СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГУБЧАТОГО КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГУБЧАТОГО КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА


RU (11) 2053796 (13) C1

(51) 6 A61L15/32 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - прекратил действие 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1996.02.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 92008739/14 
(22) Дата подачи заявки: 1992.11.26 
(45) Опубликовано: 1996.02.10 
(56) Аналоги изобретения: Михайлова А.Н. Коллаген кожного покрова и основа его переработки, М.: Легкая индустрия, 1971, с.528. 
(71) Имя заявителя: Институт пищевых веществ РАН 
(72) Имя изобретателя: Лозинский В.И.; Гнездилова Т.В. 
(73) Имя патентообладателя: Институт пищевых веществ РАН 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГУБЧАТОГО КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА 

Использование: в области получения полимерных материалов медицинского назначения, а именно для получения кровоостанавливающих средств, повязок для ран различной этиологии. Сущность изобретения: уксуснокислый коллоидный раствор коллагена обрабатывают раствором гидроксида натрия до pH 4,0 - 5,0, выпавший волокнистый коллаген смешивают с сшивающим агентом, замораживают, оттаивают и сушат. Данный способ обеспечивает получение коллагеновых губок высокого качества. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к получению полимерных материалов медицинского назначения, конкретно к способу получения губчатого коллагенсодержащего материала.

Пористые материалы на основе главного биополимера соединительных тканей человека и животных коллагена находят достаточно широкое применение в медицинской практике в качестве кровеостанавливающих средств, осушающих покрытий на раны, ожоги и трофические язвы, как каркас протезов кровеносных сосудов и др. При этом известны различные способы приготовления этих материалов и придания им пористости.

Известен способ формирования пористого коллагенового материала, заключающийся в выделении коллагена из исходного сырья, его гомогенизации, набухании и растворении в водной уксусной кислоте с получением 0,6%-ного коллоидного уксуснокислого раствора микрофибриллярного коллагена, который затем смешивают с 0,01 вес. глутарового альдегида, 0,01 вес. борной кислоты и 0,00015 вес. хинозола, замораживают и сушат лиофильно, а далее стерилизуют радиационным способом дозой 1,25-2,5 Мрад. Под названием "Комбутек-2" полученный препарат допущен к медицинскому применению для закрытия и окончательного лечения очищенных от мертвых тканей ран. Основными недостатками данного способа являются его высокая энергоемкость, поскольку способ предусматривает лиофильное высушивание композиции с содержанием сухих веществ менее 0,7% т.е. более 99% от исходного веса замороженной смеси необходимо удалить, сублимируя лед в вакууме. Кроме того, сама лиофильная сушка требует использования дорогого оборудования, что дополнительно удорожает способ. Радиационная стерилизация требует и специальных опасных для обслуживающего персонала устройств, и специальных защищенных помещений.

Известен модифицированный способ, где уксуснокислый коллоидный раствор коллагена разливают в кюветы, замораживают и лиофильно сушат до остаточной влажности 60% далее материал механически уплотняют, а затем сшивают 0,5%-ным раствором глутарового альдегида в течение 1-28 суток и потом окончательно высушивают. Полученный коллагеновый материал предназначен для покрытий на раны и ожоги, он длительное время может находиться на ране, не теряя своей пористой структуры, сформированной лиофильным высушиванием. Данный способ также имеет ряд недостатков: он очень продолжителен общая длительность технологии, включая процесс приготовления уксуснокислого раствора коллагена составляет 7-35 сут. также как и способ, эта технология отличается высокой энергоемкостью из-за использования сублимационной сушки.

