ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНЫХ ДИСТОНИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНЫХ ДИСТОНИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ


RU (11) 2206337 (13) C1

(51) 7 A61K39/08 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 2003.06.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 2002128863/14 
(22) Дата подачи заявки: 2002.10.29 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2002.10.29 
(45) Опубликовано: 2003.06.20 
(56) Аналоги изобретения: DAS GUPTA B.R. ET AL. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. Toxicon, 1984, 32, 415-434. RU 2039571 C1, 20.07.1995. RU 2086260 C1, 10.08.1997. RU 2138288 C1, 27.09.1999. RU 2150295 C1, 10.05.1999. 
(71) Имя заявителя: Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" 
(72) Имя изобретателя: Вертиев Ю.В. 
(73) Имя патентообладателя: Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" 
(98) Адрес для переписки: 115088, Москва, Симоновский вал, 26, корп.2, кв.30, В.С. Чайкову 

(54) ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЫШЕЧНЫХ ДИСТОНИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 

Изобретение относится к медицине. Лекарственный препарат содержит ботулинический токсин, выделенный из культуры Clostridium botulinum типа А штамм 98 в виде жидкой субстанции, растворенной преимущественно в 0,87% 0,04 М раствора хлористого натрия с рН 4,9-6,9. Способ получения лекарственного препарата включает получение ботулинического токсина типа А из культуры Clostridium botulinum штамм 98 путем его культивирования при 29-30oС в течение 3-6 суток на питательной среде. Затем для образования осадка в культуральную жидкость медленно добавляют сухой аммоний сернокислый. Полученную суспензию для выделения осадка центрифугируют, а выделенную жидкую фазу экстрагируют и подвергают очистке. Процесс очистки жидкой субстанции лекарственного препарата осуществляют в два этапа, на первом из которых используют металлосорбент, преимущественно на основе никеля, а на втором этапе - ионообменный сорбент при рН 6,1-6,9. Стерилизацию очищенной субстанции производят путем мембранной фильтрации. Изобретение обеспечивает получение препарата, не теряющего активность в жидкой форме. 2 с. и 1 з.п.ф-лы. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к области медицины и касается создания препарата, предназначенного для лечения мышечных дистоний человека, таких как косоглазие, кривошея, непроизвольное мигание и т.п.

Известен из Schantz E.J., Johnson E.A. Properties and use of botulinum toxin and other neurotoxins in medicine. Microbial.Rev., 1992, 56, 80-99 лекарственный препарат и способ его получения на основе ботулина В, включающий культивирование штамма Clostridium botulinum типа В, осаждение токсина вместе с бактериальными клетками при рН 3,7, экстракцию 1 М NaCl, осаждение этанолом (конечная концентрация 15%), растворение в фосфатном буфере и последующую кристаллизацию при диализе против 0,9 М сульфата аммония. После повторной кристаллизации ботулинический токсин разводят в 0,15 М NaCl до концентрации 100Ld50/мл, добавляют сывороточный альбумин человека до концентрации 500 мкг/мл, стерилизуют и лиофилизируют.

Известный лекарственный препарат "ВОТОХ" используют для лечения мышечных дистоний.

Недостатком данного лекарственного средства является его относительно низкая активность вследствие неполной очистки последнего с одной стороны, а с другой - потеря активности в результате проведения процесса лиофилизации.

Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому эффекту являются известные из Das Gupta B.R., Sathyamoorthy V. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. Toxicon, 1984, 32, 415-434 лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, содержащий ботулинический токсин типа А, выделенный из культуры Clostridium botulinum альбумин и способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, включающие культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку с помощью ДЭАЭ-целлюлозы, стерилизацию и лиофилизацию.

Недостатками известного лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний и способа его получения является то, что он содержит в своем составе не только ботулинический токсин, который устойчив к протеолитической деградации в организме, но и ботулинический нейротоксин, который является очень чувствительным к инактивации протеолитическими ферментами, при этом он не сохраняет свою активность при хранении в жидкой форме и потому требует включения этапа лиофилизации.

