ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К CD3-АНТИГЕНУ Т- ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ГИБРИДОМА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ, ИМЕЮЩИХ РЕАКЦИЮ ОСТРОГО ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА ПОСЛЕ ПЕРЕСАДКИ ПОЧКИ

ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К CD3-АНТИГЕНУ Т- ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ГИБРИДОМА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ, ИМЕЮЩИХ РЕАКЦИЮ ОСТРОГО ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА ПОСЛЕ ПЕРЕСАДКИ ПОЧКИ 


RU (11) 2179862 (13) C1

(51) 7 A61K39/395, C12N5/18, C12P21/08, A61P37/06 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 26.12.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(21) Заявка: 2000132445/14 
(22) Дата подачи заявки: 2000.12.26 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2000.12.26 
(45) Опубликовано: 2002.02.27 
(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: US 4361549 A, 30.11.1982. US 4515893 A, 07.05.1985. US 4654210 A, 31.03.1987. RU 2009500 C1, 15.03.1994. WO 91/07437 A1, 30.05.1991. WO 97/33611 A1, 18.09.1997. WO 98/20142 A1, 14.05.1998. 
(71) Заявитель(и): Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН; Общество с ограниченной ответственностью Научно- производственный центр "МедБиоСпектр" 
(72) Автор(ы): Иванов П.К.; Барышников А.Ю.; Блохин Д.Ю.; Кадагидзе З.Г.; Заботина Т.Н.; Полосухина Е.Р.; Чинарева И.В.; Перлин Д.В. 
(73) Патентообладатель(и): Общество с ограниченной ответственностью Научно- производственный центр "МедБиоСпектр" 
Адрес для переписки: 115478, Москва, Каширское ш., 24, РОНЦ РАМН, патентно- лицензионное отделение, Е.В.Колчиной 

(54) ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К CD3-АНТИГЕНУ Т- ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ГИБРИДОМА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ, ИМЕЮЩИХ РЕАКЦИЮ ОСТРОГО ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА ПОСЛЕ ПЕРЕСАДКИ ПОЧКИ 

Изобретение относится к медицине и касается лекарственного средства для предотвращения отторжения трансплантата, моноклонального антитела к CD3 антигену Т-лимфоцитов человека, гибридомы, продуцирующей эти антитела, и способа лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки. Сущность изобретения заключается в том, что предлагаемое лекарственное средство представляет собой раствор очищенного иммуноглобулина IgG2a в физиологическом растворе фосфатно-солевого буфера, рН= 7,2-7,4, с содержанием активного вещества 1-10 мг/мл и 0,01-0,02% твина - 80. В способе лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки, лечение проводят предлагаемым лекарственным средством, которое вводят в количестве 1-5 мг в течение 7-14 дней. Моноклональное антитело к CD3 антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, продуцируемое штаммом гибридомных культивируемых клеток животных Mus.musculus L., ICO-90, ВСКК(П)368Д, связывающееся с Т-лимфоцитами периферической крови и тимоцитами человека, а также с клетками культур Т-лимфоцитов человека и клетками линии Jurkat и не связывающееся с лейкоцитами, эритроцитами, тромбоцитами периферической крови человека и клетками культур В-лимфоцитов, пре-В-лимфоцитов, эритробластов, миелоцитов и монобластов. Преимущество изобретения заключается в снижении случаев отторжения трансплантата и аллергизации организма у больных после пересадки почки. 4 c. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к медицине и касается лекарственного средства для предотвращения отторжения трансплантата, моноклонального антитела к СВ3-антигену Т-лимфоцитов человека, гибридомы, продуцирующей эти антитела и способа лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки.

Предпосылки изобретения

Реакция острого отторжения трансплантата (РООТ) является серьезным послеоперационным осложнением у больных, подвергавшихся пересадке органов и тканей. В основе этого осложнения лежит иммунная реакция организма-хозяина против чужеродных антигенов трансплантата. Под антигенами в иммунологии понимают вещества или структуры, способные вызвать иммунную реакцию против них.

Известно, что каждый человек характеризуется собственным набором антигенов на клетках различных органов и тканей. Этот набор определяется генетически и, соответственно, различие антигенов у разных людей (и животных) зависит от степени генетической близости между ними. При пересадке человеку донорского органа с иным набором тканевых антигенов в организме человека-реципиента развивается иммунная реакция на чужеродный антиген, приводящая в конечном итоге к отторжению трансплантата.

Известно, что иммунная система человека и животных состоит из двух взаимодействующих частей, осуществляющих соответственно гуморальный и клеточный иммунитет. Гуморальный иммунитет осуществляется В-лимфоцитами, которые формируются и дифференцируются из стволовых клеток кроветворной системы в костном мозге, и связан с продукцией В-клетками антител к растворимым антигенам. Клеточный иммунитет осуществляется Т-клетками, которые формируются и дифференцируются из стволовых клеток кроветворной системы в тимусе. Находясь в тимусе, эти клетки называются тимоцитами, а после выхода в кровоток они называются Т-лимфоцитами. Для осуществления многих иммунных реакций требуется взаимодействие В- и Т-клеток.