Наиболее близким к заявляемому по принципу формирования пористой структуры коллагенового материала является принятый за прототип способ, согласно которому после получения уксуснокислого коллоидного раствора микрофибриллярного коллагена проводят осаждение волокон коллагена равным объемом насыщенного раствора сульфата натрия, содержащего формальдегид в концентрации 1-2 вес. осажденный поддубленный волокнистый преципитат промывают водой, подвергают механическому диспергированию, вводят глутаровый альдегид в расчете 0,1-1,0% на сухой остаток, полученную композицию замораживают в поддонах при температуре -5.-20оС в течение 10-15 ч, оттаивают, сформированный губчатый коллагеновый материал промывают водой и сушат на воздухе при комнатной температуре. Если необходимо материал может быть простерилизован известными способами, например радиационно.

Использование в исходной композиции осажденных волокон коллагена позволяет получить после оттаивания коллагеновую губку, которая не теряет своей пористости при высушивании на воздухе, т.е. отпадает необходимость в энергоемкой лиофильной сушке для придания материалу подобной пористости. Опыты показали, что если тем же криогенным способом готовить материал из уксуснокислого коллагенового раствора, то после высыхания на воздухе продукт роговеет, губчатая структура исчезает. Иными словами, для получения качественной коллагеновой губки исходная композиция должна содержать именно волокнистый коллаген.

Однако способ-прототип имеет определенные недостатки:

стадия получения волокнистого коллагена, используемого затем для формирования коллагеновых губок, осуществляется в несколько этапов: осаждение, поддубливание и затем многократная промывка преципитата водой до отpицательной реакции на сульфат-анион;

весь процесс осаждения и промывки волокнистого коллагена длителен, занимает несколько часов (2 ч на осаждение и затем промывка);

во время подготовки волокон используется токсичное вещество формальдегид, что ухудшает условия труда обслуживающего персонала; формальдегид также попадает в сточные воды вместе с большим количеством солей, главным образом, сульфатом натрия, т. е. сточные воды такого производства представляют экологическую опасность. Поскольку осадительный раствор используется однократно, то способ-прототип характеризуется большим расходом реагентов, что удорожает процесс в целом;

сушка конечного продукта, т.е. коллагенового губчатого материала, осуществляется на воздухе, поэтому для медицинского применения полученных губок обязательно требуется проведение стерилизации еще одной дополнительной стадии.

Задача изобретения: упрощение способа, уменьшение числа стадий и их продолжительности, снижение расхода реагентов и количество вредных примесей в сточных водах, сокращение объема сточных вод.

Данная задача решается тем, что осаждение волокнистого коллагена проводят изменением рН уксуснокислого коллоидного раствора коллагена до значений 4,0-5,0, а сушку сформированного губчатого коллагенсодержащего материала совмещают с его стерилизацией, промывая этанолом и/или ацетоном с последующим выдерживанием в стерильной среде.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят выделение коллагена из коллагенсодержащего сырья (например, обрези гольевого спилка), для чего используют известные приемы экстракции неколлагеновых высокомолекулярных компонентов сырья. К этим приемам относится щелочная и щелочно-солевая обработки измельченного сырья с последующей промывкой набухшего разрыхленного материала от раствора экстрагента.

Освобожденный от примесей набухший коллаген переносят в среду 1М уксусной кислоты, где происходит постепенная солюбилизация биополимера с образованием коллоидного раствора его микрофибрилл. Обычно в это время массу подвергают дополнительной механической дезинтеграции и, если необходимо, отделяют фракцию плотных образований.

Проводят изоэлектрическое осаждение волокнистого коллагена, для чего используют водные растворы или гидроксида натрия, или калия, или известкового молока.

Осадок разбавляют водой до концентрации волокнистого коллагена в суспензии до 1,5-2,5% тщательно перемешивают, прибавляют сшивающий агент (глутаровый альдегид) в количестве 0,05-1,10% от веса коллагена в суспензии, вновь перемешивают композицию, размещают ее в формах и замораживают при температуре -35.-62оС в течение 0,15-1 ч и/или при -4.-21оС в течение 10-15 ч.

После оттаивания полученный губчатый коллагеновый материал отжимают от несвязанной жидкости и помещают в этанол и/или ацетон на 0,5-1,0 ч, периодически отжимая дегидратирующий органический растворитель и замачивая губку в нем вновь.

