ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ КРАБОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ КРАБОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2280076 (13) C1

(51) МПК
C12N 9/48 (2006.01)
C12N 9/64 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 27.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.07.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004135771/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.12.06 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.12.06 
(45) Опубликовано: 2006.07.20 
(56) Аналоги изобретения: RU 2039819 C1, 20.07.1995. RU 2034028 C1, 20.10.1997. RU 2112036 C1, 27.05.1997. RU 2121503 С1, 28.02.1998. RU 2225441 C1, 10.03.2004. WO 97/00860, 12.02.1987. ЕР 0402321, 12.12.1990. САХАРОВ И.Ю. и др. Очистка и характеристика коллагенолитической протеиназы из гепатопанкреаса Paralithodes camtschatica. Биохимия, 1998, с.1844-1849. 
(72) Имя изобретателя: Артюков Александр Алексеевич (RU); Мензорова Наталья Ильинична (RU); Козловская Эмма Павловна (RU); Кофанова Нина Николаевна (RU); Козловский Алексей Стефанович (RU); Рассказов Валерий Александрович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской Академии наук (RU) 
(98) Адрес для переписки: 690022, г.Владивосток, пр-т 100 лет Владивостока, 159, Тихоокеанский институт биоорганический химии ДВО РАН, патентный отдел, Н.И. Стадниченко 

(54) ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ КРАБОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Изобретение относится к полиферментным препаратам из морского животного сырья и способам их получения и может найти применение в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов. Препарат получают путем гомогенизации гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных растворах, удаления твердых примесей центрифугированием гомогената, флокуляции липидов хитозаном. Причем гомогенат дополнительно очищают центрифугированием. Ультрафильтрацию раствора ферментного препарата ведут на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа и ниже, а затем на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой 50 кДа и выше. Раствор, содержащий ферментативные активности, лиофилизируют. В состав полиферментного препарата входят коллагенолитические и металлозависимые протеиназы с молекулярной массой меньше 30 кДа, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфодиэстеразы, фосфатазы, амилазы, липазы и -глюканазы. Изобретение обеспечивает расширение арсенала полиферментных препаратов, увеличение выхода ферментного препарата за счет увеличения количества типов ферментов, входящих в полиферментный комплекс (протеазы, нуклеазы, гликозидазы и липазы), повышения уровня активности гидролаз, расширение спектра возможного использования полиферментного препарата в различных отраслях промышленности. 2 з.п. ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к полиферментным препаратам из морского животного сырья и способам их получения и может найти применение в биотехнологии, медицине, косметологии, ветеринарии, сельском хозяйстве, в научных исследованиях и производстве биохимических реактивов.

У ракообразных (крабов, раков и креветок) гепатопанкреас является органом, совмещающим функции печени и поджелудочной железы. Из-за особенностей питания отряда Decapoda гепатопанкреас секретирует большое количество пищеварительных ферментов, гидролизующих все классы природных полимеров и обладающих широкой специфичностью и необычно высокой активностью. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов. В настоящее время из гепатопанкреаса крабов выделяют в высокоочищенном или гомогенном состоянии коллагенолитические протеиназы, аминопептидазу, трипсин, эластазу и Ca, Mg-зависимую ДНКазу.

В то же время получаемые из гепатопанкреаса крабов полиферментные препараты, содержат, как правило, гидролазы одного типа, а именно коллагенолитические протеиназы. На основе коллагенолитических протеиназ разработаны ранозаживляющие препараты "Коллалитин", "Морикраза", "Коллаза", "Коллагеназа КК".

Известны следующие способы получения ферментных препаратов из гепатопанкреаса промысловых видов крабов:

1. Способ получения комплекса протеолитических ферментов, включающий гомогенизацию сырья в водном растворе и осаждение целевого продукта сульфатом аммония. Комплекс ферментов содержит трипсин, карбоксипептидазы А и Б, лейцинаминопептидазу, щелочные и нейтральные протеазы [SU 546648 A1, 15.02.77].

2. Способ получения комплекса протеолитических ферментов из пищеварительных органов наземных и морских животных, включающий экстракцию комплекса из измельченных органов раствором хлористого кальция, очистку от твердых примесей центрифугированием и микрофильтрацию через мембраны. Полученный продукт (протеолитический комплекс) содержит щелочные, нейтральные и кислые протеазы, трипсин, химотрипсин, коллагеназу [RU 2034028 C1, 30.04.95].