РООТ осуществляется, в основном, по механизму клеточного иммунитета. Для подавления РООТ традиционно применяли препараты-иммуносупрессоры (азатиоприн, циклоспорин, преднизолон). Эти препараты неспецифично подавляют активность иммунной системы и вызывают целый ряд связанных с этим побочных эффектов (инфекции, опухолевый рост и т.д.). В связи с этим постоянно велся поиск препаратов, более селективно подавляющих активность клеточного иммунитета без торможения активности гуморального иммунитета.

Одним из перспективных направлений лекарственной терапии, в целом, является применение так называемых моноклональных антител (МКА) для разрушения или инактивация веществ и структур, участвующих в развитии заболеваний.

МКА - это полученный по специальной технологии особо чистый препарат антител к определенному антигену. Вообще, антитела представляют собой иммуноглобулины, которые продуцируются В-лимфоцитами при попадании в организм чужеродного антигена. С помощью антител организм уничтожает или инактивирует те антигены, которые вызвали продукцию этих антител.

Традиционно, препараты антител к тому или иному антигену получали путем иммунизации животных этим антигеном и последующего выделения антител из крови животных. Однако, поскольку организм животного постоянно подвергается воздействию внешней среды и различных внешних антигенов, то в его крови постоянно присутствует целый спектр антител, направленных против разных антигенов. Выделить из этой смеси антитела, направленные против какого-либо одного антигена, технически довольно сложно. Поэтому получаемые таким способом препараты антител к определенному антигену, как правило, имели примеси антител к другим антигенам и находили применение, в основном, для исследовательских целей. Техническая сложность получения чистого препарата антител, направленных только против одного антигена, долгое время являлась препятствием для их широко клинического применения.

В 1975 г. была разработана принципиально новая методика, позволяющая получать практически чистые препараты антител, направленных против того или иного антигена (см. Kohler et al., 1975). В основе методики лежит создание гибридных линий клеток, синтезирующих антитела только к одному определенному антигену. Как известно, антитела продуцируются В-лимфоцитами, но лимфоциты в клеточной культуре не поддерживаются и через несколько делений погибают. Суть идеи этих авторов заключалась в том, что В-лимфоциты гибридизировали с "бессмертной" культурой клеток миеломы, неограниченно поддерживающейся в культуре клеток. Таким образом, получающийся клеточный гибрид обладает способностью В-лимфоцитов продуцировать антитела и способностью клеток миеломы неограниченно поддерживаться в культуре.

Для получения гибридомы, продуцирующей антитела к определенному антигену, мышей иммунизируют данным антигеном, получают клетки селезенки и гибридизируют их с клетками миеломы мыши (обычно миеломы P3X63.Ag8.653). После слияния клетки рассеивают по одной и впоследствии отбирают те колонии, которые продуцируют антитела к исходному антигену. Отобранные колонии далее культивируют как клеточный штамм. Поскольку все клетки культуры-продуцента представляют собой клон потомков одной гибридной клетки, то синтезируемые ими антитела называют моноклональными.

С помощью гибридомной технологии к настоящему времени получены сотни МКА к самым разным антигенам человека и других организмов. Эти антитела широко применяются в экспериментальных исследованиях этиологии, патогенеза и способов лечения различных заболеваний, для иммуноферментной диагностики и контроля течения заболеваний, а также для оценки гормонального и иммунного статуса пациентов (см., например, обзоры Laurino с соавт., 1999 и Барышникова et al., 1996 и содержащиеся в них ссылки).

Т-лимфоциты человека имеют характерный только для них антиген CD3, который представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярным весом около 20 кДа и присутствует на всех зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах. Связывание антител с этим антигеном приводит к резкому угнетению клеточного иммунитета, что может быть обусловлено следующими причинами:

1) связывание антитела с антигеном приводит к стерической модификации связанного с CD3-антигеном Т-клеточного рецептора антигенов (ТРА), в результате чего блокируется активация Т-лимфоцитов антигенами;

2) связывание антитела с антигеном способствует опсонизации циркулирующих Т-клеток и их захвату и разрушению в ретикулоэндотелиальной системе;

3) после связывания антитела с антигеном происходит кратковременная активация Т-лимфоцита, в результате которой из клетки выбрасываются цитокины, блокирующие пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников Т-лимфоцитов. К числу этих цитокинов относятся интерлейкины-2, -3, -6, -10, гамма-интерферон и фактор некроза опухоли;

4) связывание антитела с антигеном запускает процесс апоптоза (запрограммированной гибели) Т-лимфоцитов.

Кроме того, полагают, что связывание антитела с антигеном CD3 может вызывать следующее:

1) интернализация комплекса CD3-TPA из мембраны и, соответственно, снижение способности Т-лимфоцитов к активации антигенами;

2) усиление экспрессии в лимфоцитах молекул адгезии, что приводит к усилению адгезии лимфоцитов на эндотелии сосудов;

3) клеточно-опосредованный цитолиз Т-лимфоцитов.