Дальнейшие завершающие операции проводят в стерильных условиях. Отжимают несвязанную жидкость, а конечный материал или обдувают потоком стерильного воздуха для удаления остатков органического растворителя, либо досушивают при небольшом разряжении. Высушенный продукт стерильно затаривают.

Приведенная совокупность технических решений для получения губчатого коллагенсодержащего материала не известна из уровня техники, поэтому заявляемый способ отвечает критерию "новизна".

Использование конкретных режимов реализации заявляемого способа обусловлено следующими моментами:

Согласно предлагаемому изобретению осаждение волокнистого коллагена, применяемого при формировании конечного материала, проводят с помощью изменения рН уксуснокислого коллоидного раствора коллагена, доводя значения этого заявляемого параметра до 4,0-5,0. При рН<4,0 волокнистый осадок образуется, но более 30% белка остается в коллоидно-дисперсном состоянии, в результате чего целевой материал во время сушки частично роговеет, становится жестким, что не позволяет применять его в качестве атравматических покрытий медицинского назначения. При рН>5,0 создаются условия для очень быстрого протекания процессов сшивки суспензии волокнистого коллагена глутаровым альдегидом после прибавления последнего, поэтому взаимодействие кросс-агента с белком в полимерной композиции успевает пройти до замораживания реакционной массы, в результате не удается получить целевой губчатый коллагенсодержащий материал. Таким образом, только при осаждении волокнистого коллагена доведением рН системы до значений в заявляемом диапазоне 4,0-5,0 обеспечиваются условия, позволяющие в конце процесса получить целевой продукт. Данный существенный признак не является очевидным, и до проведения изобретательской работы его нельзя было логически вывести из известной информации.

В предлагаемом способе предусмотрено проведение дегидратации сформированной коллагеновой губки с помощью смешивающихся с водой органических растворителей таких, как этанол и/или ацетон. При этом одновременно с обезвоживанием происходит стерилизация материала. Данные растворители выбраны вследствие их невысокой стоимости, известных стерилизующих качеств и высокой летучести, что облегчает их удаление из дегидратированного простерилизованного конечного продукта.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого способа.

П р и м е р 1. В 2%-ный уксуснокислый коллоидный раствор коллагена, полученный известным способом, при перемешивании прибавляют 1,5М водный раствор NaOH до достижения рН 5,0. Выпавший осадок волокнистого коллагена разбавляют водой до концентрации суспензии по белку 1,5% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,5 вес. по отношению к количеству коллагена, тщательно перемешивают реакционную массу и слоем толщиной 5 мм разливают на поддоны, которые помещают на 15 мин в морозильную камеру с температурой -50оС. Замороженные образцы переносят в морозильную камеру с температурой -4оС и выдерживают там 10 ч. После оттаивания препаратов отжимают несвязанную жидкость и помещают отжатый пористый материал в емкость с этанолом на 30 мин. Далее материал отжимают окончательно и сушат, обдувая стерильным воздухом. Использованный этанол для регенерации перегоняют. Плотность полученного губчатого коллагенсодержащего материала 0,49 г/см3, водоудерживающая способность 2600%

П р и м е р 2. В 1,5%-ный уксуснокислый коллоидный раствор коллагена, полученный известным способом, при перемешивании прибавляют 2М водный раствор КОН до достижения рН 4,5. Выпавший осадок волокнистого коллагена разбавляют водой до концентрации суспензии по белку 2,0% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,1% от веса коллагена, перемешивают реакционную массу, разливают ее в формы слоем толщиной 3 мм и замораживают при -35оС в течение 1 ч. Далее замороженные препараты выдерживают при -10оС в течение 12 ч. После оттаивания полученные губки обрабатывают аналогично примеру 1, но в качестве дегидратирующей ванны используют смесь этанол-ацетон (1:1). Затем отжимают несвязанную жидкость, а коллагеновую губку досушивают при 20 мм рт. ст. Органический растворитель регенерируют перегонкой. Плотность полученного губчатого коллагенсодержащего материала 0,55 г/см3, водоудерживающая способность 2500%

