ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА

 ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА


RU (11) 2049819 (13) C1

(51) 6 C12N9/48, C12N9/64 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1995.12.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 5000191/13 
(22) Дата подачи заявки: 1991.08.02 
(45) Опубликовано: 1995.12.10 
(56) Аналоги изобретения: 1. Патент США N 4390630, кл. C 12N 9/64, опублик.1983. 2. Баскова И.П., Никонов Г.И. и др. Биохимия, 1990, т.55, с.674-679. 
(71) Имя заявителя: Свердлов Евгений Давидович; Завалова Людмила Львовна; Кузина Елена Витальевна 
(72) Имя изобретателя: Свердлов Евгений Давидович; Завалова Людмила Львовна; Кузина Елена Витальевна 
(73) Имя патентообладателя: Свердлов Евгений Давидович; Завалова Людмила Львовна; Кузина Елена Витальевна 

(54) ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА 

Использование: биология и может быть применено в медицине, для лечения застарелых тромбозов и тромбоэмболических состояний. Сущность изобретения: фибрин-изопептидаза новый фермент, выделенный из медицинской пиявки Hirudo medicinalis, обладает изопептидазной и амидолитической активностью и имеет следующие свойства: мол. м. 15000 1000 (гельфильтрация на Superose-12 и ЭФ и ПААГе с SDS); изоэлектрическая точка 7,3 0,1 (изоэлектрофокусирование в ПААГе в присутствии амфолитов), субстратная специфичность: фермент гидролизует = Glu = = Lys изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина димере его d-фрагмента pH 8,0 и амидную связь в синтетическом субстрате = Glu = pNa (pH 8,0); диапазон pH-стабильности 5,5 8,5 (при 7°С в течение 7 дней, субстрат = Glu = pNa ) термостабильность: сохраняет активность при 22 37°С в течение 80 ч, при 7°С в течение 15 дней, при 75°С в течение 15 мин; ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10-2M): константа Михаэлиса: 2,910-5M (субстрат = Glu = pNa pH 8,0, 25°С). Получение фермента включает фракционирование экстракта гомогената целых пиявок сульфатом аммония, очистку фракции 40 60%-ного насыщения на анионообменной смоле ДЕАЕ-Toyoplarl (0,02 М трис-HCl, pH 7,5) и катионообменной смоле СМ-Toyopearl (0,02 М H-морфолинэтансульфоновая кислота, pH 5,5) и высокоэффективную гель-фильтрацию на колонке Superose-12 (0,02 М трис HCl, pH 7,0). 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к новому нативному ферменту, выделенному из медицинской пиявки Hirudomedicinalis, фибрин-изопептидазе. Фермент обладает способностью гидролизовать изопептидные связи в стабилизированном фибрине, что позволяет предполагать возможность его использования в медицине для лечения застарелых тромбозов и тромбоэмболических состояний.

Известно, что структурной основой тромбов в крови млекопитающих является стабилизированный фибрин. Он образуется на последних стадиях процесса свертывания крови под действием специфической трансглутаминазы фактра XIIIа в присутствии ионов Са2+ за счет возникновения поперечных сшивок (кросс-линкингов) между полипептидными цепями фибрина, которые представляют собой изопептидные связи между -NH2-группой лизина и -СООН-группой глутамина.

В настоящее время известно значительное число фибринолитических ферментов, выделенных из различных природных источников: грибов, бактерий, моллюсков, земляных червей, змеиного яда, желчи и вакуляризованной соединительной ткани млекопитающих и т.п. Все они являются пептидазами. Биологическое действие одной части фибринолитических ферментов направлено на то, чтобы активизировать природный путь фибринолиза, т.е. повлиять на переход плазминогена в плазмин. Другую группу фибринолитических ферментов составляют пептидазы, способные расщеплять фибрин. К ним относятся, например, фермент гементин, выделенный из секрета слюнных желез гигантской амазонской пиявки Haementeria ghilianii [1]

Однако в случае сформировавшихся тромбов ферментативное расщепление пептидных связей фибрина под действием фибринолитических пептидаз происходит прежде всего на поверхности тромба и в местах его прикрепления к стенкам сосуда, что может приводить к отщеплению от тромба крупных фрагментов и этим способствовать возникновению тромбоэмболических состояний.

На сегодняшний день известен единственный ферментный препарат дестабилаза, выделенный из секрета слюнных желез медицинской пиявки Hirudo medicinalis, который обладает способностью гидролизовать изопептидные связи в стабилизированном фибрине [2]

Очевидно, что такой механизм должен приводить к нарушению жесткой структуры фибрина и его крупных фрагментов при сохранении целостности полипептидных цепей, что будет способствовать постепенному разрыхлению тромба и его переходу в растворимое состояние.