В результате уже через 1 час после внутривенного введения антител к антигену CD3 из кровеносного русла исчезают почти все функционально-активные Т-лимфоциты.

Уже в середине 1970-х г. было известно, что введение больным антител к поверхностным антигенам Т-лимфоцитов позволяет предотвратить или ослабить РООТ (Cosimi et al., 1976). В конце 1970-х г. методом гибридомной технологии были получены первые моноклональные антитела к антигену CD3 Т-лимфоцитов человека, и несколько позже была подтверждена их эффективность для предотвращения отторжения трансплантата (Cosimi et al., 1981 г.). Первым препаратом на основе моноклональных антител к антигену CD3 Т-лимфоцитов человека является препарат Ортоклон ОКТ3 компании Ortho Pharmaceuticals (США), который в 1986 г. был разрешен Управлением по контролю качества продуктов и лекарств США для предупреждения и лечения реакции острого отторжения трансплантата при пересадке почки.

Моноклональные антитела ОКТ3 представляют собой иммуноглобулины класса IgG, подкласса IgG2, продуцируются гибридомой АТСС CRL8001, культивируемой в подходящей среде и полученной слиянием клеток миеломы Р3х63 Ag8Ul и клеток селезенки мышей CAF1, предварительно иммунизированных Т-клетками человека, очищенными методом розеткообразования (патент US 4361549).

В патенте US 4515893 этой же компании была запатентована гибридома, продуцирующая эти антитела, которые реагируют более чем с 95% Т-клеток периферической крови человека, но не реагируют с В-клетками. При этом в патенте обсуждается возможность терапевтического и диагностического применения ОКТ3.

Терапевтический препарат ОКТ3 содержит смесь фармацевтически приемлемого носителя с терапевтически эффективным количеством Ортоклона ОКТ3, эффективно ослабляющим или подавляющим отторжение трасплантата у реципиента (патент US 654210). Моноклональное антитело фиксирует комплемент и связывается со всеми нормальными Т-клетками периферической крови человека и клетками кожной Т-клеточной лимфомы, но не связывается с В-клетками, нулевыми клетками и макрофагами. В процессе диагностики, например, Т-клеточного лимфобластного лейкоза смешивают эффективное количество препарата с лимфоцитами периферической крови, полученными от больного, и определяют долю лимфоцитов, взаимодействующих с антителами. В патенте также сообщается, что Ортоклон ОКТ3 ослабляет или предупреждает реакцию отторжения трансплантата, однако конкретных данных о клинической эффективности препарата не приводится.

Несмотря на высокую эффективность подавления РООТ с помощью МКА ОКТ3, примерно у 6% больных применение Ортоклона ОКТ3 оказывается неэффективным, а у 66% больных в последующем наблюдается рецидив РООТ. У больных, не чувствительных к другим типам иммуносупрессоров, частота отсутствия эффекта Ортоклона ОКТ3 достигает 20-25% (Ponticelli et al., 1986, Monaco et al., 1987).

Препараты, аналогичные Ортоклону ОКТ3, были разработаны также рядом других стран: IORT-3 (Куба) и ICO-90 (Россия). В работах Иванова П.К. с соавт. (Иванов П. К. и др., 1998; Ivanov P.К. et al., 1998) описано их применение для лечения реакции острого отторжения трансплантата после пересадки почки, а также их биологическая активность.

В связи с изложенным технический результат данного изобретения направлен на разработку лекарственного средства для предотвращения отторжения трансплантата на основе моноклональных антител ICO-90 и фармацевтически пригодного носителя, обеспечивающего стабильность препарата при длительном хранении, а также высокую эффективность при лечении больных с реакцией острого отторжения трансплантата после пересадки почки с минимальной аллергизацией организма и отсутствием последующих рецидивов, при использовании штамма-продуцента, производящего моноклональные антитела более широкого спектра действия и более высокой специфичности по сравнению с коммерческими препаратами.

Сущность изобретения

Сущность изобретения включает лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата на основе моноклонального антитела к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, представляющее собой очищенный иммуноглобулин подкласса IgG2a, содержащего от 1 до 10 мг активного вещества в 1 мл фосфатно-солевого буфера с рН 7,2-7,6 и 1 0,01-0,02% Твина-80.

Способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки, включает применение этого лекарственного средства.

В варианте этого способа лекарственное средство вводят ежедневно в количестве от 1 до 5 мг.

В предпочтительном варианте осуществления способа лекарственное средство вводят в количестве 5 мг ежедневно.

В другом варианте этого способа введение лекарственного препарата осуществляют ежедневно в течение 7-14 дней.

Предпочтительно вводят лекарственный препарат ежедневно в течение 10 дней.

Моноклональное антитело, на основе которого приготавливают лекарственное средство, представляет собой моноклональное антитело к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д, связывающееся с 60,7% Т-лимфоцитов периферической крови и с 62,7% тимоцитов человека, а также с 97-98% клеток культур Т-лимфоцитов человека (NK1, B12b, Hball) и с 80% клеток линии Jurkat.

