СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ РЕПАРИРОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ТКАНЕ-, ОРГАНО- И СТАДИЕСПЕЦИФИЧНОСТЬЮ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ РЕПАРИРОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ТКАНЕ-, ОРГАНО- И СТАДИЕСПЕЦИФИЧНОСТЬЮ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 


RU (11) 2238756 (13) C1

(51) 7 A61K38/17, A61K31/7105, A61P43/00, A61P31/12 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2004.10.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2003101855/13 
(22) Дата подачи заявки: 2003.01.24 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2003.01.24 
(45) Опубликовано: 2004.10.27 
(56) Аналоги изобретения: RU 2144366 C1, 20.01.2000. МАЗИН А.Л. Низкомолекулярные РНК эукариот: биогенез, субклеточная локализация, функции. Молекулярная биология. 1983, т. 17, вып. 4, c. 755-781. JIAN GU et al. Small RNA database. Nucleic Acids Research. 1997, vol.25, N1, p.98-101. DE JONG E.S. et al. RNA and RNA- protein complexes as targets for therapeutic intervention. Curr. Top. Med. Chem. 2002, Mar.2 (3), p. 289-302. WO 02076490, 03.10.2002. RU 2016579 C1, 30.07.1994. 
(72) Имя изобретателя: Витвицкий В.Н. (RU); Ушаков И.В. (RU); Сидляров Д.П. (RU); Апросин Ю.Д. (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Закрытое акционерное общество "Астера" (RU) 
(98) Адрес для переписки: 129592, Москва, ул. Кулакова, 11, корп.2, кв.6, В.Н. Витвицкому 

(54) СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ РЕПАРИРОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ТКАНЕ-, ОРГАНО- И СТАДИЕСПЕЦИФИЧНОСТЬЮ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам, стимулирующим репарирование повреждений клеток, и может быть использовано в терапии и косметологии. Средство получают путем выделения из ядер клеток млекопитающих фракции низкомолекулярных рибонуклеопептидов с молекулярной массой 3,0-6,5 S (единиц Сведберга). На биомоделях экспериментально подтверждают репаративный эффект средства, а также показывают, что средство обладает ткане-, органо- и стадиеспецифичностью, противовирусной активностью и изменяет среднее время полужизни клеток. Изобретение позволяет расширить область применения низкомолекулярных рибонуклеопептидов, усилить биологические эффекты их действия и получить вещества, функционирующие в организме длительное время без потери способности осуществлять регуляцию функций клеток и корректировать метаболизм при различных патологических нарушениях. 11 табл., 12 ил.





ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицинской и биологической химии, цитологии, молекулярной биологии и генетике и может быть использовано в исследованиях тканевой дифференцировки и дедифференцировки, биосинтеза, репликации и транскрипции при разных функциональных воздействиях на организм как способ выделения активной фракции РНК в генной инженерии и как метод регулирования метаболизма и биосинтеза, пролиферации клеток определенных органов с целью стимулирования репарирования повреждений клеток и восстановления поврежденных функций клеток и органов, регулирования уровня гормонов и других регуляторов метаболизма, активации адаптивных ответов и защитных реакций организма к аллергенам, вирусам, микроорганизмам, вредным физическим и химическим воздействиям, нормализации нарушений структур и функций, вызванных старением, и предназначено для получения биологических препаратов, стимулирующих специфическую органную функцию, что достигается фракционированием клеточных или ядерных нуклеопротеидов из органов крупного рогатого скота, отбором активных органоспецифических рибонуклеопептидов-регуляторов (РНП), стерилизацией, лиофилизацией и фасовкой в ампулы с последующим использованием в экспериментальной и лечебной ветеринарии и косметике и для целенаправленных разработок в лечебном деле.

Большинство применяемых в настоящее время лекарств представляют собой определенные природные метаболиты или их синтетические аналоги, т.е. звенья низшего уровня многоплановых структур и систем метаболизма, и действуют на одно конкретное звено метаболизма - белок или фермент. К настоящему времени фармакологи научились корректировать работу приблизительно 500 разных белков из более чем 30000 функционирующих в организме. Однако доказано, что многие с трудом поддающиеся современным средствам или вовсе неизлечимые болезни (диабет, склероз, депрессии, ожирение и др.) представляют собой нарушения 10 и более совместно функционирующих метаболических звеньев, и в отношении некоторых из этих звеньев современные лечебные препараты неэффективны. Естественно, что корректировать работу каждого звена, а затем отрегулировать их совместное функционирование с помощью ограниченного набора узкоспециализированных препаратов практически невозможно. С другой стороны, с помощью известных системных регуляторов целого организма (напр., гормонов) можно стимулировать, ингибировать или вызвать системные перестройки в работе сразу огромного количества разных реакций, большинство из которых не относятся к патологии, которую пытаются таким образом излечить. Недостатком подобного подхода является также то, что избыток гормона или регулируемых им метаболитов воспринимается организмом как сигнал к ингибированию синтеза собственного гормона и его продуктов.

Известно, что в нормально функционирующих органах действуют системы специфических для каждого вида клеток регуляторов, которые синхронизируют работу клеток данного органа и осуществляют обмен информацией и взаимодействие с другими органами и системами клеток. Доказательством функционирования в организме органо- и стадиеспецифических регуляторных систем являются известные факты гуморального обмена информацией между клетками, согласно которым клетки некоторых тканей в ответ на внешние воздействия, вынуждающие их к адаптационным перестройкам, способны посылать другим клеткам химические сигналы о своем физиологическом состоянии и команды, необходимые для коррекции функций. По мнению одних авторов, наиболее вероятные переносчики в подобных случаях - белки и низкомолекулярные пептиды, по мнению других - молекулы нуклеиновой природы.

Очевидно, что в настоящее время необходим поиск подобных веществ-регуляторов, которые обеспечивали бы максимальное сохранение, а при необходимости и усиление, например, эндокринных возможностей или иммунных ответов определенных клеток, усиление репаративных процессов в поврежденных клетках, сдвиг обменных процессов к значениям, характерным для нормального здорового организма, то есть усиливали бы продукцию регуляторов в случаях, когда она ослаблена, и снижали бы до нормы, когда она чрезмерна усилена. С помощью современных фармсредств и лечебных препаратов получать подобные эффекты пока не удается.

С целью восстановления нормальных регуляторных процессов на уровне отдельных органов и систем клеток заявителями и некоторыми другими исследователями уже много лет проводятся попытки использовать процедуры трансплантации кусочков ткани и клеток в определенные органы: трансплантации эмбриональной нервной ткани в мозг /Александрова М.А. и др. Трансплантация ткани мозга в биологии и медицине. М.: Наука, 1993, с.173. Витвицкий В.Н. Докт. дисс. (1988)/, ткани островков Лангерганса, надпочечники и другие ткани /Finke Е. et. al. Transplat. Proc. V.23(1), р.772 (1991)/, ткани паращитовидных желез /Smith М.А. et. al. Am. Surg. V.56, №7, р.404 (1990)/.

Наблюдаемые в этих экспериментах процессы нормализации функций органов и стимулирование репараций можно объяснить действием соединений, обладающих свойствами индукторов или дерепрессоров определенных участков генома клеток реципиента. Наши исследования показали, что наиболее вероятными претендентами на роль подобных регуляторов являются низкомолекулярные нуклеопептиды (ННП), главным образом рибонуклеопептиды (РНП), которые содержатся и в ядре, и в цитоплазме клеток и иногда составляют значительную часть (в некоторых случаях до 7-10% ядерной РНК).

Способность различных препаратов, содержащих ДНК, РНК и комплексы НК-белок, активно влиять на функции клеток, клеточных систем организма в целом неоднократно отмечалась разными авторами. Описаны разные способы выделения таких препаратов (патент WO 97/28171/1996) и использования их в косметике и медицине (патент US 04885157, 12/05/1989, патент US 05849517, 12/15/1998, патент WO 02/076490 A1, 2002). Описаны положительные эффекты препаратов ДНК (300-12000 КД), содержащих до 6% ДНК, при терапии ожогов и заживлении ран (патент RU 2099094, 6 А 61 L 13/32, А 61 К 9/70, 06.04.94). Отмечены противовирусные и иммунотропные эффекты препаратов ДНК и ДНК-РНК гибридов мол. массы 300-500 КД, выделенных из животного сырья (патент RU 2108797, 6 А 61 К 35/60, С 07 Н 21, 04 09.11.94, патент RU 9403643, 6 А 61 К 35/60, 29.09.94). Известно также, что добавление препаратов РНК к азидотимидину и интерферону существенно снижает токсичность и усиливает противовирусные эффекты этих веществ (патент RU 2016572, А 61 К 31/70, 37/66, 22.03.88). Декларирована возможность использования рибоксина, основным компонентом которого является РНК, как средства изменения биологического возраста, в частности омолаживания организма и ускорения клеточного обновления (патент RU 93043514, 6 А 61 К 31/00, 33/14, 01.09.93).

Однако, как показали наши исследования и исследования других авторов, важным свойством РНК, входящих в состав описанных препаратов, является ткане-, органоспецифичность и специфичность в зависимости от стадии онтогенеза клеток, из которых эта РНК получена (стадиеспецифичность). Такими свойствами, по-видимому, отчасти обладают препараты Regeneresen, выпускаемые лабораторией им. проф. Dyckerhoff (ФРГ) /Regeneresen nach Prof. Dr. H.Dyckerhoff. Lab. Prof. Dr. H.Dyckerhoff. Koln, 1992/. Эти препараты можно рассматривать как отдаленные аналоги средств, предлагаемых данным патентом. Они представляют собой грубые экстракты РНК из органов сельскохозяйственных животных, к которым добавлено значительное количество РНК-нуклеотидов бактериального происхождения. Инъекционные препараты используют для специфической стимуляции обмена в тканях. Процедура выделения и очистки препарата не включает специальных приемов, позволяющих отделить фракции нуклеопротеидов, которые более активны, чем просто РНК, и более стабильны.