П р и м е р 3. К 2,5%-ному уксуснокислому коллоидному раствору коллагена, полученному известным способом, при перемешивании прибавляют насыщенный водный раствор гидроксида кальция известковое молоко до рН 4,0. Выпавший осадок волокнистого коллагена разбавляют водой до концентрации суспензии по белку 2,5% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,05% от веса коллагена, перемешивают реакционную массу, заливают в форму слоем толщиной 10 мм и замораживают при -62оС в течение 9 мин. Замороженный препарат переносят в камеру с температурой -21оС, где выдерживают 15 ч. После оттаивания отжимают несвязанную жидкость, погружают коллагеновую губку в ацетон на 1 ч, затем отжимают и сушат в ламинарном шкафу. Использованный органический растворитель регенерируют перегонкой. Плотность полученного губчатого коллагенсодержащего материала 0,62 г/см3, водоудерживающая способность 2300%

П р и м е р 4. Суспензию волокнистого коллагена получают по примеру 2, доводя рН системы до 4,8. Далее разбавляют образец до содержания белка 2,4% вводят глутаровый альдегид в количестве 1,01% от веса коллагена, перемешивают реакционную массу, разливают слоем толщиной 4 мм в круглые формы диаметром 8 см и замораживают при -45оС в течение 30 мин. Замороженные образцы затем выдерживают при -8оС в течение 14 ч. После оттаивания отжимают от несвязанной жидкости. Губку помещают в емкость со смесью этанол-ацетон (1:3), где выдерживают периодически отжимая в течение 50 мин. Далее отжимают несвязанный растворитель, а коллагеновый материал досушивают, обдувая стерильным воздухом. Использованный органический растворитель регенерируют перегонкой. Плотность полученного коллагенсодержащего материала 0,50 г/см3, водоудерживающая способность 2700%

П р и м е р 5. Получают волокнистый коллаген по примеру 1 при рН 4,3. Далее разбавляют суспензию до содержания белка 1,8% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,75% от веса коллагена и после перемешивания через щелевую фильеру (3,5 мм) наносят реакционную смесь на металлический блок, охлажденный до -21оС. Плоский, замороженный образец выдерживают при этой температуре 15 ч, оттаивают и отжимают несвязанную жидкость, пропуская полученный губчатый материал через резиновые вальцы. Дегидратацию осуществляют в ванне с ацетоном, а окончательное досушивание в вакууме при 30 мм рт.ст. Использованный органический растворитель регенерируют перегонкой. Плотность полученного коллагенсодержащего материала 0,45 г/см3, водоудерживающая способность 3000%

П р и м е р 6. Получают волокнистый коллаген по примеру 3 при рН 4,15. Далее разбавляют примерно до содержания белка 2,1% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,07% от веса коллагена и после перемешивания заливают в форму слоем толщиной 6 мм. Образец замораживают при -15оС и выдерживают при этой температуре 12,5 ч. Затем оттаивают, отжимают несвязанную жидкость и погружают на 20 мин в ванну с этанолом, отжимают, переносят на 20 мин в ванну с ацетоном, отжимают и сушат в ламинарном шкафу. Использованные органические растворители регенерируют перегонкой. Плотность полученного коллагенсодержащего материала 0,53 г/см3, водоудерживающая способность 2700%

П р и м е р 7. Готовят реакционную массу по примеру 2. Разливают в поддоны слоем толщиной 2 мм и замораживают образцы при -4оС в течение 10 ч. После оттаивания препараты обрабатывают по методике примера 2. Плотность полученного губчатого коллагенсодержащего материала 0,46 г/см3, водоудерживающая способность 2900%

П р и м е р 8. Готовят реакционную массу по примеру 1, разливают в форму и замораживают при -9оС в течение 11 ч. После оттаивания препарат обрабатывают по методике примера 4. Плотность полученного губчатого коллагенсодержащего материала 0,65 г/см3, водоудерживающая способность 2300%

