорами иммунитета положение болезни не стабилизированное, бывает боль в животе, 3-4 раза диареи в сутки, высокая температура (37.8°С), вес тела 46 кг, значительная анемия. После приема фуншипина 3-4 капсул один раз и 3 раза в сутки, через 4 недели положение болезни стабилизованное, через 3 месяца лечения боль в животе и диарея исчезают, температура тела нормальная, анемия уменьшается, увеличивается вес (52 kg). По активному показателю болезнь клона (CDA1) считается вылеченной.

Ниже приводятся конкретные примеры получения фармацевтических композиций согласно изобретению, которые обеспечат вышеизложенные эффекты.

Пример 1

Горянка крупноцветковая 2222 г

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2222 г

Ягоды дерезы 1111 г

Семена повилики 1111 г

Крошат Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз в течение 1 ч; режут Горянку крупноцветковую на куски, в отдельности экстрагируют три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз в течение 1 ч; дробят Ягоды дерезы в грубый материал, замачивают в 20-кратных теплых водах 80°С на 1 ч; крошат Семена повилики в крупнозернистый порошок, замачивают в 31-кратных теплых водах 80°С на 1 ч; фильтруют в отдельности отвары и жидкости замачивания четырех сырьевых лекарственных материалов, потом раздельно пропускают через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку и элюируют 70% этиловым спиртом до вытекания элюента темного цвета, который собирают до того, как его цвет переходит к светлому цвету, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

В полученные лекарственные порошки экстрактов добавляют лекарственный крахмал до 200 грамм, равномерно смешивают, потом их расфасовывают в 1000 капсул. Каждая капсула, изготовленная по заявленному способу, содержит 0.2 г смеси лекарственных экстрактов, причем содержание икариина С33 H40O15 в каждой капсуле меньше 2.0 mg не допускается. Обычная доза приема через рот составляет 3 капсулы по 3 раза в день.

Пример 2

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2000 г

Горянка крупноцветковая 2000 г

Крошат Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз в течение 1 ч; режут Горянку крупноцветковую на куски, в отдельности экстрагируют три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз в течение 1 ч; фильтруют в отдельности отвары двух сырьевых лекарственных материалов. Отвары пропускают в отдельности через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку и элюируют 70% этиловым спиртом до вытекания элюента темного цвета, который собирают до перехода его цвета к светлому, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

Полученные лекарственные порошки экстрактов совмещают и равномерно смешивают с лекарственным крахмалом, расфасовывают в 1000 капсул. Каждая капсула, приготовленная методом согласно изобретению, содержит 0.2 г смеси лекарственных экстрактов, причем содержание икариина С33Н 40O15 в каждой капсуле меньше 2.0 мг не допускается. Обычная доза приема через рот составляет 3 капсулы 3 раза в день.

Пример 3

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2000 г

Горянка крупноцветковая 2000 г

Ягоды дерезы 1000 г

Крошат Tripterygium bypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз продолжается 1 ч; режут Горянку крупноцветковую на куски, в отдельности экстрагируют три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз на 1 час; дробят Ягоды дерезы в грубый материал, замачивают в 20-кратных теплых водах 80°С на 1 час; фильтруют в отдельности отвары и замоченные жидкости трех сырьевых лекарственных материалов, потом пропускают в отдельности через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, элюируют 70% алкоголем до вытекания элюента темного цвета, который собирают до перехода его цвета к светлому, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

Полученные лекарственные порошки экстрактов совмещают и равномерно смешивают с лекарственным крахмалом, расфасовывают в 1000 капсул.

Каждая капсула, приготовленная методом согласно изобретению, содержит 0.2 г смеси лекарственных экстрактов, причем содержание икариина С33H 40O15 в каждой капсуле меньше 2.0 мг не допускается. Обычная доза приема через рот составляет 3 капсулы 3 раза в день

Пример 4

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2000 г

Горянка крупноцветковая 2000 г

Семена повилики 1000 г

Крошат Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз продолжается на 1 ч; режут Горянку крупноцветковую на куски, в отдельности экстрагируют три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз продолжается 1 ч; крошат Семена повилики на крупнозернистый порошок, тепло замачивают в 31-кратных водах 80 на 1 час; фильтруют в отдельности жидкости отварения и замачивания трех лекарственных материалов, потом проходят в отдельности широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, потом элюируют 70% алкоголем до вытекания элюента темного цвета, который собирают до перехода его цвета к светлому, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

Полученные четыре лекарственных порошка экстрактов совмещают и равномерно смешивают с лекарственным крахмалом, расфасовывают в 1000 капсул.

Каждая капсула, приготовленная методом согласно изобретению, содержит 0.2 г смеси лекарственных экстрактов, причем содержание икариина С 33H40О15 в каждой капсуле меньше 2.0 мг не допускается. Обычная доза приема через рот составляет 3 капсулы 3 раза в день

Пример 5

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2000 г

Семена повилики 1000

Крошат Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз 1 час. Крошат Семена повилики на крупнозернистый порошок, замачивают в 31-кратных теплых водах 80°С на 1 час; фильтруют в отдельности отвар и замоченные жидкости двух лекарственных материалов, потом пропускают в отдельности через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, потом элюируют 70% алкоголем до вытекания элюента темного цвета, который собирают до перехода его цвета к светлому, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

Полученные два лекарственных порошка экстрактов совмещают и равномерно смешивают с лекарственным крахмалом, расфасовывают в 1000 капсул.