Предшественником защищаемого данным патентом вещества и частным случаем использования органоспецифических регуляторов с целью специфического регулирования конкретной функции является опубликованный ранее заявителями патент на средство, стимулирующее рост волос, и способ его получения /патент RU 2144366, А 61 К 35/36, 03.03.1998/, в котором описан способ выделения ядерных РНК из волосяных луковиц молодых животных. Целевой продукт этого исследования представляет собой набор РНК с константой седиментации до 8 S, основную массу которых составляли молекулы длиной 100-250 нуклеотидов. Препарат содержит примесь белка до 5% и ДНК.

Настоящим патентом защищаются вещества, выделенные из мозга, печени, эндокринных желез и иммуннокомпетентных тканей, с использованием более совершенных методов выделения. Эти вещества также обладают стимулирующим действием в отношении функций органов, из которых они получены, и также способны стимулировать репарирование повреждений клеток этих органов, вызванных как неблагоприятными внешними воздействиями, так и патологическими процессами. Кроме того, показано, что препараты, выделенные из тканей молодых здоровых животных, при введении их животным более зрелого возраста способны сдвигать показатели обменных процессов в сторону значений, характерных для более молодых особей.

Основная задача, решаемая данным изобретением - расширить область применения низкомолекулярных нуклеопептидов, усилить биологические эффекты их действия за счет получения конечных продуктов более высокого, чем описано в прототипе, качества, получить вещества, функционирующие в организме длительное время без потери способности осуществлять регуляцию функций клеток и корректировать метаболизм при разных патологических нарушениях.

Решение поставленной задачи достигается за счет того, что определено природное вещество, которое выделяется из клеток и представляет собой фракцию РНП.

Разработаны технологии выделения достаточных количеств РНП из разных органов и желез для фармакологического и клинического использования.

С использованием полученных веществ разработаны способы стимулирования функций разных органов и нормализации работы органов при патологических нарушениях их функций.

Обсуждаются данные о механизме действия РНП. При введении в организм реципиента РНП они избирательно связываются с клетками, из которых выделены, усиливая или ослабляя работу отдельных генов и заставляя в клетках активно работать те гены, которые избирательно активируются данными РНП. Поскольку известно, что РНП обладают слабой видовой специфичностью, вполне возможно и допустимо использование в клинической практике в качестве фармакологических средств РНП, выделенных из тканей и органов животных.

Существо предложения заявителя состоит в следующем.

Вещество представляет собой набор фракций РНП с молекулярной массой, определяемой с помощью ультрацентрифугирования, от 3 до 6,5 S (единиц Сведберга), что строго соответствует средним параметрам молекулярных масс класса веществ, описанных в литературе как низкомолекулярные ядерные РНП, которые разными авторами получены с использованием разных процедур выделения (Jian Gu and Ram Reddy. Nucleic Acids Research, vol. 25, №l, p. 98, 1997. Мазин А.Л. Молекулярная биология. Том 17, вып.4, С.755, 1983).

Суммарное содержание НК в наших препаратах 90% и более, белка 0,5-5,0 весовых %, присутствуют примеси ДНК и высокомолекулярных РНК до 100 весовых %. Средние значения молекулярных масс веществ, полученных с использованием разных химических препаратов и условий выделения, описанных далее, также как и состав примесей, отличались весьма незначительно, что дает возможность считать, что все использовавшиеся нами процедуры выделения РНП приводят к получению одних и тех же веществ, обладающих одинаковыми физико-химическими свойствами. Сравнение биологической активности препаратов, полученных разными способами, дает возможность предполагать, что активным началом во всех препаратах являются одни и те же вещества.

Биологическую активность РНП определяют, исследуя влияние препаратов РНП при введении их нормальным взрослым животным на процессы включения меченых предшественников ДНК in vitro в клетки и ткани и in vivo.

РНП выделяют из ядер клеток млекопитающих, что предполагает ряд обязательных технологических этапов. При выделении РНП обязательно предварительное отделение и отбрасывание всех РНК цитоплазмы в процессе выделения клеточных ядер с помощью центрифугирования, последующая фенол-хлороформная депротеинизация, при которой в несколько этапов последовательно выделяют разные ядерные РНП, затем их очищают с помощью переосаждения, обрабатывают протеазами, вновь депротеинизируют, удаляют высокомолекулярные фракции, осаждают охлажденным спиртом, растворяют в апирогенной воде, стерилизуют фильтрацией, лиофилизуют и повторно стерилизуют с помощью радиационного облучения.

Способ применения сводится к занимающим определенное время последовательным, многократным или единовременным подкожным или внутримышечным инъекциям ННП в физрастворе или в растворе анастетиков (в частности, в растворе новокаина), либо в виде клизм или накожных аппликаций.

Подробнее сущность способа получения РНП из ядер клеток и их характеристики поясняется следующими примерами.

Способ 1.

Ткань печени крупного рогатого скота отделяют от соединительнотканных оболочек, сосудов, жировых прослоек и отмывают от клеток крови в физиологическом растворе. 100 г обработанной таким образом ткани гомогенизируют при низкой температуре в течение 5 минут в 1000 мл раствора, содержащего 0,01 М Трис-НСl буфера рН=8,5, 0,001 М хлористого кальция, 0,001 М ЭДТА и 0,6% Тритона Х-100. Гомогенат центрифугируют при 800 g в течение 10 минут. Супернатант используют для выделения фракции цитоплазматической РНП, а осадок промывают в том же растворе, но без Тритона Х-100, и суспензируют в 250 мл раствора ацетата натрия, содержащего 0,02 М Трис-НСl буфера рН=5,0, 0,001 М ЭДТА и 0,5% додецилсульфата натрия, затем приливают к нему 350 мл смеси фенол-хлороформ (1:1) и прогревают в течение 10 минут на водяной бане при температуре 40С. После охлаждения систему центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут и отбирают верхнюю фазу, содержащую РНК, к ней снова приливают 350 мл смеси фенол-хлороформ (1:1), прогревают и центрифугируют. К интерфазе добавляют равный объем того же ацетатного буфера и смесь фенол-хлороформ, прогревают при температуре 50С, охлаждают и центрифугируют. Эту процедуру последовательно повторяют при 60, 70 и 80С. Полученные фазы центрифугатов вновь депротеинизируют, удаляя большую часть белков, ДНК и высокомолекулярных РНК, которые удаляются центрифугированием из растворов после добавления к ним NaCl до 1-2 М. К полученным фазам центрифугата приливают 2,5 объема охлажденного этанола, осадок отделяют, снова промывают этанолом, стерилизуют фильтрацией, разливают в ампулы и лиофильно сушат. Ампулы запаивают под вакуумом и хранят в холодильнике.

Таким же способом, с использованием тех же растворов и прогреванием при тех же температурах, выделяют фракции цитоплазматических РНП из супернатанта после первого центрифугирования.

Выход препарата составляет 350-450 мкг из 1 г ткани. Полученный продукт после дополнительной депротеинизации содержит 2-5% белка и более 94,0% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют высокомолекулярные РНК и ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций в области 4-6,5 S.

При выделении препаратов из других тканей использовали более высокие или низкие отношения ткань:буфер, другие концентрации тритона Х-100 и другие диапазоны температур прогревания. Для препаратов, выделенных из разных тканей, максимальная биологическая активность наблюдалась во фракциях, выделенных при разных температурах прогревания.

Способ 2.

Ткань почек крупного рогатого скота обрабатывают по схеме, описанной в Примере 1, и выделяют цитоплазматическую фракцию. К 50 мл материала добавляют 150 мл кипящего 0,01 М Трис-НСl буфера рН=6,8, содержащего 2% додецилсульфата натрия и 2% изоамилового спирта. Смесь гомогенизируют при 8000 об/мин. В течение 1 минуты доводят температуру до 90С и сразу охлаждают до нулевой температуры, сливая ее в охлаждаемую емкость. Полученные таким образом смеси центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g при температуре 0С, надосадочную жидкость собирают и добавляют к ней 2 объема охлажденного этанола. Осадки ресуспендируют в 50 мл 67%-ного раствора этанола, добавляют к суспензии 1 мл 2 М раствора хлористого натрия и снова центрифугируют. Последнюю процедуру повторяют несколько раз. Осадки растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят до рН=7,0 и осветляют раствор центрифугированием в течение 1 часа при 25000 g при нулевой температуре. К надосадочной жидкости прибавляют хлористый натрий, оставляют на 30 минут при температуре около 0С и осаждают высокомолекулярные РНК центрифугированием. Из супернатанта осаждают низкомолекулярные РНК, добавляя к раствору ацетат натрия, а затем 2,5 объема этанола.

Выход субстанции составляет 1,0-1,2 мг из 1 г ткани.

Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса и ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций - в области 4,0-6,5 S, что указывает на идентичность этих препаратов с препаратами, полученными из ядер клеток способом 1.

Способ 3.

На первом этапе ткань мозга обрабатывают по способу 1 для получения фракции клеточных ядер. К аликвоте полученного ядерного материала добавляют 5 объемов раствора, содержащего 6 М гуанидинизотиоцианата, 5 мМ цитрата натрия с рН=7,0, 0,1 М бета-меркаптоэтанола и 0,5% саркозила. В этой среде материал гомогенизируют при 4000 об/мин в течение 2 минут и добавляют по 1 г хлористого цезия на каждые 2,5 мл гомогената. Гомогенат наслаивают на 1,2 М-5,7 М градиент хлористого цезия в 0,1 М ЭДТА при рН=7,5 в центрифужных пробирках. Систему центрифугируют в течение 20 часов при комнатной температуре при 30000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок РНК растворяют в растворе хлористого натрия, доводят рН до 7,0, охлаждают до нулевой температуры и высаживают высокомолекулярные РНК центрифугированием. Низкомолекулярные фракции РНК осаждают из супернатанта 2,5 объемами охлажденного этанола и очищают переосаждением из этанола.

Выход субстанции составляет 100-210 мкг из 1 г ткани.

Полученный продукт содержит 1,2-3,5% белка и 94-96,5% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют высокомолекулярные РНК и ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,58, а основное количество активных фракций - в области 4,0-6,5 S, что указывает на идентичность данных препаратов с препаратами, выделенными другими способами.