3. Способ получения ферментного препарата, включающий экстракцию фермента из замороженного гепатопанкреаса камчатского краба раствором хлорида щелочного металла; отделение осадка пропусканием через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм; микрофильтрацию на мембранах с размером пор 0,45 мкм; ультрафильтрацию на мембранах с пределом пропускания 10 кДа. Ферментный препарат, названный "Коллалитином", содержит коллагенолитические протеазы [RU 2096456 C1, 20.11.97].

Недостатком этого способа является длительность процесса, что снижает выход продукта и уровень его активности. Коллагеназа представлена тремя изоферментами с молекулярной массой в пределах от 18 до 27 кДа.

4. Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности является способ получения ферментного препарата из гепатопанкреаса промысловых видов крабов, обладающего коллагенолитической активностью (коллагеназы). Способ предусматривает гомогенизацию сырья путем автолиза в буферных растворах, с последующим добавлением к гомогенату раствора хитозана до его конечной концентрации 0,01-0,4%, отделением нерастворимого материала и последовательной ультрафильтрации ферментного раствора сначала на мембране, отсекающей балластные вещества с мол.м 100 кДа и более, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол.м. 30 кДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизируют [RU 2039819 C1, 20.07.95).

Способ-прототип довольно прост в исполнении, не продолжителен по времени, не требует токсичных реагентов. Однако в препарате, полученном способом-прототипом, определен только один тип гидролаз, а именно коллагенолитические протеиназы.

На основе этого комплекса в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН создано ранозаживляющее средство широкого спектра действия "Коллагеназа КК", в котором коллагеназа представлена, по крайней мере, тремя изоферментами [RU 2093166 C1, 20.10.97].

В настоящее время область применения известного ферментного комплекса ограничена только его способностью деградировать белки. В то же время во многих случаях успешное решение конкретной проблемы требует использования полиферментных препаратов с более широким спектром действия. Например, для осуществления полной энзиматической деструкции животных и растительных клеток при использовании продуктов гидролиза в биотехнологической, микробиологической и пищевой промышленности.

Задача настоящего изобретения - создать полиферментный препарат, способный гидролизовать 4 класса природных биополимеров, такие как белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды с целью его более широкого и эффективного применения; расширить арсенал комплексных ферментных препаратов, получаемых из гепатопанкреаса промысловых видов крабов и разработать способ его получения.

В результате решения поставленной задачи создан новый полиферментный препарат, содержащий коллагенолитические протеиназы, который согласно изобретению дополнительно содержит металлозависимые протеиназы, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфодиэстеразы, фосфатазы, амилазы, липазы и -глюканазы. Его получают путем гомогенизации гепатопанкреаса промысловых видов крабов в буферных растворах, удаления твердых примесей центрифугированием гомогената, флокуляции липидов хитозаном, ультрафильтрации раствора ферментного препарата на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа и ниже, а затем на мембране, задерживающей вещества с молекулярной массой 50 кДа и выше.

Комплексный препарат содержит набор коллагенолитических протеиназ с молекулярной массой от 18 до 36 кДа, щелочную ДНКазу (42 кДа), кислую ДНКазу (32 кДа), РНКазы (меньше 20 кДа), фосфодиэстеразы, гликозидазы и липазы - (до 35 кДа). Содержание белка в препарате не менее 80% (по методу Лоури). Препарат не содержит ионов тяжелых металлов, примесей, вредных и токсичных веществ.

Технический результат обеспечивается тем, что новый ферментный комплексный препарат содержит 4 типа гидролаз - протеазы, нуклеазы, гликозидазы и липазы, то есть обладает более широким спектром ферментативных активностей по сравнению с известным препаратом, обладающим только одним типом гидролазной активности, а именно - коллагенолитической.

В связи с вышесказанным предлагаемый полиферментный препарат может быть использован на практике с большей эффективностью, чем известные. Например, при использовании препарата в медицине при лечении гнойно-некротических процессов, вызванных бактериальной или вирусной инфекцией, эта эффективность будет обеспечиваться уникальным сочетанием литического действия коллагеназ, протеиназ и нуклеаз и противовирусного эффекта ДНКаз и РНКаз.

Кроме того, предлагаемый комплекс может служить источником для получения традиционными биохимическими методами индивидуальных ферментов или ферментных комплексов направленного действия, например комплекса ДНКазы и РНКазы. Совместное присутствие в предлагаемом ферментном препарате ДНКазы и РНКазы позволит создать для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства противовирусные препараты, которые обеспечат возможность одновременно ингибировать размножение ДНК- и РНК-содержащих вирусов у человека, животных и растений.

Новый препарат расширяет арсенал комплексных ферментных препаратов.

