КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ

КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ


RU (11) 2296575 (13) C2

(51) МПК
A61K 35/54 (2006.01)
A61P 19/08 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 07.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2007.04.10 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004126518/15 
(22) Дата подачи заявки: 2004.09.01 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.09.01 
(43) Дата публикации заявки: 2006.02.10 
(45) Опубликовано: 2007.04.10 
(56) Аналоги изобретения: RU 2210352 C1, 20.08.2003. CANCEDDA R. et al. Cell therapy and bone repair. European cell and materials, vol.5. suppl. 2, 2003, p.2-3. RU 2204332 C1, 20.05.2003. RU 2231986 C1, 10.07.2004. RU 2001133504 А, 27.02.2004. 
(72) Имя изобретателя: Колокольцова Тамара Дмитриевна (RU); Нечаева Елена Августовна (RU); Болгова Ольга Павловна (RU); Радаева Ирина Федоровна (RU); Павлов Виталий Викторович (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" Роспотребнадзора) (RU) 
(98) Адрес для переписки: 630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пгт. Кольцово, ГНЦ ВБ "Вектор", зав. патентным отделом Ю.Н. Мистюрину 

(54) КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕФЕКТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии. Композиция для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии содержит питательную среду Игла MEM, 10%-ную сыворотку плодов коровы, диплоидные клетки фибробластов человека и гелевый наполнитель, при следующем содержании компонентов в 1 мл: суспензия диплоидных клеток фибробластов человека - 1×105-5×10 7 клеток; питательная среда Игла MEM - 0,01-0,9; 10%-ная сыворотка крови плодов коровы - 0,01-0,2; гелевый наполнитель - остальное до 1 мл. В качестве диплоидных клеток фибробластов человека композиция содержит штамм диплоидных клеток фибробластов человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-1 или штамм диплоидных клеток фибробластов человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2. В качестве гелевого наполнителя может быть использован 5%-ный полиэтиленоксид. Использование композиции позволяет ускорить наступление ремиссии и увеличить сроки ремиссии хронического заболевания. 1 з.п.ф-лы.




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии. В травматологии и ортопедии существует категория патологий, связанная с локальным проявлением остеодистрофических изменений в костях скелета, обусловленных нарушениями или репаративной или физиологической регенерации в связи с повышением процессов резорбции костной ткани, а именно:

несовершенный костный регенерат, формирующийся при сращении кости; кисты кости; асептический некроз головки бедренной кости.

Для нормализации структуры костного органа в подавляющем большинстве случаев требуются оперативные вмешательства. Для успеха восстановительных процессов в кости, помимо этого, в настоящее время разрабатываются стимулирующие средства, вводимые в очаг поражения. Одним из таких материалов, обладающих остеоиндуктивными свойствами, является деминерализованный костный матрикс (Савельев В.И., Корнилов Н.В., Сивков С.Н. Опыт клинического применения деминерализованных костных аллотрансплантатов в травматологии и ортопедии // Ортопед., - травматол, 1989, № 9, с.23). В эксперименте доказано, что при заполнении дефектов костной ткани порошкообразным матриксом костеобразование лучше, чем при пластике цельными аутотрансплантатами (Aspenberg P. Wittbjer F., Thomgren K.G. Pulverised Bone Matrix as an injectable Bone Craftin Rabbit Radius Deffects // Clinical Orthopaecs, 1988, № 236, p.261-269). По мнению авторов, у измельченного костного матрикса с размером частиц 70-420 мкм остеогенетический потенциал выше, чем у аутокости.