В варианте этого изобретения указанное моноклональное антитело не связывается с лейкоцитами (моноцитами и гранулоцитами), эритроцитами и тромбоцитами периферической крови человека и с клетками культур В-лимфоцитов (JFP, JY, Raji, Namalva), пре-В-лимфоцитов (Reh), эритробластов (К562), миелоцитов (HL60) и монобластов (U937).

Еще в одном варианте этого изобретения указанное антитело используется для диагностики заболеваний, связанных с уменьшением или увеличением продукции СD3+-Т-лимфоцитов.

Указанное моноклональное антитело продуцируется штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д.

В варианте изобретения штамм гибридных культивируемых клеток получен слиянием клеток миеломы мыши штамма P3X63.Ag8.653 и клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных Т-лимфоцитами человека, очищенных путем реакции розеткообразования с эритроцитами барана.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевивных соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур.

Конкретные примеры выполнения

Пример 1. Получение гибридомы, продуцирующей МКА ICO-90

Гибридому получают путем слияния клеток миеломы мыши и клеток селезенки мыши, иммунизированной Т-лимфоцитами периферической крови человека.

А) выделение Т-лимфоцитов периферической крови человека

Т-лимфоциты выделяют из пула мононуклеарных клеток на основе реакции розеткообразования с эритроцитами барана, обработанными нейраминидазой.

Кровь из локтевой вены здоровых доноров собирают в раствор гепарина (50 ед/мл). К цельной крови добавляют 10% раствор желатина до конечной концентрации 1%, перемешивают и инкубируют в течение 45 мин при 37oС. При этом осаждаются эритроциты. Плазму, содержащую взвесь лейкоцитов, отсасывают, и лейкоциты осаждают центрифугированием и трижды отмывают.

Лейкоциты наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (9 объемов препарата лейкоцитов на 3 объема градиента) и центрифугируют в течение 40 мин при 300 g и комнатной температуре. Мононуклеарные клетки трижды отмывают средой 199, при этом первый раз центрифугируют в течение 20 мин при 200 g.

Смешивают равные объемы взвеси мононуклеарных клеток (6106/мл), эритроцитов барана и эмбриональной телячьей сыворотки, адсорбированной эритроцитами барана. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37oС, центрифугируют в течение 5 мин при 150 g и инкубируют в течение ночи при 4oС. Клетки осторожно суспензируют, наслаивают на градиент фиколл-верографин и центрифугируют в тех же условиях. Т-клетки, образовавшие розетки, осаждаются на дно пробирки. Розетки из осадка разрушают гипотоническим раствором.

Б) Иммунизация мышей Т-клетками

Мышам линии BALB/c в хвостовую вену вводят Т-клетки в количестве 2107 клеток. Иммунизацию проводят 5 раз с интервалом в 2 недели. Последнюю иммунизацию проводят за 5 дней до проведения гибридизации.

В) Получение клеток селезенки

Селезенку иммунизированных мышей извлекают в стерильных условиях и измельчают в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через марлевый фильтр и дважды отмывают средой 199.

Г) Линия миеломных клеток

Для получения гибридомы используют мышиную миелому P3X63.Ag8.653. Клетки миеломы поддерживают в среде ДМЕМ, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мкМ глютамина и 0,1 мг/мл гентамицина.

Д) Гибридизация клеток

Миеломные клетки дважды отмывают средой 199 и смешивают с клетками селезенки в соотношении 1:5-1:10. Смесь клеток отмывают средой 199 и помещают в объеме 20 мл среды 199 в 100-мл флакон, в котором ее центрифугируют в течение 3 мин при 300 g и инкубируют в течение 20 мин при 37oС. Затем среду отсасывают насухо и к клеткам добавляют 3 мл 50% полиэтиленгликоля. Через 75 с во флакон медленно вливают 20 мл среды 199. Клетки 3 раза отмывают, не встряхивая, и оставляют на 2-8 час. После этого клетки разливают по 0,2 мл в лунки 96-ячейковой микроплашки. На следующий день среду меняют на среду ГАТ (среда ДМЕМ, содержащая 13,6 мкг/мл гипоксантина, 191 нг/мл аминоптерина и 3,85 мкг/мл тимидина). Видимые колонии появляются через 10-14 дней.

Е) Отбор штаммов-продуцентов

Отбор штаммов, продуцирующих МКА, осуществляют путем непрямого иммунофлуоресцентного анализа образцов культуральной жидкости с клетками, используемыми для иммунизации.

Клетки в количестве 500 тыс. инкубируют с 20 мкл супернатанта, разведенного 1:10 в физиологическом растворе с 0,1% азидом натрия. Инкубацию проводят при 4oС в течение 30 мин. После этого клетки дважды промывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 2% эмбриональной телячьей сывороткой, 0,1% азидом натрия и 0,01 М HEPES (среда IFA) и инкубируют при 4oС в течение 30 мин с 20 мкл поликлональных кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с ФИТЦ или пероксидазой хрена. После этого клетки вновь дважды отмывают средой IFA и ресуспензируют в физиологическом растворе с 1% формалина. В полученной суспензии анализируют флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре.