Изучение свойств РНП как регуляторов биосинтетических процессов, пролиферации клеток, корректоров структуры и функций разных органов и тканей проводилось по нескольким основным направлениям. На первом этапе с помощью выделенных описанными способами РНП осуществляли регулирование компенсаторно-восстановительных процессов и процессов репарирования повреждений. Опыты этой серии удобнее проводить на тканях и клетках со слабой регенерацией, например на полностью дифференцированных нейронах коры мозга, которые, как правило, не способны делиться и полностью дистрофируются в ответ на гипоксию, травмы и другие воздействия.

Пример 1. Дейстивие РНП на поврежденные нейроны.

Повреждение нейронов взрослого организма в этих опытах достигалось с помощью гипоксии, локальных травм или введения 10% NaOH, что, судя по цитологическим данным, вызывало гибель до 36% нервных клеток коры, гиппокампа и других отделов мозга. Первая серия опыта проводилась на 120 нормальных взрослых крысах-самках “Вистар”. Гипоксию использовали как фактор, повреждающий нейроны, а открытие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) проводили с помощью 10% NaCl, через 35 дней после гипоксии, когда ГЭБ полностью восстанавливался. Для раскрытия ГЭБ крысам в течение 3-х минут инъецировали гипертонический 10% раствор NaCl в дозе 0,7 мл на 100 г массы тела и через 30 мин внутрибрюшинно инъецировали РНП. В опыте использовали РНП, выделенные из ткани головного мозга крупного рогатого скота по методу, описанному выше как Способ 3. Препараты содержали 94-96,5% низкомолекулярных РНК, среднее значение констант седиментации равнялось 3,0-6,5 S. Инъекции NaCl и РНП проводили еще 3 раза с интервалами 1-2 дня. Через 42 и 162 дней после гипоксии крысам инъецировали 3Н-лейцин в дозе 7 мкКи/г массы тела (У.А.2460 ТБк/моль) и через час животных декапитировали. Для биохимического анализа в каждой группе исследовали по 4-5 крыс. Из коры мозга каждой крысы выделяли фракции, обогащенные нейронами, по методу Фрейса /Freysz R.B. J.Neurochem. 1968, v.15, № 4, p.307). Количество белка во фракциях определяли спектрофотометрически на приборе Ultrospec 4056 (LKB, Швеция), а количество лейцина, включенного в нейроны, просчитывали на сцинтилляционном счетчике Магк-1 (США).

Исследовали следующие серии животных: норма (Н) - интактные крысы, норма + NaCl (HNa), норма + NaCl + РНП (HNaP); гипоксия (Г); гипоксия + NaCl (CNa); гипоксия + NaCl + РНП (ГNaP).

Результаты радиометрического изучения фракций, обогащенных нейронами и глией, представлены на фиг.1 и 2. Действие 10% NaCl на перенесшие гипоксию нейроны заключается в дополнительном сильном снижении синтеза белка. Последующее введение РНП сдвигает показатели, характеризующие синтез белка, в сторону значений, характерных для нормального организма. Тенденция к нормализации синтеза белка под влиянием РНП, по-видимому, более характерна для глии.

Наши предварительные исследования показали, что более активны в процессе стимулирования репарирования повреждений нейронов РНП, выделенные из мозга более молодых животных, в следующей серии опытов использовали РНП, выделенные из головного мозга эмбрионов крупного рогатого скота методом, описанным выше (Способ 3). Препараты РНП из мозга эмбрионов содержал 94-96,5% низкомолекулярных РНК, значения констант седиментации определялись как 3,0-6,5 S.

В этом опыте использованы 100 крыс-самок "Вистар", 60 из которых подвергали сеансу гипоксической гипоксии. 21 крыса при этом погибла, а у остальных тестировали цитологически дистрофию до 36% нейронов коры. Контрольным и подвергавшимся гипоксии животным вводили внутримышечно РНП, выделенные из клеток мозга (по 125 мкг в 1 мл физиологического раствора, через 1, 3, 6 и 7 дней после гипоксии). Через 8 дней после гипоксии крысам инъецировали 3Н-лейцин в дозе 7 мкКи/г массы тела (У.А.2460 ТБк/моль) и через час животных декапитировали. Для биохимического анализа в каждой группе исследовали по 4-5 крыс. Из коры мозга каждой крысы выделяли фракции, обогащенные нейронами, по методу Фрейса /Freysz R.B., J.Neurochem. 1968, v.l5, № 4, p.307). Количество белка во фракциях определяли спектрофотометрически на приборе Ultrospec 4056 (LKB, Швеция), а количество лейцина, включенного в нейроны, просчитывали на сцинтилляционном счетчике Магк-1 (США). Полученные значения радиоактивности приведены на фиг.3. В опыте были следующие серии: норма (Н) - интактные крысы; норма + РНП (HP); гипоксия (Г); гипоксия + РНП (ГР). Данные биохимического исследования показали, что действие гипоксии приводит к снижению синтеза белка в нейронах в ранние (8 дней) сроки опыта. Внутримышечная инъекция животным РНП, выделенных из клеток головного мозга эмбрионов, значительно повышает синтез белка в нейронах животных, подвергавшихся гипоксии.

В целом результаты опытов данной серии свидетельствуют о том, что введение выделенных из клеток мозга препаратов РНП животным, подвергавшимся гипоксии и действию гипертонических растворов NaCl, в значительной степени восстанавливают биосинтетические процессы, сдвигая соответствующие показатели в сторону значений, характерных для нормального взрослого организма. Описанные изменения биосинтеза возникают непосредственно после введения РНП и сохраняются длительное время - до 4-х месяцев и более. Особенно значительные эффекты наблюдались при использовании в опытах РНП, выделенных из клеток развивающегося мозга эмбрионов.

Пример 2. Влияние РНП на поврежденные клетки семенников.

Исследовали синтез ДНК и белков в клетках семенников животных, подвергавшихся не смертельным дозам гамма-облучения, и изменение этих процессов под влиянием РНП.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описаной выше (Способ 2). Полученный продукт, независимо от ткани, из которой он выделен, содержал 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций - в области 3,5-6,5 S.

Выбранная модель позволяла достичь значительно большего, чем при старческих изменениях нарушения функции и повреждения клеток.

Опыт проводили следующем образом: 40 взрослых крыс-самцов "Вистар" весом 300-340 г делили на 5 равных групп. Первые 8 крыс оставляли в качестве контроля, а всех остальных подвергали одноразовому гамма-облучению в дозе 700 рад. Облучение осуществляли на установке ГУПОС с источником 137Cs (мощность дозы 4,7 Гр/мин) при 20С. 8 животных из группы облученных составляли 2-ю контрольную группу, а животных трех остальных групп после облучения подвергали лечению препаратами РНП из семенников. Курс лечения включал 7 инъекций РНП по разработанной нами схеме, которая подробнее описана ниже, в опытах, посвященных репарированию последствий гамма-облучения с помощью РНП. Через 30 дней, по установлению стабильного уровня обмена у облученных животных, всех животных декапитировали и из семенников готовили тонкие срезы ткани для исследований в системе in vitro. 200 мг ткани помещали в 2,0 мл раствора Хенкса, в который добавляли до 0,1 М HEPES и либо 20 мкКИ 3Н-тимидин (У.А. 59 Ки/мМ), либо 20 мкКи 3Н-лейцина (У.А. 40 Ки/мМ) и выдерживали 120 мин при 37С при слабом перемешивании встряхиванием. Затем срезы ткани отмывали центрифугированием от не включившихся меченых предшественников и высаживали на нитроцеллюлозные фильтры, добавляя к гомогенатам равный объем охлажденной 10% ТХУ и промывая на фильтрах 5% ТХУ и 80% этанолом. Радиоактивность на фильтрах просчитывали на счетчике LS-6800 BECKMAN, используя сцинтиллятор для гетерогенного счета. Результаты этого опыта представлены в Таблице 1 как интенсивность включения метки всей массой ДНК или белка органа. Это вызвано тем, что через 30 дней после интенсивного гамма-облучения животных снижение синтеза белка и ДНК в клетках семенников происходит на фоне резкого снижения веса органов (от 3,14 до 1,18 г) и появления мягкости и дряблости ткани.

Лечение животных препаратами РНП из семенников крупного рогатого скота увеличивало уровень биосинтеза ДНК и белков в клетках семенников облученных животных. Эти изменения происходят на фоне некоторой нормализации веса органов. Результаты данного опыта свидетельствуют о способности препаратов РНП, выделенных из семенников, нормализовать биосинтетические процессы в тканях семенников, подобно тому, как в описанных ранее опытах (пример 1). Отметим, что нормализация биосинтезов под влиянием РНП достаточно эффективно происходит как в случае повреждений, вызванных гипоксией, так и при повреждениях, вызванных действием радиации.

Следующие опыты выполнены с целью коррекции с помощью ННП функций иммунной системы. Эта серия опытов проведена нами на препаратах РНП из иммуннокомпетентных органов: тимуса, селезенки и костного мозга.

Пример 3. Влияние РНП из иммуннокомпетентных тканей на количество летальных исходов у животных, подвергавшихся смертельным дозам гамма-облучения.

В этой серии опытов использовали РНП, выделенные из тонкого кишечника, костного мозга, тимуса и селезенки КРС по схеме, описанной выше (Способ 1). В пределах ошибки определений все препараты содержали 2-5% белка и более 94% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса, идентифицированы следы ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S. Препараты из каких органов использовали в каждом конкретном случае, отмечено при описании полученных результатов. Эффективность коррекции функций иммунной системы с помощью РНП изучалась нами по снижению количества летальных исходов в результате введения РНП животным, подвергавшимся облучению в больших дозах, и по более частному критерию - изменению биосинтеза ДНК, РНК и белка, а также пролиферации клеток иммунной системы.

Работы 1-го этапа этой серии исследований выполнены на взрослых, весом 150-200 г, крысах Вистар. Облучение животных проводили на установке "ГУПОС" и источником радиации 137 Cs мощностью 4,7 Гр/мин. Следующий чертеж (фиг.4) демонстрирует возможность изменять ход развития патологических синдромов гамма-облучения, действуя с помощью органоспецифических РНП уже непосредственно на разные звенья иммунной системы. Препарат, полученный из тимуса, который положительно влияет на количество Т-лимфоцитов в крови, способен также и существенно увеличивать процент выживших после облучения животных. Добавление к препарату из тимуса препарата РНП из селезенки значительно усиливает терапевтический эффект. Таким образом, этот опыт демонстрирует преимущества использования смесей РНП, выделенных из разных органов, для терапии лучевой болезни. При облучении животных дозами, большими средних летальных, препараты смеси тимус + селезенка и тимус + селезенка + костный мозг демонстрировали более значительные терапевтические эффекты, чем препараты из отдельных органов.