Задачей изобретения является обеспечение возможности получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, содержащего ботулинический токсин типа А, который не теряет свою активность при хранении в жидкой форме.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Предложен лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, содержащий ботулинический токсин типа А, выделенный из культуры Clostridium botulinum альбумин, при этом ботулинический токсин выделен из культуры Clostridium botulinum типа А штамм 98 в виде жидкой субстанции, растворенной преимущественно в 0,87% 0,05 М растворе хлористого натрия с рН 4,9-6,9 при следующем соотношении компонентов в мг/мл:

Натрий хлористый - 0,8-1,0

10% раствор альбумина - 0,6-0,9

Субстанция ботулинического токсина - 0,000001-0,000005

Способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, выделенного из культуры Clostridium botulinum типа А, включающем культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку и стерилизацию, ботулинический токсин типа А, получают из культуры Clostridium botulinum штамм 98, культивирование которого проводят при температуре 29-33oС в течение 3-6 суток, после чего осуществляют в два этапа очистку жидкой субстанции, на первом из которых используют металлоcорбент, преимущественно на основе никеля, а на втором этапе используют ионообменный сорбент при рН 6,1-6,9, после чего проводят стерилизацию посредством мембранной фильтрации.

Штамм 98 выращивают на питательной среде, следующего состава в г/л:

Триптон - 25-33

Дрожжевой экстракт - 25-33

Тиогликолят - 0,2-0,6

Дистиллированная вода - До 1 л

Глюкоза - 4-6

2N NaOH - До рН 7,1-7,5

Для приготовления посевного материала используют замороженную маточную культуру штамма А98 Clostridium botulinum. Маточную культуру в количестве 0,5 мл засевают на триптон-дрожжевую среду, разлитую по 50 мл во флаконы емкостью 100 мл. Культуру выращивают при температуре 30oС в течение 3-5 суток. Посевной материал можно использовать для посева в течение 6 месяцев, который хранят при 4oС. Из флаконов с маточной культурой производят посев на среду ТД с целью получения нативного токсина: в 2,5 л стерильной триптон-дрожжевой среды вносят 2,5 мл посевного материала и выращивание культуры производят в термостате при температуре 30oС в течение 6 дней.

Затем определяют токсичность культуральной жидкости. Отбирают 2 пробы культуральной жидкости по 1,0 мл каждая. В обеих пробах определяют биологическую активность в ДЛМ/мл титрованием на беспородных белых мышах. Для этого препарат разводят в желатин-фосфатном буфере в соответствии с предполагаемым титром. Например, для определения титра токсина в пределах 5105 ДЛМ/мл его разводят последовательно с десятикратным интервалом до 1105 и далее 2105, 4105. Из каждого разведения одним шприцом вводят 0,5 мл токсина внутрибрюшинно двум мышам весом 16-30 г, начиная с большего разведения. Максимальное разведение токсина, вызвавшее гибель мышей в течение 4 суток, содержит 1 ДЛМ. Биологическая активность препарата равна величине разведения, умноженной на 2, и выражается в ДЛМ/мл.

На данном этапе определяют также типоспецифичность. Для этого культуральную жидкость после активации трипсином разводят до концентрации 100000 ДЛМ/мл и ставят реакцию нейтрализации на белых мышах с диагностическими противоботулиническими сыворотками А, В и Е. В 3 пробирки разливают по 1 мл приготовленного разведения культуральной жидкости с концентрацией 100000 ДЛМ/мл. В первую пробирку добавляют 1 мл диагностической сыворотки типа А, во вторую - типа В, в третью - типа Е (все сыворотки с концентрацией не менее 100 МЕ/мл). Смесь перемешивают и выдерживают 30 минут при комнатной температуре. Затем из каждой пробирки отбирают по 0,5 мл смеси токсина с сывороткой и разными шприцами вводят внутрибрюшинно двум мышам. В течение нескольких часов должны погибнуть 4 мыши, которым были введены смеси токсина с сывороткой типов В и Е, а мыши, получившие смесь токсина с сывороткой типа А, должны выжить. В этом случае токсин считается типоспецифичным. Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, строго типоспецифичен (тип А) и токсичность 1 мл раствора составляет не менее (4-7)105 ДЛМ/мл.

К полученному объему культуральной жидкости в бутыли добавляют 3N Н2SO4 до рН 3,5-4,0. Контроль рН осуществляют с помощью бумажного индикатора рН на первых этапах, а затем окончательно на рН-метре. Смесь оставляют на 2-18 ч при комнатной температуре для формирования осадка. Культуральную жидкость центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют для дальнейшей работы.

Для экстракции токсина используют 0,2 М ацетатный буфер рН 6,5-6,7, содержащий 1 М NaCl. К осадку добавляют буфер для экстракции (1/20 от исходного объема, например, к осадку от 2,5 л культуральной жидкости добавляют 125 мл буфера), суспендируют тщательно пипетированием и экстрагируют в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают. На данном этапе получают 120-135 мл препарата с активностью от 6106 до 1,2107 ДЛМ/мл.