Из литературных источников также известно, что гликозаминогликаны являются на ранних стадиях активными стимуляторами регенерации костной ткани (Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. М.: Медицина, 1981, 312 с.). В качестве источника гликозаминогликанов было предложено использовать консервированную в 0,5% растворе формалина пуповину, содержащую высокий процент гликозаминогликанов. Пуповина обладает важными для пластического материала свойствами: малое содержание клеточных элементов, незрелость антигенных структур, отсутствие признаков гистонесовместимости, биостимулирующим действием на регенеративные процессы (Петров И.А. Профилактика и лечение рубцово-спаечного процесса при застарелых травматических повреждениях сухожилий сгибателей пальцев кисти на уровне костно-фиброзных каналов // Автореф. дисс.(канд. мед. наук. - Ташкент, 1994, 15 с.; Ахмедов О.Т. Болезнь Дюпюитрена и ее хирургическое лечение // Автореф. дисс.(канд. мед. наук. - Ташкент, 1994, 15 с.).

Для оптимизации процессов костеобразования было предложено использовать пуповину, консервированную в 0,5% растворе формалина в сочетании с измельченной аллогенной формалинизированной костью (Патент РФ №2071737, МПК А61К 35/32, опубл. 1993 г.).

Одним из недостатков вышеуказанных средств является длительный период лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии.

Другим направлением является большое разнообразие и многочисленность остеопластических материалов, по мнению многих авторов [1-5], универсальный остеопластический материал для заполнения костных полостей отсутствует. В клинической практике известен целый ряд различных способов восстановления поврежденной костной ткани с помощью аутотрансплантации культивированных клеток костного мозга [6] или фетальных остеобластов [7].

Однако широкому использованию трансплантатов из клеток костного мозга препятствуют довольно существенные технологические недостатки:

необходимость оперативного вмешательства для забора материала и последующая болезненность донорского участка, сложность культивирования клеток, необходимость использования дорогостоящих питательных сред и ростовых добавок, значительное отдаление сроков лечения клеточным аутотрансплантатом, ограничение в использовании первичных остеобластов связано с невозможностью их полной аттестации.

Наиболее близким к заявленному изобретению по технологическому исполнению и полученным результатам является средство для лечения костных дефектов с помощью культивированных аутоклеток костного мозга. Согласно данному средству аутокостный мозг получают путем аспирации из подвздошных костей больных, после чего подвергают 5-7-кратному пассированию с добавлением FGF . После культивирования клеточную суспензию наносят на гидроксиаппатит и трансплантируют пациенту в место костного дефекта, проводя иммобилизацию кости [9].

Несмотря на то, что данное средство-прототип зарекомендовало себя как достаточно эффективное при лечении костного дефекта большой протяженности, оно имеет некоторые недостатки. При получении данного средства осуществляют культивирование нестандартизованного клеточного материала, что может привести к непредсказуемым результатам и трудностям в отработке схемы лечения и увеличению сроков лечения. Кроме того, работа с первичной культурой, а также процедура ее предварительной аттестации увеличивают вероятность контаминации клеток и время подготовки клеточного материала до трансплантации. Использование ростовых факторов, таких как FGF(также ведет к удорожанию данного метода.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение технологии получения лечебной композиции и сокращение сроков лечения заболеваний костной ткани и остеомиелитов.

Указанный технический результат достигается тем, что композиция для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии на основе культур клеток, согласно изобретению дополнительно содержит компоненты питательной среды и гелевый наполнитель, а в качестве клеточной культуры композиция содержит суспензию культуры диплоидных фибробластов человека при следующем содержании компонентов в 1 мл:

суспензия диплоидных фибробластов человека 1×105-5×10 7 клеток 
компоненты питательная среды 0,01-0,9 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


В качестве компонентов питательной среды композиция содержит питательную среду Игла MEM и сыворотку крови плодов коровы при следующем содержании всех компонентов в 1 мл:

суспензия диплоидных фибробластов человека 1×105-5×10 7 клеток 
питательная среда Игла MEM 0,01-0,9 
сыворотка крови плодов коровы 0,01-0,2 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


В качестве диплоидных клеток фибробластов человека она содержит штамм диплоидных клеток человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-1, зарегистрированный во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером НИИМБ-265 или штамм диплоидных клеток человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2, зарегистрированый во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером НИИМБ-266.