Для контроля специфичности окрашивания в качестве отрицательных контролей вместо первых антител используют буфер, а вместо вторых антител - буфер или меченные антитела другой специфичности.

Штамм, отобранный для получения МКА, получил название ICO-90.

Ж) Клонирование и поддержание гибридомы

Продуцирующую гибридому дважды клонируют на фидере из клеток селезенки и тимуса мышей BALB/c. Для приготовления фидера кусочки тимуса и селезенки измельчают в гомогенизаторе Поттера, взвесь клеток фильтруют через марлевый фильтр и клетки разливают в среде роста по 0,1 мл в лунки 96-ячейковой микроплашки. Через 1-7 дней эти лунки используют как фидер. Клетки продуцирующего клона снимают нежным пипетированием, подсчитывают в камере Горяева и разводят в среде роста до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды роста. Полученную взвесь клеток разливают по 0,1 мл в лунки фидера. При этом на 2 лунки приходилась 1 клетка. Видимые колонии появляются через 10-14 дней. Клонирование считалось эффективным, если колонии вырастали не более чем в 75% лунок.

Культуру гибридомы поддерживают на самках мышей линии BALB/c путем серийного пассажа асцитической жидкости.

Пример 2. Получение МКА ICO-90

МКА ICO-90 выделяют из асцитической жидкости мышей BALB/c, которым внутрибрюшинно инокулируют клетки продуцирующей гибридомы.

А) Получение асцитической жидкости.

За 3-10 дней до инокуляции клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл вазелинового масла или 3% пептона на вазелиновом масле для индукции роста гибридомы в асцитной форме. 107 клеток гибридомы ICO-90 инокулируют мышам внутрибрюшинно и через 7-8 дней, в зависимости от накопления асцита, собирают асцитическую жидкость. Асцитическую жидкость, полученную от разных мышей, объединяют и центрифугируют в течение 20 мин при 2,5 тыс. g и 4oС. Супернатант хранят при -50oС до дальнейшей обработки (до 3 месяцев).

Б) Выделение и очистка МКА ICO-90

МКА ICO-90 выделяют путем аффинной хроматографии на сорбенте протеин А-сефароза (Pharmacia, Швеция). Асцитическую жидкость размораживают и центрифугируют в течение 20 мин при 2,5 тыс. g и 4oС. Супернатант диализируют против стартового буфера (0,1М натрий-фосфатный буфер, рН 8,0) в течение ночи. Полученный диализат наносят на колонку с протеин А-сефарозой, предварительно уравновешенную 0,1М натрий-фосфатным буфером (рН 8,0), и промывают стартовым буфером до отсутствия белка в выходящем растворе. После этого связавшиеся с сорбентом иммуноглобулины элюируют 0,1М натрий-цитратным буфером (рН 3,0). Полученный элюат концентрируют и используют как субстрат для дальнейшего приготовления лекарственного препарата.

Полученные МКА ICO-90 относятся к подтипу IgG2a при анализе методом иммунодиффузии по Оухтерлони. Чистоту полученных МКА ICO-90 оценивают методом вытеснительной ВЭЖХ на сорбенте Superose 12 с использованием в качестве подвижной фазы 0,6М калий-фосфатного буфера (рН 6,8) с 0,1М хлоридом калия. Пик МКА занимает не менее 95% общей площади хроматограммы, а площади индивидуальных пиков примесей не превышают 1% общей площади хроматограммы. Подлинность МКА ICO-90 оценивают методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия. МКА формируют 2 четкие полосы, соответствующие молекулярному весу 25 и 55 кДа. Специфическую активность МКА ICO-90 определяют методом проточной цитофлуориметрии в непрямой реакции иммунофлуоресценции с лимфоцитами человека (см. ниже). При этом на серийных разведениях антител определяют титр антител, соответствующий точке насыщения флуоресценции. Титр насыщения флуоресценции МКА ICO-90 составляет не менее 1:10 000.

В) Получение лекарственного средства на основе МКА ICO-90

Элюат с протеин А-Сефарозой диализируют в течение ночи против 0,01М натрий-фосфатного буфера (рН 7,5), приготовленного на стерильном физиологическом растворе. Диализат разбавляют до концентрации белка 1-10 мг/мл и к полученному раствору добавляют в качестве стабилизатора Твин-80 до конечной концентрации 0,01-0,02%. Полученный препарат стерилизуют путем фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 мк (Millipore, США) и разливают в стерильные флаконы по 5 мл. Готовый препарат хранят при +4oС.

Пример 3. Характеристика антигена, выявляемого МКА ICO-90

Лимфоциты периферической крови доноров выделяют как описано выше, инкубируют с 125I, лизировали и полученный раствор меченных 125I мембранных белков инкубируют с МКА ICO-90, иммобилизованными на гранулированной сефарозе. Затем связавшиеся белки элюируют и разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле. Антитела связываются с белком, имеющим молекулярную массу 25 кДа, что соответствует известной из литературы молекулярной массе антигена CD3 (Kung et al., 1979).

