ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ РЕГЕНЕРАТИВНО-РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ РЕГЕНЕРАТИВНО-РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ


RU (11) 2065445 (13) C1

(51) 6 C07K7/08, A61K38/10 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

(14) Дата публикации: 1996.08.20 
(21) Регистрационный номер заявки: 94023808/04 
(22) Дата подачи заявки: 1994.06.23 
(45) Опубликовано: 1996.08.20 
(56) Аналоги изобретения: 1. Селедцов В.И., Суслов А.Н. Иммунология. 1966, N 5, с.19- 23. 2. Rappolee D.A., Mark D., Randa M.J., Werb Z. Science. 1988, 241, p.708-712. 3. Cline M., The white cell, Harvard Univers Press, 1975, Cambridge, Massachusetts p.458-548. 4. Allison A., Ther. Contr. Inflam. Diseases. New-York, 1984, p.201-221. 5. Evans R., Fidler L., Regal and Func. Proc., 9th Int. Congr. Davis. 7-12 Febr, York-London, 1982, p.379- 384. 6. Ляшенко В.А., Дроженников В.А., Молотковская И.М., Механизмы активации иммунокомпетентных клеток, М.: Медицина, 1987, с.272. 7. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы.- Санкт-Петербург: Гиппократ, 1992. 8. Изобретения стран мира, 1987, 65, N 7, заявка N 60-91945А. 9. Изобретения стран мира, 1987, 65, N 8, заявка N 60-126088. 10. Chensue S.W., Shmir-Forsch C., Weng A., J.Leucoc. Biol., 1989, v. 46, p. 529-537. 11. Венгеровский А.И., Седых И.М., Новожеева Т.П., Саратников А.С., Патол. физиол. экспер. тер., 1990, N 2, с.37-39. 12. Саратиков А.С., Венгеровский А.И., Паульс О.В., Седых И.М. Фармакология и токсикология, 1990, т.53, N 5, с.42-43. 13. Higgins G.M., Anderson R.M., Arch Path., 1931, v.12, р.186- 202. 14. Барнаулов О.Д. Растительные ресурсы. 1981, т.17, с.462-469. 
(71) Имя заявителя: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН 
(72) Имя изобретателя: Оноприенко Л.В.; Михалева И.И.; Войтенков Б.О.; Иванов В.Т.; Окулов В.Б. 
(73) Имя патентообладателя: Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН 

(54) ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ РЕГЕНЕРАТИВНО-РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно к пептидам общей формулы: R-GLu-Leu-Lys-Pro-Leu-X-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-R', где R - СН3CO-(Ac), Ac-Glu-, Ac-Leu-Glu-Glu-, HCO-(Form), Form-Glu-, Form-Glu-Glu, Form-Leu-Glu-Glu-, CH(CH)nCO-, CH(CH)nCO-Glu-, CH(CH)nCO-Glu-Glu-, CH(CH)nCO-Leu-Glu-Glu-, n - 8 - 18, X - L-Glu, D-Glu, R' - OMe или NH2, которые являются индукторами и/или потенциаторами ростстимулирующей активности макрофагов in vitro, обладают регенеративно-репаративным действием in vivo, и могут найти применение в медицине для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся генерализованной активацией макрофагов (гепатит, токсические повреждения печени, цирроз печени, кожные раны, ожоги, политравма, диабет и др.). Предлагаемые пептиды являются относительно короткими (11, 12, 13 и 14 аминокислотных остатков) фрагментами IL-2 человека. Они получены химическим синтезом, выполненным классическими методами в растворе с использованием тактики максимальной защиты полифункциональных аминокислот и дальнейшего деблокирования и выделения в свободном виде с помощью высоко эффективной жидкостной хроматографии. Пептиды имеют защитные группировки на концах молекул, повышающие устойчивость пептидов к протеолизу и обеспечивающие благоприятные условия для создания необходимой конформации в ходе воздействия на клетки - мишени за счет нейтрализации N- и С-концевых зарядов, как это имеет место в природном белке. 12 табл., 2 ил. 


ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ



Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, конкретно к пептидам общей формулы:

R-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-X-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-R',

где R CH3CO-(Ac), Ac-Glu-, Ac-Glu-Glu-, Ac-Leu-Glu-Glu-,

HCO-(Form), Form-Glu-, Form-Glu-Glu-, Form-Leu-Glu-Glu-,

CH3-(CH2-)nCO-, CH3(CH2-)nCO-Glu-Glu-,

CH3-(CH2-)nCO-Leu-Glu-Glu-, n 8 18,

X L-Glu, D-Glu

R' OMe или NН2

которые являются индукторами и/или потенциаторами ростстимулирующей активности макрофагов in vitro, обладают регенеративно-репаративным действием in vivo и могут найти применение в медицине для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся генерализованной активацией макрофагов (гепатит, токсические повреждения печени, цирроз печени, кожные раны, ожоги, политравма, диабет и др.).

В настоящее время изучение проблемы участия иммунной системы в регуляции регенеративно-репаративных процессов позволяет сделать вывод, что конечным эффектором регуляции тканевого гомеостаза в целом, и регенеративно-репаративных процессов в частности, являются макрофаги. Они осуществляют регуляцию пролиферации и функции основных компонентов соединительной ткани, а как эффекторы непосредственно участвуют в поддержании тканевого гомеостаза путем ликвидации отработанных клеток, их обломков и других продуктов деградации ткани (1,2,3), обеспечивая тканевые элементы факторами роста и другими соединениями, необходимыми для нормального роста и функционирования ткани (4).

Макрофаг с помощью синтезируемых им биологически активных соединений осуществляют трансформацию сигналов из высших отделов системы поддержания гомеостаза к клеточным элементам тканей. С другой стороны, макрофаг способен к включению высших звеньев системы гомеостаза, синтезируя ключевые цитокины, замыкая таким образом систему обратной связи, в том числе и с центральной нервной системой [5]

Благодаря столь широкому набору свойств макрофаги вовлечены в патогенез практически всех заболеваний, и соответственно, фармакологическая модуляция их активности открывает новые возможности вмешательства в патологические процессы.

Особое место макрофаги занимают в процессах регенерации и репарации тканей, в частности при раневом процессе. К настоящему времени показано, что продукты разрушения ткани являются активаторами макрофагов (6), причем активация сопровождается последовательным включением синтеза ряда монокинов, мобилизующих основные системы поддержания гомеостаза (от центральной нервной до иммунной), а также непосредственным включением этих клеток в процесс регенерации.

Таким образом, в наборе функций макрофагов можно выделить две основные: цитотоксическую, обусловленную непосредственно эффекторными свойствами клетки, и рост-стимулирующую, в реализации которой макрофаг проявляет себя как секреторная клетка.

В последние годы стало очевидным, что, как по объему синтеза ростовых факторов, так и по их роли в различных патологиях продуктивные функции макрофагов важны в не меньшей степени, чем деструктивные. В частности, способность активированных макрофагов стимулировать рост опухолей уже является столь же хорошо доказанной, как и их способность подавлять такой рост [7]

Результаты многочисленных исследований последних лет свидетельствуют о принципиальном значении гиперактивации макрофагов в патогенезе многих заболеваний или сопутствующих им синдромов, в связи с чем начато широкое изучение ингибиторов активности макрофагов. В частности в качестве возможных препаратов рассматриваются продукты опухолевых клеток, фактор роста опухолей (TGF--)), интерлейкин-10 (IL-10), антагонисты рецепторов фактора некроза опухолей (TNF) и интерлейлкин-1 (IL-1).

В настоящее время известно значительное количество препаратов, активирующих и регулирующих цитотоксическое действие макрофагов [8] но агентов, избирательно активирующих продуктивную, рост стимулирующую активность фактически не описано.