Преимуществом заявляемого изобретения является использование при лечении костных дефектов стандартного клеточного материала, приготовленного и аттестованного заранее, что позволяет исключить этап забора аутоклеток костного мозга, и таким образом, снять стрессовый фактор, исключить донорские раны, значительно сократить сроки подготовки материала и повысить эффективность заживления, стандартизовать метод лечения и снизить время госпитализации.

Для трансплантации используют штаммы диплоидных клеток фибробластов легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека, посевной и рабочие банки которого были аттестованы в ГНЦ ВБ "Вектор" и в ГИСК им. Л.А.Тарасевича для применения в заместительной терапии [10]. Клетки стандартны, свободны от вирусной, бактериальной, микоплазменной и грибковой контаминации, имеют стабильный кариотип, хорошие культуральные свойства. Показано отсутствие посторонних вирусов и онкогенности. По литературным данным фетальные фибробласты не просто более эффективны в отношении стимуляции деления клеток, но и в отличие от аналогичных клеток взрослого человека активно мигрируют в зоны механического повреждения клеточного слоя [11]. Таким образом, использование для трансплантациии дтплоидных клеток фетальных фибробластов человека, заранее атгестованных и заложенных на хранение в достаточном количестве ампул, свидетельствует о соответствии нашего решения критерию "существенные отличия".

Использование альтернативного источника трансплантируемых клеток - фибробластов - дает ряд преимуществ. Помимо того, что нет необходимости в заборе донорского материала и создания дополнительного стрессорного фактора для больного, удлинения сроков подготовки материала из-за культивирования аутоклеток и высокой вероятности контаминации клеток в процессе манипуляций, предлагаемые диплоидные фибробласты стандартны, аттестованы в соответствии с современными требованиям. Показано, что диплоидные фибробласты посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса стимулируют пролиферативную активность остеобластов, возможна последующая дифференцировка фибробластов в клетки костной ткани [8].

Пример 1. Диплоидные клетки фибробластов человека получают из легкого эмбриона человека с соблюдением правил асептики, закладывают на хранение при температуре жидкого азота посевной и рабочий банки. Банки аттестуют в соответствии с современными требованиями ВОЗ и проводят контроль на стабильность культуральных, морфологических и кариологических свойств. Видовую специфичность подтверждают с помощью контроля подвижности изоферментов электрофоретически, анализируя кариотип клеток; подтверждалось отсутствие туморогенных потенций; отсутствие вирусов, бактерий, грибов и микоплазм методами ПЦР и ИФА анализа, высевом на микробиологические среды. Клетки прошли контрольные испытания в ГИСК им. Л.А.Тарасовича МЗ РФ(Ю). Получено заключение комитета МИБП на использование клеток для заместительной терапии [12].

Пример 2. Для культивирования ампулу с клетками размораживают на водяной бане при температуре 37,5°С, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки плодов коровы при температуре 37,5°С и культивируют до получения необходимого количества клеток. После последнего культивирования клетки смешивают с гелем 5%-ного полиэтиленоксида, питательной средой Игла MEM и сывороткой крови плодов коровы с получением лечебной композиции следующих составов:

Композиция А

суспензия диплоидных фибробластов человека 1×105 клеток 
питательная среда Игла MEM 0,01 
сыворотка крови плодов коровы 0,01 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


Композиция Б

суспензия диплоидных фибробластов человека 5×107 клеток 
питательная среда Игла MEM 0,7 
сыворотка крови плодов коровы 0,2 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


Композиция В

суспензия диплоидных фибробластов человека 5×106 клеток 
питательная среда Игла MEM 0,9 
сыворотка крови плодов коровы 0,01 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


Композиции А, Б и В используют в зависимости от состояния раны больного.

Композицию транспортируют до лечебного учреждения. После очистки раны в условиях операционной композицию наносят на рану.

Пример 3. Больной Д. 48 лет, № истории 1182/03 г., обратился в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов 24.08.03 с жалобами на наличие свища с гнойным отделяемым в области левого тазобедренного сустава.

10.02.02 оперирован в городе N, где произведено тотальное цементное эндопротезирование левого ТБС по поводу посттравматического коксартроза 3 степени.