Как известно из литературы, при относительно невысоких дозах гамма-радиации организм страдает нарушениями разных звеньев кроветворной системы (костномозговой синдром), а при более высоких дозах наступают другие нарушения: патология структуры и функций эпителия тонкого кишечника - кишечный синдром. Учитывая это, авторами проведены исследования с целью определения наиболее эффективных схем введения РНП животным при облучении дозами гамма-радиации, при которых часть животных гибнет от костно-мозгового, а часть - от кишечного синдромов. В опыте использовались препараты РНП, выделенные из тонкого кишечника (Тк) и из костного мозга (Км) (фиг.5). В контроле 40% животных погибали к четвертому дню после облучения (кишечный синдром), еще 40% к десятому дню (костномозговой синдром), а 20% оставались живыми через 30 дней после облучения. Введение любого из изучаемых препаратов до облучения стимулировало гибель животных, причем действие РНП из тонкого кишечника усиливало эффекты синдрома тонкого кишечника, а из костного мозга - эффекты, характерные для костно-мозгового синдрома. Эти результаты можно рассматривать как еще одно дополнительное доказательство тканевой специфичности действия защищаемых патентом веществ.

Результаты этого опыта вполне согласуются с представлениями авторов патента о механизмах действия РНП. Поскольку один из механизмов действия РНП, как считают авторы, связан с усилением пролиферации клеток, введение РНП в организм перед его облучением, т.е. использование их в качестве радиопротекторов, должно оказывать скорее отрицательный эффект (активно делящиеся клетки менее стабильны по отношению к внешним воздействиям). Положительный эффект достигается только в случаях введения РНП после облучения, т.е. использования РНП в качестве терапевтических препаратов для лечения синдромов лучевой болезни (схемы II, III и IV на фиг.5). Эффекты сильно зависели от дозы препарата и еще больше - от схемы введения РНП в организм. Трехкратные внутримышечные инъекции РНП из тонкого кишечника (Тк) или костного мозга (Км) приводили к значительному увеличению срока жизни облученных животных и к снижению количества летальных исходов. Отработка схемы введения препаратов дала возможность достичь и более значимых эффектов. Эффективнее было 4-кратное введение ННП из тонкого кишечника в первые 4 дня после облучения (Тк) и 6-кратное введение РНП из костного мозга на I, 2, 3, 6, 8 и 10 дни. Если в таких опытах использовать животных, облученных в дозе ЛД50, то через 30 дней все они останутся живы. Более частое введение препарата (Км), равно как и повышение дозы препарата в 2-3 раза, оказывается неблагоприятным. При снижении дозы в 5-10 раз эффекты значительно снижались.

Для изучения механизмов действия РНП на уровне клеток проведены исследования цитотоксических и цитогенетических эффектов неблагоприятных физических (гамма-облучение) и химических (отравление солями тяжелых металлов) воздействий и модификаций этих эффектов с помощью РНП. Эту группу исследований проводили на взрослых половозрелых самках гибридов 1-го поколения линейных мышей CBAxC57BL, которые являются идеальной и хорошо изученной моделью для подобных исследований.

В цитогенетических опытах, выполненных на препаратах РНП, выделенных из костного мозга, изучали изменение отношения полихроматофильных эритроцитов (ретикулоцитов) к нормальным зрелым эритроцитам Р/Э, которое в норме приблизительно равно I и существенно меняется при разных внешних воздействиях, отражая изменения в кинетике созревания клеток (цитотоксичность). Определяли также изменение под влиянием внешних воздействий количества микроядер (МЯ) в ретикулоцитах. Эти частицы образуются в результате разрывов 2-х нитей ДНК в хромосомах и образования при делении клеток дополнительного ядра меньших размеров, которое остается в эритроците после удаления из него основного ядра. В нормальном организме образуется 1-2 таких частицы на 1000 клеток. При разных неблагоприятных воздействиях это значение может изменяться в десятки раз. Цитологические препараты готовили по методу, предложенному Шмидтом, окрашивали по Гимза и просчитывали количество разных видов клеток на микроскопе с иммерсионным объективом при увеличении х900. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием t-распределения Стьюдента и соответствующих критериев достоверности различий.

В 1-м опыте данной серии исследовали антимутагенное и антитоксическое действие РНП из костного мозга на клетки костного мозга и селезенки животных, облученных в дозе 4 Гр (Таблица 2). На 1000 исследованных ретикулоцитов в контроле регистрировалось 2,4-4,0 клеток с микроядрами, а соотношение Р/Э равнялось 0,7-0,8. После действия гамма-излучения число ретикулоцитов с микроядрами в препаратах из костного мозга увеличилось до 25,5, что свидетельствует о резком росте количества клеток с повреждениями ДНК. Отношение Р/Э под влиянием облучения снизилось до 0,38, что свидетельствует о гибели некоторого количества клеток на ранних стадиях эритропоэза либо об изменении кинетики созревания эритроцитов. При всех исследованных концентрациях инъекции РНП из костного мозга приводили к снижению мутагенного эффекта. Можно сделать вывод, что мы имеем дело с довольно активным терапевтическим препаратом мягкого действия. Незначительное изменение эффекта при значительном росте концентрации препарата характерно в основном для эффективных общеукрепляющих и оздоравливающих средств. Обращает на себя внимание то, что всего несколько мкг РНП достаточно для получения явного антимутагенного эффекта. В случае изучения действия РНП из костного мозга на препараты селезенки антимутагенный эффект явно слабее (изменение количества МЯ меняется от 18,2 до 14,4). Это является явным подтверждением специфичности действия РНП на клетки одноименного органа.

В Таблице 3 представлены результаты влияния отравления животных ионами шестивалентного хрома (Cr VI) и сочетанного действия гамма облучения и Сr VI на клетки костного мозга, коррекции с помощью РНП цитотоксического и цитогенетического эффектов суммарного действия на организм этих двух неблагоприятных факторов. Сочетание действия радиации и инъекций животным раствора К2Сr2O7 дает некоторое суммирование цитогенетических эффектов. Наложение на эти воздействия компенсирующего фактора РНП вызвало существенное снижение общего мутагенного эффекта (от 22,6 до 10,8, т.е. более чем в 2 раза).

Общий вывод из опытов данного раздела - это то, что РНП из исследованных нами иммуннокомпетентных тканей обладают четко выраженной способностью восстанавливать функции поврежденных клеток той же ткани, слабо влияя на другие, т.е. не демонстрируют выраженных побочных эффектов. Действие РНП на повреждения, вызванные гамма-облучением или солями тяжелых металлов, обнаруживает лишь незначительную специфику в протекании репараций. Эти результаты дают возможность характеризовать РНП как довольно активные вещества биологического происхождения, которые можно использовать и для избирательной терапии отдельных видов клеток, систем клеток и органов, и избирательного восстановления наиболее поврежденных функций.

Следующая серия опытов проведена с целью доказать возможность регулирования с помощью РНП уровня гормонов и влияния с помощью препаратов РНП из органов, продуцирующих гормоны, на синтез соответствующих гормонов и обмен веществ всего организма.

Пример 4. Влияние РНП из щитовидной железы крупного рогатого скота на интенсивность общего обмена и на синтез тироксина и трийодтиронина.

В опыте использовали РНП, выделенные из щитовидной железы КРС, по схеме, описанной выше (Способ 1). Препараты содержали 2-5% белка и более 94% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса, идентифицированы следы ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S.

В данном опыте препараты щитовидной железы вводили старым крысам-самкам, у которых наблюдались нарушения синтеза тироксина (Т4) или трийодтиронина (Т3) и значительный избыток веса.

36 крыс, весом от 400 до 475 г, делили на 6 равных групп (средний вес животных в каждой группе приблизительно равен 440 г) и всем животным, кроме контрольной и 5-й групп, вводили с помощью инъекций через день, в течение месяца РНП щитовидной железы в количествах: 0,1 мг (1-я группа), 0,3 мг (2-я группа), 0,6 мг (3-я группа), 1,2 мг (4-я группа), животным 5-й группы РНП вводили 3 раза по 2,5 мг, а животным контрольной группы вводили физраствор по принятой схеме. Общая картина изменения веса животных в контроле и при введении им РНП представлена на фиг.6. Единица масштаба на абсциссе соответствует 10 г. За время опыта контрольные животные, находившиеся, как и все остальные, на обычном виварном рационе, увеличивали вес приблизительно на 2% (от 440 до 450 г, контрольная кривая фиг.6).

Инъецирование животным РНП в дозах 0,3 мг приводило к снижению веса от 440 до 420-425 г. Снижение массы становилось заметным приблизительно на 10-й день эксперимента. Максимальное снижение массы наблюдается на 30-й день, приблизительно на 5%. Кривая роста массы после прекращения инъекций РНП при дозе 0,3 мг приблизительно параллельна контролю, и, таким образом, даже на 100-й день эксперимента масса животных остается более низкой, чем масса животных в группе контроля.

Животные, которым вводили более высокие, но совершенно безвредные для организма животных дозы РНП (соответственно 0,6 и 1,2 мг), демонстрировали гораздо более значительное снижение массы тела (от 440 г до 390-405 г, то есть на 10 и более процентов). Понижение массы становится заметным уже через 5 дней после начала инъекций и продолжается еще несколько дней после прекращения инъекций. Наблюдается четкая зависимость эффекта понижения массы животных от введенной дозы РНП из щитовидной железы. С увеличением дозы эффект значительно возрастает. Наклон кривой роста массы (прирост) после прекращения инъекций РНП отстает от роста массы животных в контроле. К концу наблюдений (100-й день) инъецированные животные остаются с гораздо меньшей массой, чем контрольные. Некоторые из них не набирают веса, который они имели в начале опыта, до конца жизни, то есть еще в течение нескольких месяцев.