Известно, однако, что в процессе активации многих клеток иммунной системы, в том числе и макрофагов ключевую роль играет интерлейкин-2 (IL-2) - один из центральных медиаторов иммуной системы. Кроме того, этот лимфокин вовлечен в процесс развития воспалительной реакции в случае многих вышеописанных заболеваний [9] В течение последних лет был предпринят ряд попыток воссоздать полностью или частично уникальные биологические свойства интерлейкина 2 с помощью его пептидных фрагментов.

Известен рекомбинантный IL-2 [10] полипептид, состоящий из 153 аминокислотных остатков (включая 20 аминокислот сигнального пептида) и сохраняющий полную активность природного полипептида несмотря на отсутствие углеводной части.

Известные пептиды фрагменты IL-2, состоящие из 110-120 аминокислотных остатков и обладающие ростовой активностью для лимфоцитов, полученные генно-инженерными методами [11]

В то же время коротких пептидных фрагментов, обладающих ростстимулирующей активностью IL-2, к настоящему моменту не описано.

Однако, сам IL-2, и его фрагменты, полученные генно-инженерными методами, трудно выделить и очистить до гомогенного состояния, затрудняется и контроль их чистоты и соответствия указанной формуле. Примеси, которые не удается отделить, часто отрицательно влияют на клеточные культуры (не говоря уже о живых организмах) и обнаруживают биологические функции, не свойственные самому IL-2 и его полипептидным фрагментам.

Кроме того, в некоторых случаях целесообразно выделить из всего набора разнообразных биологических свойств IL-2 человека, только одно или несколько определенных (например, рост-стимулирующее, цитотоксическое и др.). Пептидные фрагменты, обладающие такими свойствами, могли бы найти применение в медицине. Известно, что во многих случаях использование относительно коротких пептидных фрагментов предпочтительнее использования длинных белков, вызывающих аллергические реакции и другие нежелательные побочные действия, особенно, когда в распоряжении медиков имеется не природный гликозилированный белок, а его генно-инженерно полученный не гликозилированный аналог (как в случае с IL-2 и многими другими белками).

Предлагаемое изобретение относится к новым биологически активным соединениям.

Заявляемые соединения представляют собой относительно короткие пептидные фрагменты последовательности 62-72, 61-72, 60-72, 59-72 IL-2 человека:



где R CH3CO-(Ac), Ac-Glu-, Ac-Glu-Glu-, Ac-Leu-Glu-Glu-,

HCO-(Form), Form-Glu-, Form-Glu-Glu-, Form-Leu-Glu-Glu-,

CH3-(CH2-)nCO-, CH3-(CH2-)nCO-Glu-, CH3-(CH2-)nCO-Glu-Glu-,

CH3-(CH2-)nCO-Leu-Glu-Glu-, n 8 18,

X L-Glu, D-Glu

R'- OMe или NH2,

состоящие из 11, 12, 13 и 14 аминокислотых остатков, которые можно получить с помощью химического синтеза и легко выделить в свободном виде и очистить до гомогенного состояния.

Заявляемые пептиды это уникальные модуляторы активности макрофагов in vitro, индуцирующие и/или потенциирующие ростстимулирующее действие преактивированных макрофагов, практически полностью подавляя при этом их цитотоксическую активность.

Заявляемые вещества, обладают регенеративно-репаративным действием in vivo, причем по отношению к нестимулированным макрофагам они совершенно инертны, что делает их особенно привлекательными для медицинского применения для лечения ряда заболеваний, сопровождающихся генерализованной активацией макрофагов.

Заявляемые пептиды наиболее короткие из всех ранее известных фрагментов IL-2 человека, способных проявлять один из видов многообразной активности IL-2.

Блокирование ацетильной или алкильной защитной группировкой на N-конце и метиловым эфиром или амидом на С-конце молекулы увеличивает устойчивость пептидов к протеолизу, а также обеспечивает более благоприятные условия для создания необходимой конформации в ходе воздействия на клетки-мишени, нейтрализуя заряды на концах молекул, как это имеет место в природном белке.