Предлагаемый нативный фермент фибрин-изопептидаза, выделенный из медицинской пиявки Hirudo medicinalis, обладает изопептидазной и амидолитической активностью и имеет следующие характеристики: мол. мас. 150001000 Д; изоэлектрическая точка 7,30,1; субстратная специфичность: фермент гидролизует -Glu--Lys-изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина-димере его D-фрагмента при pH 8,0 и амидную связь в синтетическом субстрате-n-нитроанилиде -глутаминовой кислоты (-Glu-pNa) при pH 8,0;

диапазон pH-стабильности: 5,5-8,5 (при 7оС в течение 7 дней, субстрат -Glu-pNa);

термостабильность: сохраняет активность при 22-37оС в течение 80 ч, при 7оС в течение 15 дней, при 75оС в течение 15 мин;

константа Михаэлиса: 2,910-5 М (субстрат -Glu-pNa, pH 8,0, 25oC);

каталитическая константа: 0,9 с-1 (субстрат -Glu-pNa, pH 8,0, 25оС);

ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10-2 М).

В отличие от дестабилазы заявляемый фермент имеет мол. мас. 15000 Д (12300 Д у дестабилазы), характеризуется большим сродством к субстрату -Glu-pNa: константа Михаэлиса Кm= 2,910-5 М (в случае дестабилазы Кm= 2,210-4 М) и более высокую скорость катализа: Ккат=0,9 с-1 (в случае дестабилазы Ккат=3,5310-3 с-1).

Получение фермента включает фракционирование экстракта гомогената целых пиявок сульфатом аммония, очистку фракции 40-60%-ного насыщения на анионообменной смоле ДЕАЕ Toyopearl (0,02 М трис-HCl, pH 7,5) и катионообменной смоле СМ-Toyopearl (0,02 М N-морфолинэтансульфоновая кислота (МЕS), pH 5,5) и высокоэффективную гель-фильтрацию на колонке Superose-12 (0,02 M трис-HCl, pH 7,0).

В результате получают препарат, содержащий 805% активного вещества. Степень чистоты фермента подтверждена данными градиентного электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГе) в присутствии додецилсульфоната натрия (SDS)- изоэлектрофокусирования и высокоэффективной гель-фильтрации.

Ниже приводится подробное описание методики выделения фибрин-изопептидазы.

П р и м е р. Получение фибрин-изопептидазы.

1. Получение экстракта гомогената из медицинской пиявки Hirudo medicinalis

10 штук целых пиявок измельчают в гомогенизаторе типа Blender в 40 мл физиологического раствора (0,9 NaCl). К полученному раствору прибавляют еще 50 мл физиологического раствора, перемешивают, выдерживают 30 мин при 25оС и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин). К супернатанту (100 мл) прибавляют 20 мл 6% -ного раствора стрептомицинсульфата, выдерживают 30 мин при 0оС и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин).

2. Фракционирование сульфатом аммония.

Полученный супернатант фракционируют сульфатом аммония сначала до 40% насыщения (28,8 г) и после формирования осадка (2 ч при 0оС) и центрифугирования (30 мин при 5000 об/мин) прибавляют сульфат аммония до 60%-ного насыщения (16,9 г). Осадок формируют и центрифугируют (30 мин при 5000 об/мин) и промывают трижды (3х20 мл) раствором сульфата аммония 60%-ного насыщения.

3. Очистка фермента.

Полученный осадок разбавляют до 760 мл 0,02 М раствором трис-НСl, pH 7,5 и пропускают через колонку (1,5х9 cм) с анионообменной смолой ДЕАЕ-Toyopearl (Япония) со скоростью 5 мл/мин при 7оС в том же буфере. В результате этой операции 84% нанесенного белка задерживается на смоле. Фибрин-изопептидазную активность при этом обнаруживают во фракции, содержащей 16% нанесенного белка, не связавшегося со смолой. Затем к этой фракции (780 мл) прибавляют раствор концентрированной НСl до pH 5,5 и наносят на колонку (1х8 см) с катионообменной смолой СМ-Toyopearl (2 мл/мин при 7оС), предварительно уравновешенную 0,02 М МЕS, pH 5,5. В результате более 90% активного белка задерживается на смоле. Элюцию белка проводят раствором 0,2 М NaCl в 0,02 M MES, pH 5,5. Получают 7,9 мл раствора, содержащего 7,1 мг белка. Белок определяют по методу (Sedmak J.J. Grossberg S.S. Anal. Biochem. 1977, v. 79-, p.544-552). Полученную фракцию лиофилизуют, растворяют в 1 мл воды, раствор наносят на колонку Superose-12 (Pharmacia, Швеция), уравновешенную 0,02 М трис-НСl, pН 7,0 и осуществляют высокоэффективную гель-хроматографию (0,5 мл/мин, 0,5 атм. объем фракции 1 мл, хроматограф фирмы Altex, США), Фракции, содержащие активный белок, объединяют (6 мл) и лиофилизуют. В результате получают белковый препарат 80% -ной чистоты. Чистоту препарата определяют методом градиентного электрофореза в 4 ->> 16% ПААГе с 1% SDS и без него и методом изоэлектрофокусирования с 8,5 М мочевиной и без нее.