Ежедневная дозировка капсулы, приготовленная описанным способом согласно изобретению, равна количеству лекарственного сырья - 30 г/день.

Пример 6

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2000 г

Ягоды дерезы 1000 г

Крошат Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch на мелкие куски, в отдельности экстрагируют три раза в 13-, 10-, 10-кратных водах, каждый раз на 1 час; дробят Ягоды дерезы в грубый материал, замачивают в 20-кратных теплых водах 80°С на 1 час; фильтруют в отдельности отвар и замоченную жидкость лекарственных материалов, потом пропускают в отдельности через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, потом элюируют 70% алкоголем до вытекания элюента темного цвета, который собирают до перехода его цвета к светлому, элюент подвергают рециркулированию до выделения спирта. Полученные экстракты концентрируют и сушат.

Полученные лекарственные порошки экстрактов совмещают и равномерно смешивают с лекарственным крахмалом, расфасовывают в 1000 капсул.

Ежедневная дозировка капсулы, сделанной путем данного изобретения, равна количеству лекарственного сырья - 30 г/день.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Фармацевтическая композиция для лечения ревматизма, приготовленная из сырьевого лекарственного материала Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch и по меньшей мере одного из сырьевых лекарственных материалов, выбранного из группы: Горянка крупноцветковая (Epimedium brevicomum Maxim.), Ягоды дерезы (Lycium barbarum L.), Семена повилики (Cuscuta chinensis Lam., Cuscuta australis R.Br.), или их смеси, взятых при следующем массовом соотношении:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 1-4 
Горянка крупноцветковая (Epimedium brevicomum Maxim.) 1-4 
Ягоды дерезы (Lycium barbarum L.) 1-4 
Семена повилики (Cuscuta chinensis Lam., 
Cuscuta australis R.Br.) 1-4 


2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что приготовлена из названных сырьевых лекарственных материалов, взятых при следующем массовом соотношении:

Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch 2 
Горянка крупноцветковая (Epimedium brevicomum Maxim.) 2 
Ягоды дерезы (Lycium barbarum L.) 1 
Семена повилики (Cuscuta chinensis Lam., 
Cuscuta australis R.Br.) 1 


3. Способ приготовления фармацевтической композиции по любому из пп.1 и 2, включающий следующие операции: взвешивание сырьевых лекарственных материалов и измельчение Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch и названной Горянки крупноцветковой, раздельное их отваривание в воде 3 раза, замачивание названных Ягод дерезы, Семян повилики водой при температуре 80-95°С 1-3 раза, раздельное пропускание полученных отваров и полученных жидкостей через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, промывание водой смоляной колонки до осветления вытекающей жидкости, элюирование 30-99,3% этиловым спиртом до вытекания жидкости темного цвета, собирание элюента до того, как его цвет переходит от темного к светлому, выведение спиртовой жидкости из колонки водой, смешение элюата со спиртовой жидкостью, при этом общий вес элюата в 1-8 раз тяжелее веса названных сырьевых лекарственных средств, рециркулирование элюента каждого из сырьевого лекарственного материала до извлечения спирта, концентрирование до удельного веса 1,10, сушка экстрактов каждого сырьевого лекарственного материалов в отдельности или в сочетании, смешивание их равномерно или смешивание в пропорции с получением лекарственной формы, приемлемой в клинической практике.

4. Способ приготовления фармацевтической композиции по любому из пп.1 и 2, характеризующийся тем, что Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch крошат на мелкие куски, экстрагируют три раза раздельно в 13-, 10-, 10-кратных водах в течение одного часа, Горянку крупноцветковую крошат на сегменты, экстрагируют раздельно три раза в 15-, 10-, 10-кратных водах в течение одного часа, Ягоды дерезы дробят в грубый материал и замачивают в 20-кратных водах при температуре 80-95°С в течение одного часа, Семена повилики крошат в крупнозернистый порошок, замачивают в 31-кратных водах при температуре 80°С в течение одного часа, фильтруют раздельно экстракты или жидкости замачивания названных четырех сырьевых лекарственных материалов, затем пропускают через широкогорлую смоляную адсорбционную колонку, подвергают элюированию 70% этиловым спиртом до вытекания элюента темного цвета, который собирают до того, как его цвет переходит от темного к светлому, элюент из названных сырьевых средств рециркулируют до извлечения спирта, концентрируют, сушат, полученные лекарственные порошки экстрактов смешивают равномерно или в пропорции с получением лекарственной формы, приемлемой в клинической практике.

5. Способ приготовления фармацевтической композиции по п.3, характеризующийся тем, что получают любые лекарственные формы, приемлемые в клинической практике, такие как твердая капсула, мягкая капсула, таблетка, гранула, инъекция.

6. Способ приготовления фармацевтической композиции по п.4, характеризующийся тем, что получают любые лекарственные формы, приемлемые в клинической практике, такие как твердая капсула, мягкая капсула, таблетка, гранула, инъекция.

7. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1 и 2 для приготовления средства для лечения ревматизма или ревматоидного артрита.

8. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1 и 2 для приготовления средства для лечения хронического нефрита.