Предлагаемые пептиды получают классическими методами пептидного синтеза в растворе по схеме 1-2, включающий в себя конденсацию двух защищенных пептидных блоков, выбранных таким образом, чтобы активируемый в ходе конденсации блок имел на С-конце практически не рацемизующийся в этих условиях остаток пролина. Для блокирования боковых цепей остатков Glu и Lys были выбраны защиты бензильного типа; для Na-функции трет. бутилоксикарбонильная группировка (Вос); для Сa-функции метиловый эфир (OMe).

Синтез каждого из фрагментов осуществляют последовательным наращиванием цепи с С-конца методами пента-фторфениловых и п.-нитрофениловых эфиров.

Вос-защитные группы удаляют с помощью смеси уксусной и трифторуксусной кислот в соотношении 3:7, в этих условиях побочная реакция отщепления Z-группы с Ne-функции Lys не имела места.

Защищенные пептиды очищают адсорбционной хроматографией на силасорбе (Silasorb 600; 30 мкм, Chemapol, ЧССР) в градиенте растворителей этилацетат: этанол, а также кристаллизацией. Их индивидуальность и чистоту контролируют тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленным слоем силикагеля (Merck, ФРГ) и аминокислотным анализом (на приборе Durrum, США).

Защищенные ундека-, додека-, тридека- и тетрадекапептид получают конденсацией блоков (4+7, 5+7, 6+7 и 7+7) соответственно с помощью 4-толуолсульфоната N-циклогексил-N'-2-(N-метилморфолино)-этилкарбодиимида в присутствии 1-оксибензотриазола, причем используют 1,1-кратный избыток активируемых тетра-, пента-, гекса-, гептапептидов.

Введение ацетильной группы осуществляют после удаления Na-Вос-защиты с помощью уксусного ангидрида. Удаление боковых защитных групп проводят НВr/СН3COOH или трифторметансульфокислотой в присутствии анизола. Полученные продукты подвергают очистке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке SynChropak RP-4 (250x 21,2 мм, SynChrom, Inc.).

Чистоту конечных продуктов контролируют данными тонкослойной хроматографии (см. табл. 1), аминокислотного анализа (см. табл.2.) FAB-масс-спектрометрические и 1HЯМР-исследования подтверждают соответствие пептидов указанным формулам.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приводятся примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение целевого продукта (XVII)

а. Получение Вос-Asn-Leu-OMe (I). 10 г (0,055 моль) HCl-Leu-OMe растворяют в 35 мл диметилформамида, прибавляют 6,00 мл (0,055 моль) N-метилморфолина, 7,26 г (0,55 моль) 1-оксибензотриазола и 20,00 г (0,057 моль) Вос-Asn-ONp. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 24oС, упаривают до объема 10 мл и выливают в 1 л 2% H2SO4 при перемешивании. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 2% Н2SO4, водой, нас. раствором КНСО3, снова водой, смесью растворителей эфир-метанол (5:1, 50 мл), этанолом (100 мл). Выход дипептида (I) 18 u (91%).

б. Получение Вос-Leu-Asn-Leu-OMe (II).

18,00 г (0,050 моль) Вос-Asn-Leu-OMe растворяют в 200 мл смеси уксусной и трифторуксусной кислот (3:7), выдерживают 1,5 часа при 20oС, упаривают под вакуумом, остаток кристаллизуют из гексана, промывают эфиром (500 мл). Выход трифторацетата (Iа) 18,65 г (количественный).

18,65 г (0,050 моль) трифторацетата (Iа) растворяют в 100 мл диоксана, прибавляют 5,49 мл (0,050 моль) N-метилморфолина, 6,80 г (0,050 моль) 1-оксибензотриазола, 19,38 г (0,055 моль) Вос-Leu-ONp. Реакционную смесь интенсивно перемешивают 1 ч при 20oС, прибавляют 100 мл диметилформамида, снова перемешивают 12 ч при 20oС. Диоксан упаривают, остаток разбавляют 2% раствором H2SO4 до объема в 1,5 л. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре последовательно: 2% раствором H2SO4 (200 мл); водой (500 мл); нас. раствором NaHCO3 (250 мл); водой (500 мл). Осадок высушивают под вакуумом и промывают 50 мл смеси метанол-эфир (1:5) и 200 мл этанола, снова высушивают под вакуумом. Выход трипептида (II) 18,34 г (63%).