Пример 4. Активность полученных антител в отношении Т-лимфоцитов in vitro

Известно, что связывание антител с антигеном CD3 вызывает временную активацию Т-лимфоцитов, ведущую к их пролиферации (Kaneoka et al., 1983). Нами исследована способность МКА ICO-90 вызывать пролиферацию Т-лимфоцитов человека.

1106 лимфоцитов человека, выделенных на градиенте плотности фиколл-верографин, инкубируют в течение 72 часов в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии полученных антител в различных концентрациях. Степень пролиферации лимфоцитов оценивают по включению 3Н-тимидина. В интактных лимфоцитах (негативный контроль) включение 3Н-тимидина составило 1714220 импульсов/мин. В лимфоцитах, инкубированных с полученными антителами в концентрациях 0,05-50 мкг/мл, включение 3Н-тимидина было увеличено в 15-20 раз, причем эффект антител слабо зависел от их концентрации.

Пример 5. Связывание МКА ICO-90 с различными типами клеток крови человека и культурами клеток

Связывание МКА АТЭМА с клетками регистрируют в непрямой реакции иммунофлуоресценции, при этом клетки инкубируют сначала с МКА, а затем с меченными флуоресцентной меткой (флуоресцеинизотиоцитанатом, ФИТЦ) антителами барана против иммуноглобулинов мыши. Флуоресценцию клеток регистрируют на проточном цитофлуориметре.

А) Получение различных фракций клеток крови

От доноров получают венозную кровь в гепаринизированные пробирки. До дальнейшей обработки кровь хранят при комнатной температуре не более 4 часов.

К 9 мл цельной крови добавляют 1 мл 10% раствора желатина, перемешивают и инкубируют в течение 45 мин при 37oС. Отбирают надосадок, содержащий взвесь лейкоцитов. Лейкоциты осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 150 g и комнатной температуре и дважды промывают средой 199 путем ресуспендирования и центрифугирования в тех же условиях.

Полученные лейкоциты ресуспендируют в 6 мл среды 199 и наслаивают на 2 мл градиента плотности фиколл-верографин; центрифугируют в течение 40 мин при 300 g и комнатной температуре. Отбирают интерфазу, содержащую взвесь моноцитов. Моноциты осаждают центрифугированием в течение 20 мин при 150 g и комнатной температуре и дважды промывают средой 199 путем ресуспендирования и центрифугирования в течение 10 мин при 150 g.

Для получения фракции Т-клеток смешивают равные объемы взвеси мононуклеарных клеток (6106 мл), эритроцитов барана и эмбриональной телячьей сыворотки, адсорбированной эритроцитами барана. Смесь инкубируют в течение 15 мин при 37oС, центрифугируют в течение 5 мин при 150 g и инкубируют в течение ночи при 4oС. Клетки осторожно суспензируют, наслаивают на градиент фиколл-верографин и центрифугируют в тех же условиях. Т-клетки, образовавшие розетки, осаждаются на дно пробирки. Розетки из осадка разрушают гипотоническим раствором.

В полученных фракциях клеток определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и, при необходимости, доводят эту концентрацию до 1 млн клеток/мл средой 199.

Б) Культуры клеток

Используют культуры Т-лимфоцитов человека NK1, B12b, Hball, Jurkat, культуры В-лимфоцитов человека JFP, JY, Raji, Namalva, культуру пре-В-лимфоцитов человека Reh, культуру эритробластов человека К562, культуру миелоцитов человека HL-60 и культуру монобластов человека U937, поддерживаемые в Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н. Блохина.

В) Цитофлуориметрический анализ

Антитела в разведении 1:1000 смешивают в стеклянных пробирках с лимфоцитами периферической крови человека в соотношении 0,2 мл раствора антител: 0,5 мл суспензии клеток концентрацией 1 млн/мл. Полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и дважды отмывают средой IFA (0,01М фосфатно-солевой буфер, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки) путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g и температуре 2-8oС и ресуспендирования.

К 1 мл полученной суспензии клеток добавляют 0,1 мл разбавленного раствора меченных ФИТЦ антител барана против IgG мыши (этот раствор готовят в соответствии с индивидуальной инструкцией производителя, прилагающейся к каждой партии меченных антител). Полученную смесь инкубируют в течение 30 мин при 4oС и дважды отмывают средой IFA путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g и температуре 2-8oС.

Полученный осадок ресуспендируют в 1 мл фиксирующего раствора (0,9% растворе хлорида натрия с 1% формалина) и хранят при 4oС до анализа на проточном цитофлуориметре.

Анализ на проточном цитофлуориметре Becton Dickenson FacScan проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора. Регистрируют гистограмму флуоресценции клеток. В качестве отрицательного контроля используют моноклональные антитела ИКО-109, направленные против иммуноглобулинов крысы.

Г) Результаты

Процент клеток, связывающих полученные моноклональные антитела, приведен в таблице 1.

Таким образом, МКА ICO-90 связываются с 60,7% Т-лимфоцитов периферической крови и 62,7% тимоцитов человека и не связываются с другими типами клеток крови. МКА ICO-90 также связываются с культурами Т-клеток, но не с культурами других клеток крови и костного мозга.