На каждый литр надосадочной жидкости медленно добавляют 313 г сухого аммония сернокислого, тщательно перемешивая стеклянной палочкой.

Для формирования осадка раствор оставляют на 17-24 часа при температуре 5-3%, после чего препарат может быть использован для дальнейшей работы.

Препарат токсина в растворе сульфата аммония может храниться при 3-5oС в течение 2 лет.

Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в дальнейшей работе.

К осадку от 60 мл токсина добавляют 40 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,8, тщательно перемешивают стекляной палочкой до полного растворения осадка и доводят до 50 мл 50 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Препарат центрифугируют в при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают. Колонку размером 1,0х20 см заполняют 5 мл металлосорбента, преимущественно на основе никеля, и промывают 20 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,8. После чего при комнатной температуре 50 мл раствора токсина наносят на колонку с сорбентом с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/2 мин. После прохождения токсина колонку промывают 20 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,8.

Токсин элюируют с помощью 10 мл элюирующего буфера (0,05 М фосфатный буфер рН 6,5, 0,05 М NaCl, 0,02 М ЭДТА). Фракции собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки. Фракции, содержащие очищенный токсический комплекс, объединяют и используют для дальнейшей работы.

Низкомолекулярные примеси в препарате удаляют либо ионообменной хроматографией на анионообменниках, либо гель-фильтрацией. Например, колонку размером 1,0х20 см (объем колонки 5 мл) заполняют 5 мл гранулированного ионообменного сорбента DE-Sephacel и промывают 200 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,5. 10 мл раствора токсина наносят на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/1 мин. После прохождения токсина колонку промывают 30 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,5.

Токсин элюируют с помощью 20 мл 0,1 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,5. Фракции собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки. Фракции, содержащие очищенный токсин, объединяют, объем доводят с помощью 0,1 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,5 до 10 мл и помечают как очищенный ботулинический токсин типа А.

Очищенный токсин помещают в шприц и стерилизуют фильтруя через насадку с фильтром 0,22 в стерильную стеклянную пробирку в ламинарном боксе.

На данном этапе в препарате определяют белок, активность в ДЛМ на мышах, активность в LD50 и удельную активность.

Белок определяют спектроскопически при 280 нм, исходя из того, что концентрация очищенного ботулинического токсина типа А 0,1% дает поглощение 1,65 при 280 нм. Концентрация белка очищенного ботулинического токсина составляет 0,2-0,3 мг/мл.

Активность препарата в ДЛМ определяют на мышах, как описано выше. Активность очищенного препарата ботулинического токсина составляет от 3106 до 1107 ДЛМ/мл.

Активность препарата в LD50 определяют на мышах следующим образом: 1 мл препарата разводят до концентрации 1000 ДЛМ/мл и в нем определяют LD50. Активность определяют, исследуя токсичность препарата на мышах. С этой целью используют желатин-фосфатный буфер рН 6,5 и беспородных мышей, масса тела которых находится в пределах от 17 до 23 г.

Для определения Ld50 используют 2 мл препарата. К каждому 1 мл препарата добавляют 1,8 мл физиологического раствора и затем делают следующие разведения:

разведение 0: к 2,2 мл препарата добавляют 4,4 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 1: к 4,4 мл из разведения 0 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 2: к 4,4 мл из разведения 1 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 3: к 4,4 мл из разведения 2 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 4: к 4,4 мл из разведения 3 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 5: к 4,4 мл из разведения 4 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера;

разведение 6: к 4,4 мл из разведения 5 добавляют 1,45 мл желатин-фосфатного буфера.

Каждому животному вводят 0,1 мл каждого разведения внутрибрюшинно каждой мыши (в группе из не менее 6 животных). Число погибших животных регистрируется в течение 96 часов после введения препарата.

Расчет: LD50 и 95% доверительный интервал рассчитывают по методу Ашмарина-Кербера при выполнении следующих условий:

а) во всех группах должно быть одинаковое число животных,

б) в группе, которой вводили наиболее концентрированный препарат, должна наблюдаться 100% гибель животных,

в) в группе, которой вводили наименее концентрированный препарат, не должна наблюдаться гибель животных,

г) все растворы должны иметь постоянную кратность разведения.