Поскольку очевидно, что для перестройки работы генома с помощью РНП из щитовидной железы нет необходимости длительного, многократного инъецирования РНП, были проведены опыты с кратковременным импульсным использованием препарата. Верхняя кривая на фиг.6 демонстрирует результат всего 3-кратного введения 2,5 мг РНП животным в течение 1 суток с интервалами 8 часов.

3-кратная процедура инъецирования животным РНП приводит к значительному (до 5-7%) понижению массы с последействием до 2-3 месяцев. Понижение массы продолжается в некоторых случаях до 20 дней после прекращения инъекций. Возможно, это явление, которое не удавалось наблюдать так четко при других схемах введения РНП, можно объяснить более значительным процентом клеток щитовидной железы, на которые воздействовал РНП, учитывая их суточный ритм митозов. После прекращения инъекций масса животных снижается еще приблизительно 15 дней. Затем масса постепенно увеличивается, но скорость (динамика) ее увеличения остается меньшей, чем скорость роста массы животных в контроле, и в момент окончания эксперимента масса животных в опыте оставалась значительно пониженной по сравнению с контролем.

Можно сделать следующие общие выводы:

1) прослеживается четкая тенденция снижения веса животных в опыте при всех дозах вводимого препарата;

2) уровень снижения веса строго зависел от дозы препарата, и наибольший эффект наблюдался при максимальной дозе (средний вес животных снижался от 440 до 390 г);

3) всего 3-кратное введение препарата в дозах, при которых не наблюдалось никаких побочных эффектов или неблагоприятных реакций со стороны организма, вызывает значительное снижение веса животных.

Вес животных при введении им достаточно эффективных доз препарата (0,6 мг и 1,2 мг) оставался сниженным более трех месяцев и после окончания инъекций изменялся слабее, чем у контрольных животных, которые не получали РНП. Под влиянием РНП вес животных снизился в среднем от 440 до 390 г, а через 3 месяца после прекращения введения препарата он изменился от 390 до 410 г. Отметим, что 3 месяца для крыс - это значительная часть жизни. Во всех случаях снижение избыточного веса сопровождалось усилением основного обмена. Животные снижали вес, находясь на том же, что и контрольные, виварном рационе, за счет увеличения подвижности и общей активности. При этом старые особи приобретали гладкую белую шерсть и выглядели более здоровыми.

По окончании опыта у всех животных из хвостовой вены брали по 1 мл крови и определяли уровень Т3 и Т4 с помощью радиоиммунотестов. Количество трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) в крови животных определяли на следующий день после прекращения инъекций РНП из щитовидной железы. Результаты определения уровня гормонов в крови контрольной и всех опытных групп приведены справа от кривых на фиг.6.

Введение уже минимальных доз РНП (0,1-0,3 мг) достоверно увеличивает количество Т3 по сравнению с контролем. При дальнейшем увеличении инъецируемой концентрации РНП количество Т3 росло, достигая максимума при концентрации РНП, равной 0,6 мг. Дальнейшее увеличение инъецируемой концентрации РНП не приводит к увеличению количества Т3, несмотря на то что понижение массы животных продолжается. Подобное, но еще более ярко выраженное явление определено для Т4. Следует отметить, что отсутствие стимулирования биосинтеза гормонов и, возможно, ингибирование дальнейшего роста количества гормонов избытком регулятора, вообще, характерно для регуляторов, у которых для проявления положительного эффекта возникает необходимость связывания с определенными, ограниченными в количестве центрами на поверхности клетки или внутриклеточных структур.

Действие ОР из щитовидной железы проверено нами также на нескольких добровольцах-больных с нарушениями обмена липидов и избыточным весом.

Пример 5. Больной К. Возраст 58 лет, рост 185 см, вес 104 кг, А/Д 110/180. Диагноз - гипертоническая болезнь, избыточный вес, кардиосклероз. На протяжении 3-х дней больному вводили внутримышечно по 20 мг РНП из щитовидной железы млекопитающего в 0,5% растворе новокаина. После завершения курса инъекций ежедневно в течение последующих 15 дней проводили обследование мест инъекций, контрольное взвешивание и измерение кровяного давления. Никаких реакций со стороны кожных покровов на местах инъекций не обнаружено. На 5-й день (через сутки после последней инъекции) масса больного понизилась до 91 кг, А/Д понизилось до значений 90/140. На протяжении последующих 15 суток масса и давление крови больного изменялись незначительно в пределах обычных суточных норм.

Таким образом, в результате пробной проверки эффективности использования РНП из щитовидной железы млекопитающих на больных с избыточной массой был показан стойкий положительный эффект понижения массы тела и нормализация биосинтеза гормонов (ТЗ и Т4) в крови после 3-5-кратных внутримышечных инъекций. Приведенные исследования указывают на принципиальную возможность использования РНП из щитовидной железы в клинической практике и на перспективность дальнейших исследований с целью разработки препаратов, способных корректировать уровень обмена, гормонального статуса, снижения и нормализации массы организма млекопитающих и человека.

Следующие опыты проведены на препаратах, выделенных из семенников.

Пример 6. Влияние РНП из семенников молодых быков на деление клеток сперматогенного эпителия (репликативный синтез ДНК) крыс.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описаной выше (Способ 2). Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций в области 3,5-6,5 S.

Опыт проводили на крысах-самцах "Вистар" весом 250-270 г. Всех животных делили на 3 группы: 1 - контроль, вместо РНП животным вводили физраствор, 2 - животным вводили РНП из мозга быка, 3 - животным вводили РНП из семенников быка.

В 1-й и 2-й дни опыта животным внутрибрюшинно инъецировали 3 раза с интервалами 8 часов (учитывая суточный ритм митозов) либо 700 мкг РНП из тестикул в 1 мл физраствора (3-я группа), либо 700 мкг РНП из мозга в 1 мл физраствора (2-я группа), либо 1 мл физрствора (контроль).

Через 8 часов после последнего введения ННП начинали вводить 14 С-тимидин (по 64 мкКи на 1 кг веса, уд.акт. 69 Ки/мМ) в 1 мл физраствора 3 раза с интервалами 8 часов. Через 8 часов после введения тимидина животных всех трех групп декапитировали, выделяли тестикулы, фиксировали их в 10% формалине и отбирали из них навески паренхимы, приблизительно по 20 мг, в отдельные пробирки, добавляли к ним по 200 мкл солюбилизера, выдерживали в термостате при 60°С до полного растворения ткани, добавляли по 5 мл жидкостного толуольного сцинтиллятора (4 г ППО + 50 мг ППОП + 1 л толуола) и просчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике, определяя значения dpм. Средние величины, полученные из 3-х определений на отдельных животных, приведены на фиг.7. Подобная же процедура трехкратного с 8-часовыми интервалами введения 14С-Т проводилась и через 2, 3, 6, 9, 13 и 20 дней после введения РНП. Результаты всех этих определений представлены в виде отдельных точек.

Введение крысам РНП из семенников на 1-й и 2-й день повышают включение тимидина в клетки семенников реципиентов. Это так называемое "неспецифическое" повышение репликации ДНК, которого можно достичь введением любых других нуклеиновых кислот, их предшественников и даже набором нуклеотидов. Начиная с 3-х по 6-е сутки действие РНП на синтез ДНК выравнивается с помощью клеточных регуляторных механизмов, а в последующие дни до 20-го наблюдается рост и установление стойкого специфического стимулирования синтеза ДНК в клетках семенников под влиянием введения РНП (в контрольных опытах с оксимочевиной показано, что синтез ДНК в данном случае связан с репликацией клеток, а не с репарированием повреждений). Колебания уровня синтеза ДНК во времени - обычное явление при действии регуляторного механизма с обратной связью. Препарат РНП из мозга в этом опыте ведет себя совершенно иначе (фиг.8). Для него характерно только неспецифическое стимулирование синтеза ДНК в семенниках до 6 дня. Затем уровень пролиферации клеток приходит к норме и остается таковым и далее.

Пример 7. Изучение действия РНП на генетический эффект гамма-облучения у мышей и на генетические повреждения в половых клетках.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описанной выше (Способ 2). Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций - в области 3,5-6,5 S. Опыт пироводили на мышах, самцах и самках, гибридах (CBAхC57BL)F1, самцах гибридах (BALBхC57) и мышах линии BALB, достигших к началу опыта не менее 2-месячного возраста. Облучение проводили на гамма-установке ГУПОС 137Cs, мощность дозы 6,12 Гр/мин. РНП вводили животным в физрастворе по 0,2 мл в дозах 4, 10 и 20 мг/кг веса однократно или многократно как до, так и после облучения. Оценивали величину эмбриональной смертности до и после имплантации в потомстве облученных самцов и частоту Аномальных Головок Спермиев (АГС). Кроме генетических показателей, изучали также плодовитость самцов-мышей по проценту эффективных скрещиваний и изменение массы семенников, отражающее цитологическое действие радиации.

Для изучения величины эмбриональной смертности к самцам мышей после воздействия подсаживали на недельный срок по 3 интактных самки, через неделю самок меняли. В зависимости от варианта опыта проводили 3-4 последовательные подсадки. В течение этого времени реализовались при оплодотворении зрелые спермии, испытавшие воздействие на разных стадиях сперматогенеза. Через 18 дней после подсадки проводили вскрытие умерщвленных беременных самок и подсчитывали у них число желтых тел в яичниках, мест имплантации и живых эмбрионов в рогах матки. По соотношению этих показателей определяли смертность эмбрионов до и после имплантации.

Частоту появления АГС анализировали на воздушно-сухих мазках, приготовленных из содержимого эпидидимусов облученных животных. От каждого самца подсчитывали не менее 300 спермиев. В сроки забоев самцов, т.е. через 35 и 45 дней после окончания воздействия, определяли массу тела и массу семенников.

7а. Однократное облучение.

Эмбриональная смертность.

В Таблице 4 представлены данные по влиянию ежедневного введения РНП в течение пяти дней облученным гибридам (CBAхC57BL) F1 самцам мышей на процент эффективных скрещиваний и эмбриональной смертности. Обнаруживается четкая тенденция снижения под влиянием ННП величины индуцированной эмбриональной смертности. По показателю эффективных скрещиваний наблюдалось повышение процента эффективных скрещиваний в течение всех трех изученных подсадок. При суммировании этих данных по всем подсадкам различия оказались статистически достоверными.