Пример 6. Сравнение аффинности МКА ICO-90 и МКА Ортоклон ОКТ-3 к СD3-антигенам Т-клеток

Аффинность МКА ICO-90 и Ортоклон ОКТ-3 к СD3-антигенам Т-клеток определяют в непрямой реакции иммунофлуоресценции с Т-лимфоцитами периферической крови человека. При этом на серийных разведениях антител определяют титр антител, соответствующий точке насыщения связывания. Лимфоциты периферической крови человека инкубируют сначала с исследуемым образцом, а затем с конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) поликлональными антителами барана против иммуноглобулинов мыши. Флуоресценцию клеток регистрировали на проточном цитофлуориметре Becton Dickenson FacScan.

Метод получения фракции Т-лимфоцитов периферической крови человека описан в примере 5. Цитофлуориметрический анализ проводят как описано в примере 5, за исключением того, что используют серийные разведения МКА (1:10, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:20000).

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таким образом, насыщение связывания МКА ICO-90 с Т-лимфоцитами периферической крови человека наблюдается при разведении МКА 1:1000, а МКА Ортоклон ОКТ-3 в разведении 1:10 000. 10-кратное отличие насыщающей концентрации этих МКА говорит о более высоком сродстве (аффинности) МКА Ортоклон ОКТ-3 к CD3-антигену Т-клеток по сравнению с МКА ICO-90. Из литературы известно, что МКА, имеющие средний уровень аффинности к CD3-антигену, могут неоднократно связываться с молекулами CD3/TCR комплекса в процессе Т-клеточной активации, индуцируя так называемую активационную гибель клетки (см. Orchansky P.L. et al. J. Immunol., 1994; 153:615, Hurdato J. et al. J. Immunol., 1997; 158(6): 2600, Radvanyi L. et al. J. Immunol., 1993; 150: 5704).

Пример 7. Терапевтический эффект лекарственного средства на основе МКА ICO-90

В марте 1997 года в отделение гемодиализа и трансплантации почки Московского областного научно-исследовательского клинического института (МОНИКИ) им. М.Ф. Владимирского была госпитализирована б-ная К., 20 лет, с клиническим диагнозом "хроническая почечная недостаточность". Последние два года больная находилась на постоянном гемодиализе, ожидая подходящего трансплантата для пересадки почки.

Поводом для госпитализации послужило нахождение подходящего трансплантата. На третьи сутки после проведенной операции появились признаки острого отторжения трансплантата, диурез отсутствовал, креатинин плазмы нарастал. Появилась угроза потери трансплантата.

По жизненным показаниям, с согласия пациентки и по предварительному согласованию директоров Научно-Исследовательского Института экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей Российского Онкологического Научного Центра (НИИ ЭДиТО РОНЦ) им. Н.Н. Блохина РАМН и МОНИКИ, К. был проведен курс лечения лекарственным средством на основе МКА ICO-90. Использовали следующий режим введения: ежедневно по 5 мг препарата внутривенно, на протяжении 10 дней.

Уже к 6-му часу от начала введения антител количество Т-лимфоцитов (определяемое методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа как количество клеток, несущих антиген CD3) в периферической крови снизилось практически до нуля. В дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение количества этих клеток.

Характерно, что снижение, а затем повышение количества Т-лимфоцитов шло одновременно за счет и Т-хелперов (CD4+), и Т-супрессоров (CD8+).

Доказательством того, что при введении МКА ICO-90 в первые часы происходит именно гибель Т-лимфоцитов, а не просто исчезновение антигена, является массовое появление в периферической крови кариоцитов с гиподиплоидным содержанием ДНК, что характерно для развития апоптоза (запрограммированной гибели клеток).

Через 3 дня после начала терапии в результате проведенного лечения у К. появился диурез, креатиновый индекс понизился, была восстановлена функция трансплантированной почки, и через 4 недели больная была выписана домой в хорошем состоянии. В настоящее время ее самочувствие удовлетворительное. В течение срока наблюдения (3,5 года) рецидивов реакции отторжения трансплантата не происходило. С тем же техническим результатом лечение было проведено еще двум пациентам.

Указанное лекарственное средство аналогично другим коммерческим препаратам, может применяться для диагностики ряда заболеваний, связанных с уменьшением или увеличением количества СD3+-лимфоцитов, например, Т-клеточного хронического лимфобластного лейкоза и ревматоидного артрита.

Предлагаемое изобретение позволяет создать лекарственное средство на основе очищенных моноклональных антител к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, которое сохраняет активность в процессе длительного хранения и не приводит к рецидиву реакции острого отторжения трансплантата после пересадки почки. Сами антитела IСО-90, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., ICO-90, ВСКК (П) 368Д, обладают широким спектром действия и высокой избирательностью в отношении различных культур Т-клеток человека.