Были изучены физико-химические и энзимологические свойства нового фермента. При этом получены следующие характеристики.

УФ-спектр. Характерный максимум поглощения 275-278 нм.

Мол. мас. Мол. мас. 150001000 Д. Определена методом высокоэффективной гель-фильтрации на колонке Superose-12 (0,02 М трис-HCl, pH 7,0) и градиентного электрофореза в 4 ->> 16% ПААГе с 1% SDS.

N-концевая аминокислота. Фермент состоит из одной полипептидной цепи, на N-конце которой находится метионин.

Изоэлектрическая точка. pJ= 7,30,1. Изоэлектрическую точку определяли методом изоэлектрофокусирования при использовании амфолинов с диапазоном pH 3,5-10.

Изопептидазная активность. Изопептидазную активность фермента определяли в высокоспецифическом тесте по способности фермента гидролизовать изопептидные связи в природном субстрате продукте ограниченного протеолиза стабилизированного фибрина, димере его D-фрагмента (D-димер), в котором сохранены изопептидные связи между -цепями фибрина (Завалова Л.Л. Никонов Г.И. и др. Биохимия, т. 56, 1991, с.115-124). С этой целью 0,1-2,0 мкг фермента инкубировали с 50 мкг D-димера в 0,02 М трис-НСl буфере при pH 8,0 в течение 10-70 ч. Общий объем инкубационной пробы 100 мл. В результате реакции наблюдали гидролиз изопептидной связи в D-димере и образование двух идентичных D-мономеров, за накоплением которых наблюдали с помощью метода ЭФ в ПААГ.

Амидолитическая активность. Амидолитическую активность фермента определяли по его способности гидролизовать амидную связь в -Glu-pNa с образованием n-нитроанилина по методу (Баскова И.П. Никонов Г.И. и др. Биохимия, т. 55, 1990, с.674-679). Для этого 10-100 мкл раствора фермента прибавляли к пробе, содержащей 0,02 М трис-HCl, pH 8,0 и 0,05 мг/мл -Glu-pNa в общем объеме 0,5 мл, и инкубировали 5-30 мин при 25оС. За развитием реакции следили спектрофотометрически при длине волны 405 нм (коэффициент молярной экстинкции =9694 М-1см-1). Следует отметить, что ни тромбин, ни трипсин, ни химиотрипсин не гидролизуют этот субстрат в аналогичных условиях.

Диапазон pH-стабильности. Фермент стабилен в диапазоне pH 5,5-8,5 при 7оС в течение 7 дней (субстрат -Glu-pNa).

Термостабильность. Фермент сохраняет активность при 22-37оС в течение 80 ч, при 7оС в течение 15 дней, при 75оС в течение 15 мин.

pH-оптимум. Оптимум pH 7,3 (субстрат -Glu-pNa).

Константа Михаэлиса. Кm=2,910-5 М (субстрат -Clu-pNa, pH 8,0, 25oC).

Каталитическая константа. 0,9 с-1 (субстрат -Glu-pNa, pH 8,0, 25oC).

Ингибиторы. Фермент чувствителен к действию ингибиторов тиоловых протеиназ-йодацетамиду и йодацетату (при их концентрации не ниже 10-2М). 60%-ное ингибирование наблюдается после преинкубации при 25оС в течение 1 ч.

Фермент не чувствителен к действию ингибиторов сериновых протеиназ (p-метилсульфонилфторида, диизопропилфторфосфата). 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



ФИБРИН-ИЗОПЕПТИДАЗА, выделенная из медицинской пиявки Hirudo medicinalis обладающая изопептидазной и амидолитической активностью и имеющая следующие свойства:

молекулярная масса 15000 1000 дальтон;

изоэлектрическая точка 7,3 0,1;

субстратная специфичность: гидролизует -Glu-E-Lys- изопептидные связи в продукте ограниченного протеолиза фибрина димере его D-фрагмента (pH 8,0) и амидную связь в синтетическом субстрате -Glu-pNa (pH 8,0);

диапазон pH стабильности: 5,5 8,5 (при 7oС в течение 7 дней, субстрат -Glu-pNa),

термостабильность: сохраняет активность при 22 37oС в течение 80ч, при 7oС в течение 15 дней, при 75oС в течение 15 мин;

константа Михаэлиса: 2,9 10-5 М (субстрат -Glu-pNa, pH 8,0, 25oС);

каталитическая константа: 0,9 с-1 (субстрат -Glu-pNa, рH 8,0, 25oС);

ингибиторы: йодацетамид, йодацетат (при их концентрации не ниже 10-2 М)