П р и м е р 9. В 3%-ный уксуснокислый коллоидный раствор коллагена, полученный известным способом, прибавляют 1М водный раствор NaOH до достижения рН 3,8. Полученную суспензию разбавляют до содержания белка 2% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,6% от веса коллагена, перемешивают и далее обрабатывают по методике примера 2. После дегидратации в органическом растворителе и сушки конечный продукт частично роговеет, становится жестким и деформируется; его плотность 1,02 г/см3, водоудерживающая способность 700% т.е. при значении рН реакционной массы <4,0 целевой продукт имеет малую пористость и низкую водоудерживающую способность.

П р и м е р 10. В 2,5%-ный уксуснокислый коллоидный раствор коллагена, полученный известным способом, прибавляют 3М водный раствор КОН до достижения рН 5,2. Полученную суспензию разбавляют водой до содержания белка 1,8% прибавляют глутаровый альдегид в количестве 0,1% от веса коллагена, быстро перемешивают, но при попытке разлить реакционную массу в формы она в считанные минуты густеет, что не дает возможности заморозить образцы до момента их желирования. В результате получается малопористый негубчатый материал, т. е. при значении рН реакционной массы >5,0 не удается получить целевой продукт.

Предлагаемое изобретение имеет следующие преимущества по сравнению с известным способом получения губчатых коллагенсодержащих материалов:

приготовление суспензии волокнистого коллагена осуществляется в одну стадию простым изменением рН уксуснокислого коллоидного раствора данного белка без какого-либо поддубливания и последующей промывки, получение суспензии по заявляемому способу занимает всего несколько минут в противоположность нескольким часам по способу-прототипу;

для осаждения волокнистого коллагена не предусматривается использование токсичных агентов типа формальдегида, как в способе-прототипе, и кроме того, содержимое осадительного раствора не отделяется от суспензии, а остается в реакционной смеси, т.е. полностью убирается стадия промывки осадка волокнистого коллагена, а значит не образуется сточных вод, содержащих формальдегид и соли, что повышает экологическую безопасность процесса в целом;

в противоположность способу-прототипу, где для осаждения волокнистого коллагена используется насыщенный раствор сульфата натрия (содержание соли в системе составляет 16,3 г/100 г раствора [6]), т.е. очень значителен расход химических реагентов, заявляемый способ предусматривает применение таких растворов щелочных агентов, что концентрация соли в системе не превышает 6-8 г/100 г раствора, т.е. расход реагентов снижен в 2-3 раза, а использование формалина исключается вовсе;

в известных способах сушка конечного материала и его стерилизация проводятся в виде самостоятельных операций, а в предлагаемом способе, во-первых, не используется энергоемкая лиофильная сушка, и, во-вторых, дегидратация совмещена со стерилизацией, причем стерилизующий агент легко регенерируется перегонкой и может быть использован вновь;

при соблюдении заявляемых режимов (примеры 1-8) целевой продукт губчатый коллагенсодержащий материал обладает высокой влагоудерживающей способностью (2000-3000%), при нарушении заявляемых диапазонов получается либо материал с низкой пористостью (пример 9), либо из-за слишком быстрого сшивания криогенное структурирование вообще не проходит (пример 10).

Предлагаемый способ не изменяет химического состава коллагеновых губок, разрешенных для медицинского применения, а лишь упрощает и удешевляет технологию их получения. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГУБЧАТОГО КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА, включающий приготовление уксуснокислого коллоидного раствора коллагена, осаждение суспензии волокнистого коллагена, смешивание ее с сшивающим агентом, замораживание, оттаивание и сушку, отличающийся тем, что осаждение волокнистого коллагена проводят изменением рН уксуснокислого раствора коллагена до 4,0 - 5,0, а сушку сформированного губчатого коллагенсодержащего материала совмещают с его стерилизацией, помещая в этанол и/или ацетон с последующим выдерживанием в стерильной среде.