Поставленная задача решена также способом получения ферментного препарата, содержащего коллагенолитические протеиназы, включающим гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых видов крабов, добавление к гомогенату раствора хитозана, отделение нерастворимого материала с последующей ультрафильтрацией полученного раствора и лиофилизацией целевого продукта, в котором согласно изобретению гомогенат подвергают дополнительной очистке путем центрифугирования, а ультрафильтрацию осуществляют на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа и ниже, собирая ферментный препарат, не проходящий через мембрану. Затем полученный концентрат ферментного препарата, содержащего 4 типа гидролаз, пропускают через мембрану, задерживающую вещества с молекулярной массой 50 кДа и выше. В результате получают препарат, дополнительно содержащий коллагенолитические и металлозависимые протеиназы с молекулярной массой меньше 30 кДа, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфодиэстеразы, фосфатазы, амилазы, липазы и -глюканазы.

Во время проведения процесса получения ферментного комплекса поддерживают рН ферментного раствора 5,5-9,5, т.к. авторами экспериментально установлено, что ферментный препарат наиболее активен и стабилен в этом диапазоне рН. При рН ниже 5,5 и выше 9,5 активность комплекса и его отдельных компонентов резко снижается, а при рН ниже 4,5 и выше 10,5 часть ферментов необратимо инактивируется.

Способ может быть осуществлен как при низкой температуре, например 5°С (в условиях холодной комнаты), так и при комнатной температуре.

Хитозан добавляют к гомогенату в виде раствора солевой формы с органической или минеральной кислотами. Введение стадии дополнительной очистки путем центрифугирования гомогената позволяет снизить концентрацию хитозана до 0,001%, что, в свою очередь, уменьшает потери белка, связанные с сорбцией белка на хитозане, а в результате - повышает выход ферментного комплекса.

Использование мембран с пропускающей способностью ниже 50 кДа дает возможность убрать балластные биополимеры с молекулярной массой выше 50 кДа, и, таким образом, повысить удельную активность ферментов, присутствующих в комплексе.

Совокупность существенных признаков заявляемого способа обеспечивает получение технического результата, который заключается в увеличении выхода ферментного препарата за счет увеличения количества типов ферментов, входящих в полиферментный комплекс (протеазы, нуклеазы, гликозидазы и липазы), и в повышении уровня активности гидролаз.

Примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Гепатопанкреас камчатского краба (10 кг) измельчают, добавляют 30 л фосфатного буфера с рН 7,5 и выдерживают смесь при перемешивании в течение 6 ч, при температуре 20°С. Гомогенат центрифугируют при 2000 g и добавляют к супернатанту при интенсивном перемешивании раствор хитозана в 10% уксусной кислоте, доводя конечную концентрацию хитозана до 0,001%, рН раствора при флокуляции - 6,5. Образовавшийся хорошо сформированный осадок отделяют от раствора фильтрацией через плотную хлопчатобумажную ткань (бязь) или центрифугированием раствора в проточной центрифуге при 7000 g. Затем осуществляют обессоливание, концентрирование экстракта и удаление примесных веществ с молекулярной массой меньше 15 кДа из осветленного экстракта на ультрафильтрационной установке с мембранными элементами 15 кДа, собирая ферментный препарат, не проходящий через мембраны. Затем осуществляют удаление примесных веществ с молекулярной массой выше 50 кДа из сконцентрированного и обессоленного экстракта на ультрафильтрационной установке с мембранными элементами 50 кДа (рН раствора ферментов - 7,5). Раствор, содержащий ферментативные активности, лиофилизируют.

Получают 80 г комплексного ферментного препарата. Препарат содержит 0,8 мг белка на мг препарата. Липиды в препарате отсутствуют.

Пример 2. Гепатопанкреас промысловых видов крабов (10 кг) измельчают и помещают в 30 л воды, доводя рН раствора бикарбонатом до значения 8,3 и выдерживают при перемешивании в течение 6 ч, при температуре 5 С°. Затем раствор центрифугируют при 3000 g и добавляют к супернатанту при интенсивном перемешивании раствор хитозана в 0,5 н. соляной кислоте, доводя конечную концентрацию хитозана до 0,001%, рН раствора при флокуляции - 7,0. Далее процесс проводят так, как описано в примере 1, при рН буферного раствора 8,3.

Получают 78,0 г комплексного ферментного препарата. Препарат содержит 0,85 мг белка на мг препарата. Липиды в препарате отсутствуют.

Пример 3. Гепатопанкреас камчатского краба (1 кг) измельчают, добавляют 3 л ацетатного буфера с рН 5,5 и выдерживают смесь при перемешивании в течение 6 ч, при температуре 5°С. Гомогенат центрифугируют при 2000 g и добавляют к супернатанту при интенсивном перемешивании раствор хитозана в 25,0% уксусной кислоте, доводя конечную концентрацию хитозана до 0,001%. Далее процесс проводят так, как описано в примере 1, при рН буферного раствора 5,5.