Расчет LD50 осуществляется по формуле

m=L-d(pj-0.5),

где LD50 - разведение, при котором происходит гибель 50% животных;

m - логарифм LD50 (log LD50);

L - логарифм разведения наивысшей концентрации препарата во вводимой серии;

d - log кратности разведении;

pj - доля гибели животных в j разведении;

pj - сумма долей гибели животных.

Стандартную ошибку рассчитывают по следующей формуле:



где [pj(1-pj)] - сумма долей гибели животных при j разведении, умноженная на (1- сумма долей гибели животных при j разведении);

n - число животных на группу для испытуемой дозы.

95% интервал достоверности рассчитывают по следующей формуле:

Верхняя граница = M + (1,96 х стандартная ошибка)

Нижняя граница = М - (1,96 х стандартная ошибка)

Результаты переводятся в единицы LD50 с помощью таблиц антилогарифмов. В связи с тем что каждой мыши вводят лишь 0,1 мл раствора, значения единиц LD50 умножаются на 10, чтобы выразить результаты в единицах LD50 на 1 мл.

Активность очищенного препарата ботулинического токсина составляет от 9106 до 3107 LD50/мл.

Удельную активность препарата рассчитывают по формуле:

количество LD50/мл

Удельная активность (LD50/мг)

Удельная активность очищенных препаратов ботулинического токсина составляет от 3107 до 1108 LD50/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" или 0,05 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,5 и "Раствор альбумина 10% внутривенно". С этой целью в стерильных условиях к раствору натрия хлористого или буфера добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 500 мкг/мл: к 1194 мл раствора натрия хлористого добавляют 6 мл раствора альбумина. В стерильных условиях к 1200 мл буферного раствора добавляют расчетное количество субстанции с тем, чтобы конечная активность объема серии составляла 100 ед/мл.

Фактор разведения рассчитывают по следующей формуле:



где Х - количество мл субстанции;

Vb - объем серии препарата (мл);

Vf - объем препарата во флаконе;

Ue - количество единиц во флаконе;

Us - количество единиц/мл в Vb.

Пример расчета: если объем серии препарата составляет 1200 мл, объем препарата во флаконе - 1 мл, количество единиц во флаконе - 100, а раствор субстанции содержит 2,2106 ед/мл, то



х=0,545 мл.

Полученный конечный продукт разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл.

Операции проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе.

После розлива флаконы закрывают стерильной пробкой и закупоривают фольгой.

Полученный препарат сохраняет свою активность в течение не менее 6 месяцев при хранении при 4-8oС.

Пример осуществления способа получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний.

Состав питательной среды для культивирования штамма А98 Clostridium botulinum в г/литр: триптон - 30 г, дрожжевой экстракт - 30 г, тиогликолят - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1 л, 2N NaOH - до рН 7,3.

Приготовленную среду автоклавируют при 110oС в течение 30 мин при 0,5 атм.

Для приготовления посевного материала используют замороженную маточную культуру штамма А98 Ciostridium botulinum. Маточную культуру в количестве 0,5 мл засевают на триптоно-дрожжевую среду, разлитую по 50 мл во флаконы емкостью 100 мл. В каждый флакон перед посевом добавляют глюкозу до конечной концентрации 0,5%. Культуру выращивают при температуре 34oС в течение 4-5 суток. Посевной материал можно использовать для посева в течение 6 месяцев в случае его хранения при 4oС. Из флаконов с маточной культурой производят посев на среду ТД с целью получения нативного токсина.

Перед использованием в питательную среду добавляют 40% стерильный раствор глюкозы до конечной концентрации 0,5%. В 2,5 л стерильной триптон-дрожжевой среды вносят 2,5 мл посевного материала и выращивание культуры производят в термостате при температуре 33oС в течение 6 дней.

Отбирают 2 пробы культуральной жидкости по 1,0 мл каждая. В обеих пробах определяют биологическую активность в ДЛМ/мл титрованиом на беспородных белых мышах. Для этого препарат разводят желатин-фосфатным буфером в соответствии с предполагаемым титром. Например, для определения титра токсина в пределах 5106 ДЛМ/мл его разводят последовательно с десятикратным интервалом до 1105 и далее 2105, 4105. Из каждого разведения одним шприцом вводят 0,5 мл токсина внутрибрюшинно двум мышам весом 16-30 г, начиная с большего разведения. Максимальное разведение токсина, вызвавшее гибель мышей на 3 сутки, содержит 1 ДЛМ. Биологическая активность препарата равна величине разведения, умноженной на 2, и выражается в ДЛМ/мл.