с 19.05. по 27.07.03 г.г. проходил курс лечения с диагнозом: Глубокая поздняя раневая инфекция области эндопротеза "Зиммер", левого тазобедренного сустава. Хронический постимплантационный остеомиелит бедренной и подвздошной костей слева, свищевая форма. Выполнено оперативное лечение-ревизия эндопротеза, фенестрация левой бедренной кости, удаление эндопротеза, некрэктомия, секвестрэктомия, дренирование раны. При контрольном обследовании через 2 месяца в области левого ТБС, при фистулографии выявлена полость. При сравнении фистулограмм полость в замерах не уменьшилась. В посевах раневого отделяемого выделены Staphylococus aureus, Pseudomonas. aeruginosae.

29.08.03 больному выполнено хирургическое вмешательство: ревизия гнойной полости, иссечение свища, остеонекрэктомия, дренирование и пластика полости мышцей на питающей ножке. В послеоперационном периоде развилось глубокое нагноение раны, с обострением гнойного воспалительного процесса, развитием сепсиса и образованием гнойных затеков по задней поверхности левого бедра. Последние вскрыты и дренированы. Проводилась антибактериальная терапия (тиенам), стимуляция макрофагального звена (полиоксидоний, ликопид), иммуностимуляция пентоглобином и ежедневные перевязки с антисептиками, а также аналгезирующая и физиотерапия. Для коррекции дисбактериоза назначались пробиотики.

11.09.03 после повторного хирургического вмешательства пункционно непосредственно в полость на дне ацетабулярной впадины вводилась композиция Б фибробластов в гелевой взвеси. Копозиция фибробластов вводилась трижды 11.09.03, 16.09.03 и 23.09.03. В результате лечения на контрольной фистулограмме на 22 сутки отмечено уменьшение полости в 2,5-3 раза и гнойного отделяемого. Перевязки стало возможным выполнять через день. Больной активизирован, обучен ходьбе на костылях и выписан 27.10.03 в удовлетворительном состоянии для лечения по месту жительства. Спустя два месяца свищ закрылся. Получена ремиссия.

Пример 4. Диплоидные клетки фибробластов человека получают из диплоидных клеток человека, а именно из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2 с соблюдением правил асептики, закладывают на хранение при температуре жидкого азота посевной и рабочий банки. Банки аттестуют в соответствии с современными требованиями ВОЗ и проводят контроль на стабильность культуральных, морфологических и кариологических свойств. Видовую специфичность подтверждают с помощью контроля подвижности изоферментов электрофоретически, анализируя кариотип клеток; подтверждалось отсутствие туморогенных потенций; отсутствие вирусов, бактерий, грибов и микоплазм методами ПЦР и ИФА анализа, высевом на микробиологические среды. Клетки прошли контрольные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасовича МЗ РФ (10). Для культивирования ампулу с клетками размораживают на водяной бане при температуре 37,5°С, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА MEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки плодов коровы при температуре 37,5°С и культивируют до получения необходимого количества клеток. После последнего культивирования клетки смешивают с гелем 5%-ного полиэтиленоксида, питательной средой Игла MEM и сывороткой крови плодов коровы с получением лечебной композиции следующего состава:

суспензия диплоидных клеток

из кожно-мышечной ткани эмбриона 1×105 клеток 
питательная среда Игла MEM 0,01 
сыворотка крови плодов коровы 0,01 
гелевый наполнитель остальное до 1 мл 


Композицию транспортируют до лечебного учреждения. После очистки раны в условиях операционной композицию наносят на рану.