Получают 7,2 г комплексного ферментного препарата. Препарат содержит 0,75 мг белка на мг препарата. Липиды в препарате отсутствуют.

Пример 4. Гепатопанкреас камчатского краба (1 кг) измельчают и помещают в 3 л воды, доводя рН раствора бикарбонатом до значения 9,5, и выдерживают при перемешивании в течение 6 ч, при температуре 20 С°. Затем раствор центрифугируют при 2000 g и добавляют к супернатанту при интенсивном перемешивании раствор хитозана в 1,0 н. соляной кислоте, доводя конечную концентрацию хитозана до 0,001. Далее процесс проводят так, как описано в примере 1, при рН буферного раствора 9,5.

Получают 7,4 г комплексного ферментного препарата. Препарат содержит 0,78 мг белка на мг препарата. Липиды в препарате отсутствуют.

Ферментный препарат, получаемый заявляемым способом, имеет следующие характеристики:

порошок желтовато-серого цвета, растворимый в дистиллированной воде или буферном растворе, с легким специфическим запахом; препарат не содержит ионов тяжелых металлов, примесей, вредных и токсичных веществ; препарат практически не теряет активности в течение 4-х лет хранения в лиофильно высушенном состоянии при температуре +10°С;

удельная коллагенолитическая активность (коллаген I типа) составляет не менее 1,5 Ед/мг препарата/мин (определение удельной коллагенолитической активности проводят по методике МА 123.12.002-92);

удельная активность трипсиноподобной протеиназы (N-бензоил-аргинина-р-нитроанилид) составляет не менее 3,3 Ед/мг препарата/мин (определение протеиназной активности проводят по методу Эрлангера);

удельная общая протеолитическая активность (казеин) составляет не менее 0,7 Ед/мг препарата/мин (определение протеолитической активности проводят по стандартной методике в соответствии с ГОСТ 20264.2-88);

удельная активность щелочной РНКазы составляет не менее 35 Ед/мг препарата/час;

удельная активность кислой РНКазы составляет не менее 10 Ед/мг препарата/час;

удельная ДНКазная активность составляет не менее 400 Ед/мг препарата/час;

удельная активность щелочной фосфатазы составляет не менее 0,04 Ед/мг препарата/мин;

удельные активности щелочной и кислой фосфодиэстераз составляют не менее 0,003 Ед/мг препарата/мин;

удельная активность -глюканазы составляет не менее 0,01 Ед/мг препарата/мин;

удельная амилазная активность составляет не менее 0,01 Ед/мг препарата/мин;

удельная липазная активность составляет не менее 250 Ед/мг препарата/мин.

Определение активностей ферментов проводят по методикам, приведенным в каталогах фирмы Sigma.

В процессе исследований было установлено, что молекулярная масса ферментов комплекса, обладающих наибольшей активностью, составляет 15-42 кДа. Наиболее активными компонентами комплекса являются сериновые коллагенолитические протеиназы, металлопротеиназы, щелочная ДНКаза, щелочная и кислая РНКазы, амилаза.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Способ получения ферментного препарата из гепатопанкреаса промысловых видов крабов, содержащего коллагенолитические протеиназы, предусматривающий гомогенизацию гепатопанкреаса промысловых крабов в буферном растворе, добавление раствора хитозана в кислоте, отделение нерастворимого материала с последующей ультрафильтрацией полученного раствора и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что гомогенат подвергают дополнительной очистке путем центрифугирования, а ультрафильтрацию осуществляют на мембране, пропускающей вещества с молекулярной массой 15 кДа и ниже, собирая ферментный препарат, не проходящий через мембрану, затем сконцентрированный и обессоленный экстракт пропускают через мембрану, задерживающую вещества с молекулярной массой 50 кДа и выше, с получением препарата, дополнительно содержащего металлозависимые протеиназы, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфодиэстеразы, фосфатазы, амилазы, липазу и -глюканазу.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенизацию и очистку осуществляют при рН ферментного раствора 5,5-9,5 и температуре 5-20°С.

3. Ферментный препарат из гепатопанкреаса промысловых видов крабов, содержащий коллагенолитические протеиназы, отличающийся тем, что он дополнительно содержит металлозависимые протеиназы, рибонуклеазы, дезоксирибонуклеазы, фосфатазы, фосфодиэстеразы, амилазы, липазу и -глюканазу и получен способом по п.1 или 2.