Следует отметить, что РНП повышали плодовитость самцов и у необлученных животных, особенно если возраст самцов превышал 4 месяца.

Частота аномальных головок спермиев и масса семенников. Из данных, приведенных в Таблице 5, видно, что при введении РНП в дозах как 4, так и 10 мг/кг самцам мышей-гибридов, подвергнутых однократному облучению в дозе 3 Гр, наблюдалась тенденция к снижению частоты АГС, индуцированных облучением. В Таблице 6 приведены данные по влиянию ежедневного введения РНП (10 мг/кг) в течение пяти дней после облучения в дозе 3 Гр мышей линии BALB на частоту АГС и массу семенников. Линейные мыши являются более радиочувствительными, частота индуцированных АГС у них выше, а степень снижения массы семенников сильнее, чем у гибридных животных. Анализ этих показателей выявил, что на 30 и 45 дни после облучения масса семенников была несколько выше в вариантах с введением ННП. В оба срока анализа, частота АГС была ниже в случае введения препарата. При суммировании данных результатов анализа на 30 и 45 дни после облучения степень снижения частоты АГС в вариантах с РНП была статистически достоверна.

7б. Фракционированное облучение.

Эмбриональная смертность.

В Таблице 7 представлены результаты анализа эмбриональной смертности в потомстве самцов, облученных в суммарной дозе 3 Гр, фракционированно по 0,6 Гр в течение 5 дней, которым вводили после облучения минимальную дозу РНП 4 мг/кг в течение 10 дней. В течение 4-6 недель после облучения плодовитость самцов в контроле значительно снижалась вплоть до полной стерильности. Анализ результатов уже по 3-й неделе спаривания выявил положительное влияние РНП на показатель смертности эмбрионов до периода имплантации. Подводя итоги изучения генетического действия РНП, следует отметить, что во всех проводившихся опытах наблюдалась тенденция к терапевтическому эффекту РНП. Обнаружено статистически достоверное снижение степени радиационного повреждения по проценту эффективных скрещиваний при введении ННП (10 мг/кг) пятикратно, после облучения в дозе 3 Гр серых гибридов СВАхС57ВХ F1. Кроме того, обнаружено снижение частоты АГС у мышей линии BALB в аналогичном варианте опыта. Было проведено 3 аналогичных варианта опыта (3 Гр + 10 мг/кг РНП 5) на мышах трех разных генотипов (серые гибриды, белые гибриды и линейные мыши BALB). Терапевтический эффект в наибольшей степени проявлялся у мышей BALB. Положительный эффект у гибридных мышей был обнаружен только в опытах на старых животных. Это позволяет предположить, что благоприятное действие ННП связано со стимуляцией восстановительной системы клеток, которая у линейных и старых мышей может быть ослабленной. В целом, благоприятный эффект наиболее выражен при относительно высокой дозе радиации и при введении ННП после облучения.

Пример 8. Влияние РНП из мозгового вещества и РНП из коры надпочечников на тяжесть пищевой анафилаксии и на величины анафилактического индекса.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описанной выше (Способ 2). Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций - в области 3,5-6,5 S. Эксперименты проводили на морских свинках-самцах с исходной массой 250-300 г. Сенсибилизацию куриным овальбумином проводили по методу, разработанному в Институте питания АМН. Животным трехкратно, ежедневно перорально вводили раствор овальбумина в дозе 100 мг на животное. Введение разрешающей дозы овальбумина проводили на 14-й день. Тяжесть анафилактического шока оценивали по уровню летальности, количеству судорожных проявлений и по величине анафилактического индекса. В первой серии эксперимента использовали препарат ННП из надпочечников крупного рогатого скота, из целого органа. Препарат вводили животным в дозе 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и 10 мг/кг ежедневно в течение трех дней перед введением разрешающей дозы. Во второй серии эксперимента использовали препараты ННП, выделенные из коркового сдоя надпочечников в дозе 0,1 мг/кг и 1 мг/кг, мозгового слоя надпочечников в дозе 1 мг/кг и из головного мозга в дозе 1 мг/кг. Препарат ННП из головного мозга был взят в качестве контроля для выявления специфичности полученных эффектов.

Результаты экспериментов представлены в Таблице 8. Показано, что введение препарата РНП из целых надпочечников в дозе 1 мг/кг снижает тяжесть анафилактического шока по всем изученным показателям, тогда как препарат из целых надпочечников в дозе 10 мг/кг увеличивал число судорожных проявлений. При изучении препаратов ННП выделенных отдельно из коркового и мозгового вещества выявлено, что препарат из мозгового слоя при использовании его в дозе 1 мг/кг достоверно усиливает тяжесть пищевой анафилаксии, тогда как препараты ННП из коры надпочечника и из мозга не оказывали подобного действия. По-видимому, после дальнейших уточнений в отношении применяемых доз и способов введения в организм, изученные ННП могут быть рекомендованы как вещества, способные регулировать интенсивность развития некоторых аллергических реакций организма.

Общий вывод из всех представленных в данном разделе экспериментов заключается в том, что препараты РНП, выделенные из разных тканей и органов, ответственных за синтез гормонов, способны специфически нормализовать функции соответствующих органов и тканей при нарушениях, вызванных патологическими процессами и старением, и усиливать процессы репарирования повреждений соответствующих клеток и тканей, вызванные разными вредными воздействиями.

Следующие опыты проведены с целью определения влияния РНП на биологический возраст органов и тканей, обнаружения “эффектов омолаживания” действием препаратов из тканей физиологически молодых животных.

В описанных выше опытах с помощью выделенных нами биорегуляторов РНП получен стойкий эффект специфического стимулирования пролиферации клеток. Хорошо это или плохо для организма? Насколько вновь появившиеся клетки отличны от предшествующих, как они будут функционировать в организме, "моложе" или "старее" они своих предшественников по физико-химическим и функциональным показателям?

Для ответа на этот вопрос кратко рассмотрим один из опытов, проведенных на печени крыс разных возрастов и на печени обычных взрослых животных, подвергавшихся частичной резекции печени, в котором изучалась кинетика включения и последующего выведения 3Н-тимидина из органов животных, а также среднее время полужизни клеток. Как следует из результатов, приведенных на фиг.9, эти показатели у животных разных возрастных групп существенно различны. После неблагоприятных воздействий (в данном случае гепатэктомии), через месяц после операции, когда компенсаторно-восстановительные процессы в основном закончены, орган существенно постарел (по нашим подсчетам, действие операции в данном случае равносильно 3-4 месяцам старения, что для крыс составляет значительную часть общего продолжения жизни).

Учитывая результаты этого опыта, построена схема, которая, по мнению авторов, отражает современные представления о клеточном делении и его отношении к старению органов и их клеток (фиг.10). Обычная клетка, длительность цикла которой от деления до деления = 2 условным единицам времени между делениями (время жизни), в течение этого времени делится на две. Как признается большинством авторов, длительность цикла у дочерних клеток несколько различна. Для простоты мы берем коэффициент асимметрии = 2. Таким образом, в результате первого деления получаем клетки с временем жизни в 2 раза большим (4 условных единиц) и в 2 раза меньшим (1 условных единиц). Клетка с длительностью цикла = 1 погибает и лизируется, а клетка с временем жизни = 4 в течение этого времени делится на две, со временем 8 и 2 и т.д.

Среднее время жизни клеток в органе (Тср.) по прошествии времени, равного 2-м клеточным циклам, равно (4+1)/2=2,5, по прошествии еще 4-х циклов (8+2)/2=5 - постоянно увеличивается с каждым новым делением.

Как известно, начиная с определенной стадии развития (на нашей схеме после 8 полных делений) каждая клетка переходит в "состояние покоя" и не делится, но выполняет свои функции. С возрастом количество клеток, перешедших в это состояние, увеличивается, а полностью дифференцированные клетки, длительное время не подвергающиеся делению, имеют характеристики, сходные с таковыми покоящихся клеток. Через некоторое время количество таких клеток достигает половины и останавливается на этом уровне, что и наблюдается в органах, объем которых остается постоянным.

Кратковременное интенсивное стимулирование пролиферации всех или части клеток нашей модели на любой стадии, например частичная резекция печени (нижняя часть схемы), может вызвать только усиление роста значений Тср по сравнению с нормально развивающимся органом (на стадии 12 после резекции Тср=6,6 вместо 6,0, а на стадии 14 - 7,6 вместо 6,6). Если на каком-то этапе в организм ввести меченые соединения, например тимидин, то включение его в клетки данного органа будет зависеть от количества делящихся клеток на данной стадии развития, а выведение его - от количества лизирующихся клеток. Понятно, что эти же параметры определяют и Тср на данном этапе развития.

С помощью подобных экспериментов мы можем количественно определять Тср, т.е. характеризовать биологический возраст данного органа или ткани (такое понятие используется в современной герантологии). Этот возраст вовсе не обязательно соответствует паспортному, зависит от условий развития организма и может значительно изменяться при разных внешних воздействиях. Таким образом, пользуясь данной схемой, можно попытаться рассчитать, насколько полезно или вредно данное воздействие, в том числе и действие РНП или других факторов или условий, на клеточную пролиферацию.

Пример 9. Определение времени полужизни клеток (Т/2) и изменения этого показателя у старых животных при введении им органоспецифических РНП.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описанной выше (Способ 2). Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5S, а основное количество активных фракций - в области 3,5-6,5 S.

Так же, как и в предыдущем опыте, животным (24 старым самцам "Вистар", возрастом 2 и более года, весом 420-470 г) вводили РНП из тестикул крупного рогатого скота, 3 раза по 700 мкг с интервалами 8 часов. Контрольной группе (тоже 24 крысы) вводили физраствор. Через 20 суток, по достижении стабильного стимулирования пролиферации клеток семенников, животным и контрольной, и опытной групп вводили по 600 мкКи 3Н-тимидина (У.А. 59 Ки/мМ) в три приема с интервалами 8 часов. Забой животных проводили через сутки, 20 дней, 44 дня и 56 дней после импульсной метки тимидином.