Таким образом, данное изобретение и предусмотренные им варианты хорошо применимы для достижения целей и результатов, изложенных вначале. В описанные способы и средства могут быть внесены изменения, не влияющие на характер и сферу действия данного изобретения. Предполагается, что каждый элемент или ступень, описанные в каждом из следующих далее пунктов формулы изобретения, следует относить ко всем эквивалентным элементам или ступеням для достижения тех же результатов теми же или равноценными способами. Предполагается расширение сферы действия данного изобретения в любой форме, в которой могут быть использованы его принципы.

Список прилагаемой литературы

1. Kohler G., Milstein C. "Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity". "Nature", 1975; 256: 495-497.

2. Laurino J.P., Shi Q., Ge J. "Monoclonal antibodies, antigens and molecular diagnostics: a practical overview". "Ann Clin Lab Sci", 1999; 29/3: 158-66.

3. Барышников А. Ю. и др. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. Москва, 1996.

4. Cosimi A.B. et al. "Randomized clinical trial of ATG in cadaver renal allograft recipients: importance of T-cell monitoring". "Surgery", 1976; 40: 155-163.

5. Cosimi A.B., Burton R.C., Colvin R.B. et al. "Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody". "Transplantation", 1981; 32: 535-539.

6. US патент N 4361549А, 30.11.82.

7. US патент N 4515893А, 07.05.85.

8. US патент N 4654210А, 31.03.87.

9. Ponticelli C., Rivolta E., Tarantino A. et al. "Clinical experience with OKT3 in renal transplantation". "Transplant Proc", 1986; 18: 942-948.

10. Monaco A., Goldstein G., Barnes L. "Use of OKT3 monoclonal antibody to reverse acute renal allograft rejection unresponsive to treatment with conventional immunosuppressive regimens". "Transplant Proc", 1987; 19: 28-31.

11. Иванов П. К. , Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р. и др. "Создание и характеристика препарата моноклональных антител для предотвращения реакции острого отторжения трансплантата". Тез. докл. V Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 21-25 апреля 1998 г., с. 489.

12. Ivanov P.K., Polosukhina E.R., Zabotina T.N. et al. "Study of biological activity of anti-CDS monoclonal antibodies". Proc. 2nd World Meet. API/APV Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharm. Technology, Paris, 25-28 May, 1998, pp. 1189-1190.

13. Kung P.C., Goldstein G., Reinherz E.L., Schlossman S.F. "Monoclonal antibodies defining dictinctive T-cell surface antigens". "Science", 1979; 206: 347.

14. Kaneoka H. , Perez-Rojas G., Sasaki T. et al. "Human T-lymphocyte proliferation induced by a pan-T-monoclonal antibody (anti-Leu-4): heterogenicity of response is a function of monoculytes". "J. Immunol", 1983; 13/1: 158-164. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата на основе моноклонального антитела к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, отличающееся тем, что оно представляет собой раствор очищенного иммуноглобулина IgG2a в фосфатно-солевом буфере с рН 7,2-7,6, содержащем 1-10 мг активного вещества в 1 мл и 0,01-0,02% твина-80.

2. Способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки, включающий введение пациенту препарата моноклонального антитела к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека ICO-90, отличающийся тем, что в качестве препарата моноклонального антитела используют лекарственное средство по п. 1.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что лекарственное средство вводят ежедневно в количестве 1 - 5 мг.

4. Способ по любому из пп. 2 и 3, отличающийся тем, что лекарственное средство вводят предпочтительно в количестве 5 мг ежедневно.

5. Способ по любому из пп. 2-4, отличающийся тем, что введение лекарственного препарата осуществляют ежедневно в течение 7-14 дней.

6. Способ по любому из пп. 2-5, отличающийся тем, что введение лекарственного препарата осуществляют предпочтительно в течение 10 дней.

7. Моноклональное антитело к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека МКА ICO-90, продуцируемое штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , ICO-90, ВСКК (П) 368Д, связывающееся с 60,7% Т-лимфоцитов периферической крови и 62,7% тимоцитов человека, а также с 97-98% клеток линии Jurkat.

8. Моноклональное антитело по п. 7, отличающееся тем, что оно не связывается с лейкоцитами (моноцитами и гранулоцитами), эритроцитами и тромбоцитами периферической крови человека и с клетками культур В-лимфоцитов (JFP, JY, Raji, Namalva), пре-В-лимфоцитов (Reh), эритробластов (К562), миелоцитов (HL60) и монобластов (U937).

9. Моноклональное антитело по любому из пп. 7-8, отличающееся тем, что оно используется для диагностики заболеваний, связанных с уменьшением или увеличением продукции CD3+-Т-лимфоцитов.

10. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , ICO-90, ВСКК (П) 368Д, используемых для получения моноклональных антител к CD3-антигену Т-лимфоцитов человека по пп. 7-9.

11. Штамм гибридных культивируемых клеток по п. 10, отличающийся тем, что он получен путем слияния клеток миеломы мыши штамма Р3Х63. Ag8.653 и клеток селезенки мышей BALB/с, иммунизированных Т-лимфоцитами человека, очищенных путем реакции розеткообразования с эритроцитами барана.