Определение типоспецифичности проводят после определения токсичности как описано выше.

Культуральную жидкость используют в дальнейшей работе, если токсин, содержащийся в ней, строго типоспецифичен (тип А) и токсичность 1 мл раствора составляет не менее (4-7)105 ДЛМ/мл.

К полученному объему культуральной жидкости в бутыли добавляют 3N H2SO4 до рН 3,5-4,0. Контроль рН осуществляют с помощью бумажного индикатора рН на первых этапах, а затем окончательно на рН-метре. Смесь оставляют на 2-18 ч при комнатной температуре для формирования осадка.

Далее осуществляют центрифугирование, при этом перед центрифугированием осадка центрифугу и ротор охлаждают до 5-7oС. Приготавливают посуду для сливания центрифугата.

Культуральную жидкость помещают в стаканы по 500 мл и центрифугируют в среднескоростной центрифуге J2-21M/E в роторе JA-12 при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают в бутыль, а осадок используют для дальнейшей работы.

Для экстракции токсина используют 0,2 М ацетатный буфер рН 6,5 - 6,7, содержащий 1 М NaCl. Готовят 0,2 М раствор уксусной кислоты: ледяная уксусная кислота 1,13 мл, вода дистиллированная - до 100 мл. Делают навеску натрия уксуснокислого 3Н2О 27,2 г, натрия хлористого - 58 г, к которым добавляют 4 мл 0,2 М раствора уксусной кислоты и дистиллированной воды до 1 л. Величину рН буфера контролируют с помощью потенциометра.

К осадку добавляют буфер для экстракции (1/20 от исходного объема, например, к осадку от 2,5 л культуральной жидкости добавляют 125 мл буфера), суспедируют тщательно пипетированием и экстрагируют в течение 1 часа при постоянном перемешивании.

Перед центрифугированием осадка центрифугу и ротор охлаждают до 5-7oС. Приготавливают посуду для сливания центрифугата.

Суспензию помещают в центрифужные по 250 мл стаканы и центрифугируют в среднескоростной центрифуге J2-21М/Е в роторе JA-10 при 10000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают.

На данном этапе получают 120-125 мл препарата с активностью от 6106 до 1,2107 ДЛМ/мл.

Зная объем экстрагированного токсина, готовят навеску аммония сернокислого из расчета 313 г соли на литр жидкости (50% насыщения).

На каждый литр культуралькой жидкости медленно добавляют 313 г сухого аммония сернокислого, тщательно перемешивая стеклянной палочкой.

Для формирования осадка раствор оставляют на 17-24 часа при температуре 5-3oС, после чего препарат может быть использован для дальнейшей работы.

Препарат токсина в растворе сульфата аммония может храниться при 3-5oС в течение 2 лет.

Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в дальнейшей работе.

К осадку от 60 мл токсина добавляют 40 мл 0,87% раствора хлористого натрия с рН 6,8, тщательно перемешивают стеклянной палочкой до полного растворения осадка и доводят до 50 мл 50 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Суспензию центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин при 4oС. Надосадочную жидкость сливают в чистый химический мерный стакан, а осадок отбрасывают.

Далее в работе используют коммерческие колонки фирмы Ватман (Англия). Колонку размером 1,0х20 см (объем колонки 20 мл), предварительно вымытую и укрепленную в штативе, заполняют 5 мл гранулированного металлосорбента, преимущественно на основе никеля, и промывают 20 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,8. Операцию проводят при комнатной температуре.

Затем 50 мл раствора токсина наносят на колонку с сорбентом с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/5 мин. После прохождения токсина колонку промывают 20 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,8.

Токсин элюируют с помощью 10 мл элюирующего буфера (0,05 М фосфатного буфера рН 6,5, 0,05 М NaCl, 0,02 М ЭДТА). Фракции, содержащие очищенный токсический комплекс, собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки, затем объединяют и используют для дальнейшей работы.

Затем готовят 0,05 М стартового фосфатного буфера рН 6,5, буфер для ионнообменного сорбента. Для фосфатного буфера готовят исходные растворы: 0,2 М Na2HPO4 12Н2O - 71,6 г растворяют в 1 л дистиллированной воды и 0,2 М NaH2PO4 2H2O - 31,2 г растворяют в 1 л дистиллированной воды. Сливают 685 мл 0,2 М раствора NaH2PO4 и 315 мл 0,2 М раствора Na2HPO4, контролируют рН и разводят в 4 раза.