Кривая выведения метки через 1, 20, 44 и 56 дней после импульсного мечения предварительно обработанных РНП животных и соответствующая контрольная кривая представлены на фиг.10А. Как и предполагалось, РНП существенно стимулировал общий уровень пролиферации клеток (интенсивность включения 3Н-Т) на 20-е сутки после введения РНП, о чем свидетельствует почти двукратный рост интенсивности включения метки в 1-й день. Кинетика выведения метки из тканей, обработанных и необработанных РНП, совершенно разная. У животных, которым вводили РНП, существенно выше скорость выведения метки и снижено среднее время полужизни клеток с 21 до 16 суток (исследовали суммарные препараты, включающие все клетки органа).

Таким образом, результаты данного опыта вполне поддаются расчетам, подобным описанным выше, для определения степени "старения" или "омолаживания", получаемого с помощью данного воздействия. Показано, что в данном случае можно говорить об "омоложении" клеток семенников старых животных и даже определять степень "омолаживания" количественно. Результаты этих опытов также позволяют говорить об увеличении продуктивности клеток семенников под влиянием РНП приблизительно на 30%. В параллельном исследовании на тех же животных нами обнаружено стимулирование подвижности сперматозоидов под влиянием РНП. Этот показатель у контрольных животных составлял 46%, а у животных, получавших РНП - 52%.

Пример 10. Определение влияния РНП, выделенных из кожи, на интенсивность репродуктивного синтеза ДНК, деление клеток и на синтез наиболее важных в функциональном отношении белков разных фракций коллагена и эластина в дерме, а также керагинов в эпидермисе животных разного возраста.

В опыте использовали РНП, выделенные из тестикул КРС по схеме, описанной выше (Способ 2). Полученный продукт содержит 2,9-4,2% белка и 90-92% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса. Идентифицируются следы ДНК. Среднее значение константы седиментации 3,5-6,5 S. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S, а основное количество активных фракций - в области 3,5-6,5 S.

Первоначально в этом опыте предпринята попытка определить интенсивность синтеза ДНК в клетках суммарной ткани кожи животных (эпидермис и дерма) разных возрастных групп и изучить действие РНП на синтез ДНК в клетках нормальных животных (среднего и старшего возрастов). Животные опытной группы отличались тем, что им ежедневно в течение 10 дней до начала опыта на очищенные от волос участки кожи наносили ННП в составе геля (10 мг РНП растворяли в 1 мл 0,5% Геля Карбопола 940 рН 8,0. Доза геля 200 мг на 4 см2 кожи), в то время как животные контрольной группы получали гель без РНП.

На фиг.11 (Контроль) демонстрируется включение в ДНК 3Н - тимидина на единицу массы кожи животных 3-х изучаемых возрастных групп (2, 10 и 20 месяцев). Можно отметить характерное снижение синтеза ДНК с возрастом животных. Эти результаты вполне согласуются с большинством исследований возрастных параметров синтеза ДНК в тканях кожи и клетках отдельных ее слоев. Воздействие на кожу животных ННП в виде аппликаций (фиг.11, Опыт) вызывает достоверную активную стимуляцию синтеза ДНК, при этом происходит сдвиг параметров биосинтеза к значениям, характерным для животных более молодого возраста.

Учитывая, что изменение интенсивности синтеза ДНК не всегда однозначно свидетельствуют об "омолаживании" клеток данной ткани, для более корректного изучения эффекта "омолаживания", по-видимому, необходимо использовать дополнительно показатели количественных изменений содержания и синтеза наиболее важных для нормальной структуры и функционирования белков данной ткани.

С этой целью животным контрольной группы инъецировали 3Н-аминокислоты и из дермы и выделяли отдельные фракции коллагена и эластина. Все эти процедуры затем дублировали в опытах в системе in vitro на препаратах кожи из тех же животных, изучая включение 14С-аминокислот. Животные опытной группы отличались тем, что им, так же как и в предыдущем опыте, ежедневно в течение 10 дней до начала опыта на очищенные от волос участки кожи наносили РНП в составе геля (10 мг РНП растворяли в 1 мл 0,5% Геля Карбопола 940 рН 8,0. Доза геля 200 мг на 4 см2 кожи), в то время как животные контрольной группы получали гель без РНП. Результаты изучения включения метки на единицу массы фракций коллагена: К 1 (солерастворимая фракция), К 2 (фракция, растворимая в кислом ацетатном буфере), К 3 (нерастворимый коллаген) и эластина представлены в Таблице 9, опыт in vivo (включение 3Н-аминокислот) и in vitro (включение 14С-аминокислот)\. Обращает на себя внимание наличие определенных изменений биосинтеза с возрастом во всех фракциях, кроме К2, которая не во всех случаях демонстрирует четкие достоверные изменения. Надо заметить, что и в литературе встречаются исследования отдельных авторов, в которых показано, что данная фракция коллагена неодинаково меняется с возрастом и для нее характерен рост биосинтеза на некоторых определенных этапах развития. Действие препаратов РНП существенно меняют процессы включения меченых аминокислот в эластин и коллагены. Наложение полученных в этих опытах значений на шкалу изменений исследуемых белков в онтогенезе дает возможность определить возраст участка ткани обработанного РНП (так называемый "биологический" возраст данной ткани после опыта) и отличие его от возраста "паспортного" - контрольного. Результаты подобных сравнительных построений показывают, что после воздействия РНП в виде аппликаций достоверно сдвигается уровень синтеза всех изученных белков в сторону "омолаживания", так же как это имело место в опытах по определению интенсивности синтеза ДНК. Эта закономерность при изучении биосинтеза белков проявляется вполне четко, несмотря на то что в данном случае, в отличие от синтеза ДНК, нет оснований утверждать, что у каждого из изученных белков (фракции К1, К2, К3 и Э)с возрастом равномерно меняет интенсивность синтеза.

Данные по определению массы отдельных фракций, экстрагированных из препарата дермы площадью 1 см2 в контроле и после воздействия РНП, представлены в Таблице 10. Несмотря на то что степень экстрагируемости разных белков из дермы может как увеличиваться, так и снижаться с возрастом животных и в данном случае вполне возможна процедура определения "биологического" возраста участка дермы, обработанного РНП, исходя из полученных в опыте характеристик белковых фракций (коллагена и эластина). Отметим, что РНП более активно воздействует на дерму в случае старой возрастной группы животных.

Подобные же исследования проведены нами и на отдельных фракциях кератина из эпидермиса, Таблица 11. В данном случае можно заключить, что после воздействия РНП также наблюдается тенденция к сдвигу изучаемых параметров в сторону значений, характерных для более молодых животных.

Таким образом, результаты этой серии опытов свидетельствуют о том, что во всех случаях РНП однозначно активируют биосинтез ДНК в исследованных фракциях коллагена, эластина, а также кератинов в сторону показателей, которые характерны для более молодых животных, что можно интерпретировать как "омолаживающее" влияние на состояние кожи, слоя дермы и эпидермиса и отдельных белковых фракций.

Следующий раздел исследований посвящен изучению противовирусных эффектов препаратов РНП.

В этой серии опытов использовали РНП, выделенные из печени, щитовидной железы, кожи, мозга, тестикул, тимуса и лимфоузлов КРС по схеме, описанной выше (Способ 1). В пределах ошибки определений все препараты содержали 2-5% белка и более 94% низкомолекулярных РНК. Основную часть примесей составляют РНК высокого молекулярного веса, идентифицированы следы ДНК. Константы седиментации отдельных фракций находились в пределах значений от 3,0 до 6,5 S. Какие препараты использовали в каждом конкретном случае, отмечено при описании полученных результатов.

Противовирусное действие препаратов РНП проверяли в клинических условиях и амбулаторно на волонтерах, больных инфецированных вирусами "герпес" гепатита А, В, и С, а также папилломовирусами.

Пример 11. Оценка эффективности РНП у больных герпетической инфекцией, вызванной Вирусом Простого Герпеса (ВПГ).

В клинических испытаниях участвовало 176 больных разных возрастных групп, в том числе 12 человек до 20 лет, 69 человек от 21 до 30 лет, 32 человека от 31 до 40 лет, 27 человек от 41 до 50 лет и 36 - старше 51 года. 129 женщин и 47 мужчин. Герпетические высыпания у больных локализовались в области:

- красной каймы губ и окружающей гладкой кожи - у 47 пациентов,

- слизистой носовой полости - у 14 пациентов,

- гладкой кожи на различных участках тела - у 8 пациентов,

- переходного эпителия ануса и окружающей гладкой кожи - у 23 пациентов,

- паха - у 31,

- слизистой половых органов - у 53 пациентов.

Основным требованием для отбора было хроническое рецидивирующее течение, с частотой рецидивов не менее 1 раза в 6 месяцев.

На момент обращения из 176 больных ВПГ у 41 отмечались периоды, когда частота рецидивов достигала 1-2 раза в месяц, у 79 - 1 и 2 раза в 2-4 месяца и у 56 - 1-2 раза в 4-6 месяцев; 86 пациентов по поводу рецидивов обычно принимали Зовиракс (Ацикловир) и отмечали положительный эффект в разрешении герпетической инфекции, и 1 больная с генитальным герпесом указывала на отсутствие какой-либо положительной динамики при приеме Зовиракса как с целью предупреждения рецидивов, так и с целью купирования острого состояния.

У всех больных заболевания носило хронический, рецидивирующий характер в течение нескольких лет.

Для лечения инфекции, вызванной ВПГ, применялись РНП, выделенные из различных органов и тканей. Препарат наносился накожно, в дозе 5-10 мг, в течение 1-2 дней.

У 68 больных ВПГ использовали ННП из щитовидной железы, у 41 больного - из коры мозга, у 38 больных - из кожи (эпидермис и дерма), у 21 больного - из тимуса, и у 8 - из семенников.