Пример 5. Больному N выполнено хирургическое вмешательство: ревизия гнойной полости, иссечение свища, остеонекрэктомия, дренирование и пластика полости мышцей на питающей ножке. В послеоперационном периоде развилось глубокое нагноение раны с обострением гнойного воспалительного процесса, развитием сепсиса и образованием гнойных затеков. После хирургического вмешательства пункционно непосредственно в полость на дне ацетабулярной впадины вводилась композиция (по примеру 4) фибробластов в гелевой взвеси. Композиция фибробластов вводилась трижды. В результате лечения на контрольной фистулограмме на 20 сутки отмечено уменьшение полости в 2 раза и гнойного отделяемого. Перевязки стало возможным выполнять через день. Больной активизирован и выписан в удовлетворительном состоянии для лечения по месту жительства. Спустя два месяца свищ закрылся. Получена ремиссия.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что данный способ восстановления оказывается эффективным при лечении костных дефектов воспалительной этиологии.

Трансплантируемые фибробласты стимулируют процесс заживления дефекта и сами дифференцируются в клеточные элементы костной ткани.

Использование композиции позволяет ускорить наступление ремиссии и увеличить сроки ремиссии хронического заболевания. Для эффективного лечения данный композит вводится пункционно в условиях операционной, трижды с интервалом 3-10 дней.

Источники научно-технической информации

1. Безрукова А.П. Хирургическое лечение заболеваний пародонта. - Медицина, 1997, с.1-8.

2. Зуев В.П., Дмитриева Л.А., Панкратов А.С. и др. Сравнительная характеристика стимуляторов репаративного остеогенеза в лечении заболеваний пародонта. // Стоматология, 1996, - т.75, №5, с.31-34.

3. 3. Грин Г. Использование культур клеток для лечения болезней. // В мире науки. - 1992, №1, с.52-59.

4. Грудянов А.И., Ерохин А.И. Остеопластические материалы, используемые при хирургическом лечении заболеваний пародонта // Пародонтология, 1998, №1, с.13-23.

5. Грудянов А.И., Ерохин А.И., Бякова С.Ф. Применение препаратов фирмы "Geistlic" / Новое в стоматологии. - №82001, с.72-77.

6. M. Marcacci E.kon R. Cancedda, Кутепов C.M., Лавруков A.M., Мухачев В.А. Замещение костных дефектов имплантатами, насыщенными остеогенными стромальными клетками костного мозга // 2 Московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития, том 1 с.124 2003.

7. Серебряк Т.В. Колосов Н.Г. Стимуляция остеогенеза методом трансплантации эмбриональных клеток костной ткани // Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии, 2000, с.171.

8. AKIRA YAMAGUCHI, TOSHIHISA KOMORI, AND TATSUO SUDA Regulation of Osteoblast Differentiation Mediated by Bone Morphogenetic Proteins, Hedgehogs, and Cbfal // Endocrine Reviews 21 (4): 393-411.

9. R.Cancedda, R.Quarto, P.Giannoni, M.Mastrogiacomo & A.Muraglia CELL THERAPY AND BONE REPAIR // European Cells and Materials Vol.5. Suppl. 2, 2003 (pages 2-3).

10. Экспертное заключение ГИСК им. Тарасовича по результатам аттестации диплоидных клеток человека для заместительной терапии, представленных ГНЦ ВБ «Вектор» от 26.06.2003.

11. Kondo Hiroshi, Matsuda Rei, Yonezava Yumiko. In Vitro Cell. And Ved. Biol. USA. 1993. V.29, N.12. P.929-935.

12. Протокол комитета МИБП №6 от 26.06.2003.




ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ


1. Композиция для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии, содержащая питательную среду Игла MEM, 10%-ную сыворотку плодов коровы и диплоидные клетки фибробластов человека, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гелевый наполнитель, а в качестве диплоидных клеток фибробластов человека композиция содержит штамм диплоидных клеток фибробластов человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-1, зарегистрированный во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» под номером НИИМБ-265 или штамм диплоидных клеток человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2, зарегистрированный во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» под номером НИИМБ-266 при следующем содержании компонентов, 1 мл:

Суспензия диплоидных клеток фибробластов человека 1·105-5·10 7 клеток 
Питательная среда Игла MEM 0,01-0,9 
10%-ная сыворотка крови плодов коровы 0,01-0,2 
Гелевый наполнитель Остальное до 1 мл 


2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве гелевого наполнителя используют 5%-ный полиэтиленоксид.