В работе используют коммерческие колонки фирмы Ватман (Англия) с ионнообменным сорбентом DE - Sephacel. Колонку размером 1,0х20 см (объем колонки 20 мл), предварительно вымытую и укрепленную в штативе, заполняют 5 мл гранулированного ионообменного сорбента DE - Sephacel и промывают 20 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,5. Операцию проводят при комнатной температуре.

Затем 10 мл раствора токсина наносят на колонку с помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мл/5 мин. После прохождения токсина колонку промывают 30 мл 50 мМ фосфатного буфера рН 6,5.

Токсин элюируют с помощью 20 мл 0,1 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,5. Фракции собирают по 1 мл в стерильные стеклянные пробирки. Фракции, содержащие очищенный токсический комплекс, объединяют объем, доводя с помощью 0,1 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,5 до 10 мл, и помечают как очищенный ботулинический токсин типа А.

Очищенный токсин помещают в шприц на 10 мл и фильтруют через насадку с фильтром 0,22 (Costar, Cambridge, NA, Саt. 8110 или Corning, NY, 1431) в стерильную стеклянную пробирку в ламинарном боксе.

Отходами производства на данной стадии являются насадка с фильтром и шприц, которые обезвреживают, заливая на сутки 6% свежеприготовленным раствором перекиси водорода, с последующим автоклавированием.

На данном этапе в лекарственном препарате определяют белок спектроскопически, активность в ДЛМ на мышах, активность в LD50 и удельную активность.

Удельная активность очищенных лекарственных препаратов ботулинического токсина составляет от 3107 до LD50/мг.

Для приготовления окончательного лекарственного препарата используют "Раствор натрия хлористого изотонический 0,9% для инъекций" производства ОАО "Восток", пос. Восточный, Кировской области или 0,05 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,5 и "Раствор альбумина 10% внутривенно" производства ГУП "Иммунопрепарат" г. Уфа. С этой целью в стерильных условиях к буферу добавляют раствор альбумина до конечной концентрации альбумина 5 мг/мл: к 1200 мл буферного раствора добавляют 6 мл раствора альбумина.

Фактор разведения рассчитывают по следующей формуле:



где X - количество мл субстанции;

Vb - объем серии препарата (мл);

Vf - объем препарата во флаконе;

Ue - количество единиц во флаконе;

Us - количество единиц/мл в Vb.

Пример расчета: если объем серии препарата составляет 120 мл, объем препарата во флаконе - 0,1 мл, количество единиц во флаконе -100, а раствор субстанции содержит 2,2106 ед/мл, то



х=0,0545 мл или 54,5 мкл.

Конечный лекарственный препарат разливают по 1 мл во флаконы объемом 5 мл, операции проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе.

После разлива флаконы закрывают стерильными пробками и закупоривают фольгой.

Полученный лекарственный препарат сохраняет свою активность в течение не менее 6 месяцев при хранении при 4-8oС. 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



1. Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний, содержащий ботулинический токсин типа А, выделенный из культуры Clostridium botulinum альбумин, отличающийся тем, что, ботулинический токсин выделен из культуры Clostridium botulinum типа А штамм 98 в виде жидкой субстанции, растворенной, преимущественно, в 0,87% 0,005 М растворе хлористого натрия с рН 4,9-6,9 при следующем соотношении компонентов, мг/мл:

Натрий хлористый - 0,8-1,0

10% Раствор альбумина - 0,6-0,9

Субстанция ботулинического токсина - 0,000001-0,000005

2. Способ получения лекарственного препарата для лечения мышечных дистоний, выделенного из культуры Clostridium botulinum типа А, включающий культивирование штамма на питательной среде, осаждение, экстракцию, очистку и стерилизацию, отличающийся тем, что ботулинический токсин типа А получают из культуры Clostridium botulinum штамм 98, культивирование которого проводят при 29-30oС в течение 3-6 суток, после чего осуществляют в два этапа очистку его жидкой субстанции, на первом из которых используют металлосорбент, преимущественно, на основе никеля, а на втором этапе - ионообменный сорбент при рН 6,1-6,9, после чего проводят стерилизацию посредством мембранной фильтрации.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культуру Clostridium botulinum типа А штамма 98 выращивают на питательной среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, тиогликолят, глюкозу и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л:

Триптон - 25-33

Дрожжевой экстракт - 25-33

Тиогликолят - 0,2-0,6

Дистиллированная вода - До 1 л

Глюкоза - 4-6

2N NaOH - До рН 7,1-7,5