При нанесении на зоны поражения ННП из щитовидной железы, мозга и кожи отмечалась сходная картина динамики разрешения кожного процесса. Если препарат наносился в начальный период развития заболевания, т.е. в момент появления парастезий и появления легкой гиперемии кожи в фиксированных зонах появления высыпаний, то у 30% больных в течение суток наблюдалось полное разрешение кожного процесса, а у 70% на фоне исчезновения парастезий отмечалось появление мельчайших эрозий, при этом стадия образования везикул визуально не определялась. В течение 1-2 суток эрозии эпителизировались, и кожный процесс разрешался за 6-7 суток. Если РНП наносили на очаги поражения в период развившейся клинической картины заболевания, т.е. на везикулезные или зрозированные участки кожи, то болезненность и различные тактильные ощущения исчезали за 10-12 часов, а эпителизация в очагах продолжалась не более 1 суток. Кожный процесс полностью разрешался за 7-10 дней. У больной, которая по назначению врача многократно и безуспешно применяла Ацикловир, также отмечалось быстрое разрешение кожного процесса.

Все больные данных групп (147 человек), после проведенного лечения РНП, наблюдались в течение 1 года, у 28 больных первый рецидив возник через 8-10 месяцев, причем данная группа больных состояла из тех пациентов, которые применяли РНП в начальный период развития заболевания. У остальных 119 больных ВПГ по прошествию 12 месяцев рецидивов отмечено не было.

У 21 больного ВПГ, которым применялся препарат из тимуса, отмечалась более разнообразная динамика и клиническая картина кожного процесса после нанесения препарата. У 16 больных отмечалась такая же динамика в разрешении кожного процесса, как и у основной группы (147 больных), с отсутствием рецидивов в течение 1 года. Однако характер содержимого герпетических пузырьков вместо серозного имел гнойное содержимое. У 4 больных кожный процесс после нанесения РНП протекал, как обычно, без явного ускорения, с появлением рецидивов с той же регулярностью, как и до лечения. Новые рецидивы протекали мягче, со слабовыраженными ощущениями жжения, покалывания, болезненности. У 1 больного кожный процесс принял затяжной характер: после нанесения ННП гиперемия, легкий отек, парастезии сохранялись в течение 3-х недель. В течение этого срока появлялись единичные очень мелкие эрозии, покрытые точечными серозными корочками. Процесс разрешился к концу 4 недели наблюдения. Новые рецидивы появлялись с той же регулярностью, как и до лечения, но, со слов больного, протекали мягче.

У 8 больных, получавших РНП из семенников, также отмечалось положительное воздействие на течение герпетической инфекции, однако из-за отсутствия в дальнейшем препарата исследования были прекращены.

Пример 12. Эффективность препаратов ННП в отношении нормализации уровня трансаминаз в крови больных гепатитом В и С.

Проведены клинические исследования влияния препаратов РНП из печени и щитовидной железы на уровень трансаминаз: аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и общего билирубина в крови больных острым вирусным гепатитом В (2 пациента, введение препарата при помощи в/м инъекций по 1 инъекции 10 мг ННП ежедневно в течение 5 дней или 5 клизм по 20 мг) и острым вирусным гепатитом В+С (1 пациент, введение суммарного препарата, содержащего по 10 мг ННП из печени и из щитовидной железы, посредством 5 в/м инъекций).

Заметное снижение уровня ферментов в крови во всех случаях начиналось с 10-14 сут. после начала лечения, и к концу третьей недели уровень ферментов достигал нормы у всех пациентов.

Пример 13. Клиническая оценка эффективности РНП у больных Herpes virus varicellae (Varicella-Zoster Virus - VZV).

Под наблюдением находилось 2 больных VZV, женщина 38 лет и мужчина 53 лет. Заболевание протекало остро, с высокой температурой и общим недомоганием, строго левосторонним поражением кожи грудной клетки по ходу межреберных нервов у обоих больных. На день обращения у женщины длительность заболевания составляла 12 суток, картина высыпаний носила полиморфный характер: имелись крупных размеров (до 1 см) пузыри, заполненные геморрагическим содержимым, и множество мелких, свежих пузырьков, которые располагались вокруг массивных корок. Болевой синдром выражен значительно - больная не могла свободно дышать, и движения левой руки были ограничены. С 4 дня заболевания получала интенсивную терапию, включающую высокие дозы витаминов, антибиотиков, интерферон по 40000 ЕД 1 раза в день (№7), Imunofan 1.0-1 раз в день (№5), однако на фоне проводимого лечения каких-либо улучшений отмечено не было. Мужчина обратился на 4 день от момента появления высыпаний, и заболевание протекало в более легкой форме. Лечения не получал.

Для купирования заболевания был использован препарат из щитовидной железы в дозе 40-50 мг, который растворялся в 5 мл физиологического раствора и вводился в прямую кишку с помощью клизмы на ночь, всего на курс 80-100 мг. На 2 сутки от момента введения препарата отмечалось резкое улучшение общего состояния больных, а к 3 суткам у больной прекратился болевой синдром. У пациентов на 3 сутки отмечено значительное уменьшение отека и гиперемии в очагах поражения, высыпания подсохли, покрылись корочками. На 7 сутки очаги поражения имели застойно-синюшный цвет с сохраняющимися корочками в местах эрозий, общее состояние больных удовлетворительное. На 30 сутки очаги сохраняют синюшный цвет, на месте крупных эрозий у больной отмечается образование рубцов. Таким образом, как однократное накожное применение РНП в дозе 5 мг, так и двукратное применение в дозе 10 мг достаточно эффективно (в случаях герпетической инфекции).

При длительном применении препаратов для достижения терапевтического эффекта, как правило, достаточно 5-7 аппликаций в течение 2-х недель.

Пример 14. Эффективность препаратов ННП в отношении лечения папилломовирусных инфекций.

Проведено также амбулаторное изучение эффективности препаратов, выделенных из тимуса и лимфоузлов КРС, при лечении папилломовирусной инфекции у больных с генитальными бородавками и внутриректальной локализацией кондилом. Ранее все больные не получали лечения в отношении папилломавирусной инфекции. Пациентам этой группы проведен один курс лечения РНП. 10 мг препарата разводили в 2 мл физраствора. Инъекции проводили внутримышечно через день. Всего 5 инъекций.

У больного М. (фимоз, кондиломы локализовались в области крайней плоти) после третьей инъекции кондиломы стали покрываться гиперкератотическими наслоениями и вскоре уменьшились в два раза, однако параллельно этому больной стал отмечать появление на коже туловища множественных фурункулов, которые самостоятельно разрешались через 2-3 дня с момента появления. В течение четырех месяцев высыпания регрессировали на 2/3.

У больной Н. (кондиломы локализовались в области больших и малых половых губ, влагалища, цервикального канала) на фоне проводимой терапии после четвертой инъекции было отмечено исчезновение 2/3 всех образований. Полная клиническая ремиссия была отмечена через 1,5 месяца от начала лечения. При повторном исследовании иммунологического статуса была отмечена нормализация всех показателей.

У больного А. (образование локализовалось в области ладьевидной ямки и по клинико-морфологическому типу относилось к папиллярной разновидности кондилом) после проведения инъекций пациент самостоятельно провел удаление образования с помощью препарата "Солкодерм". В результате при оценке клинического состояния через 2 месяца было отмечено отсутствие образования, а также рецидивов в течение всего периода наблюдения (вплоть до сегодняшнего дня); помимо этого, при проведении ПЦР-исследования ранее обнаруживаемый папилломавирус 33 типа в повторном исследовании выявлен не был.

Во всех описанных случаях отмечалось отсутствие побочных действий на фоне лечения ННП, хорошая переносимость, болезненность в первые минуты после введения препарата в/к или в/м.

Заключение

Изложенный выше экспериментальный материал позволяет считать, что возможность корректировать действие регуляторных систем клеток и систем обмена информацией между клетками, в том числе и регуляторные сигналы работы генома, вполне достижима уже на современном уровне науки, а новые возможности, которые открывают РНП в области лечения разных болезней, превосходят самые смелые предположения. Исключительная способность РНП, выделенных из нормально функционирующих органов здорового организма, избирательно корректировать нарушения метаболизма разной этиологии и репарировать самые разные повреждения именно тех клеток, функции которых нарушены, явилась для авторов даже несколько неожиданной и вызывает некоторые затруднения при интерпретации возможных механизмов подобных явлений.

По-видимому, в наборе нормальных клеточных РНП содержится достаточное количество регуляторов - сигналов, способных включить участки генов, репрессированных или наоборот, избыточно активно функционирующих в результате разных неблагоприятных воздействий на клетку. Поступая в данный орган извне в избыточном количестве, РНП стимулируют работу всех нормально функционирующих звеньев и корректируют работу тех звеньев, деятельность которых нарушена.

Такая коррекция происходит независимо от причины, вызвавшей данное нарушение, и приводит к исправлению всех звеньев нарушенной цепи от низшего до высшего. Очень важно и то, что для нее используются соединения, которые работают в тех же клетках в норме, совершенно безвредны для организма, и нет необходимости в синтетических соединениях, сложных экстрактах из растений и других подобных веществ. Все это дает основания считать использование экзогенных регуляторов физиологического состояния клеток, тканей и органов новым, весьма перспективным подходом к коррекции обмена и лечения патологий, в том числе и на уровне генома, а сами РНП рассматривать как один из новых, эффективных классов биологически активных веществ и регуляторов, используемых в генетической терапии.

Авторами разработаны несколько моделей, позволяющих количественно оценивать действие РНП на клетки и органы с точки зрения их омолаживания или старения, и определять биологический возраст отдельного органа, ткани, системы органов, организма в целом. Этот подход может быть рекомендован для решения ряда проблем биологии и медицины, в частности, для количественной оценки пользы или вреда разных внешних воздействий, тестирования степени повреждений и патологических изменений разных органов и тканей, и разработки индивидуальных схем использования РНП, их смесей и других лекарственных средств с целью получения максимального терапевтического эффекта.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Средство, стимулирующее репарирование повреждений клеток, включающее низкомолекулярные рибонуклеопептиды, выделенные из ядер клеток млекопитающих с молекулярной массой 3,0-6,5 S (единиц Сведберга), содержащее более 90 вес.% низкомолекулярных РНК, 0,5-5,0 вес.% белка и примеси высокомолекулярных ДНК и РНК до 100 вес.%, обладающее следующими свойствами: ткане-, органо- и стадиеспецифичностью, противовирусной активностью, изменяющее среднее время полужизни клеток