Соединения (III), (IV), (V), (VI) получают как в п.б, выходы реакций и физико-химические характеристики см. табл.1 и 2.

в. Получение Вос-Lys(Z)-Pro-OH (VII)

6,9 г (60,0 ммоль) Pro растворяют в 14 мл пиридина, прибавляют 6,6 мл (60,0 ммоль) N-метилморфолина. 16,4 г (30,0 ммоль) Вос-Lys(Z)-OPfp и 4,0 г (30,0 ммоль) НОВt растворяют в диоксане и прибавляют к реакционной смеси по каплям в течение 2 часов при 10oС при энергичном перемешивании. После этого реакционную смесь перемешивают еще 12 ч при 25oС, выливают 1,5 л 2%-ного раствора Н2SO4. Выпавшее масло экстрагируют этилацетатом, этилацетатный слой промывают 2%-ным раствором Н2SO4, (3300 мл), водой, высушивают над Na2SO4, осушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 20 мл нас. раствора KHCO3, промывают эфиром. Водный слой подкисляют лимонной кислотой до рН 5, выпавшее масло экстрагируют этилацетатом, этилацетатный слой промывают водой, высушивают над Na2SO4. Осушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток хроматографируют на колонке (35100 мм) с силасорбом 600, используя элюцию в градиенте растворителей этилацетат этанол с 10% уксусной кислоты. Выход депептида (VII) 10,7 г (75%).

г. Получение Вос-Leu-Lys(Z)-Pro-OH (VIII).

10,7 г (22,0 ммоль) дипептида (VII) растворяют в 50 мл смеси уксусной и трифторуксусной кислот (3: 7), охлажденной до 10oС, выдерживают 30 мин при 20oС, упаривают под вакуумом при 30oC, остаток промывают гексаном, высушивают под вакуумом. Выход трифторацетата (VII) 10,8 (количественный).

10,8 г (22,0 ммоль) трифторацетата (VIIa) растворяют в 20 мл диоксана, прибавляют 4,8 мл (44,0 ммоль) N-метилморфолина, 11,9 г (30,0 ммоль) Вос-Leu-OPfp. Реакционную смесь перемешивают 20 ч при 25oC, выливают в 1,5 л 2%-ного раствора Н2SO4, диоксан упаривают, остаток растворяют в этилацетате и промывают последовательно 2%-ным раствором Н2SO4 (100 мл); водой (300 мл); нас. раствором NaCl с 10% NaHCO3 (150 мл); водой (300 мл), высушивают над Na2SO4 осушитель отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток высушивают в вакууме. Выход трипептида (VIII) 12,3 г (95%).

Соединения (IX), (X), (XI), (XII) получают как в п. г, выходы реакций и физико-химические характеристики см. табл.1 и 2.

д. Получение Вос-Leu-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Pro-Leu-Glu(OBzl)- Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XIII).

114 мг (0,10 ммоль) трифторацетата (VIa); 204 мг (0,15 ммоль) гептапептида (ХII); 22 мг (0,16 ммоль) НOBt растворяют в 1 мл диметилформамида, прибавляют 11 мкл (0,10 ммоль) N-метилморфолина, при перемешивании охлаждают до -10oС и прибавляют охлажденный до 0oС раствор 42,4 мг (0,10 ммоль) 4-толуолсульфоната N-циклогексил-N'-2-(N-метилморфолино)-этилкародиимида в 200 мкл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 1 час при 0 x -5oС, 12 ч при 20oС, затем снова охлаждают до -10oС и прибавляют охлажденный до 0oС раствор 20 мг (0,047 ммоль) 4-толуолсульфоната N-циклогексил-N'-2-(N-метилморфолино)-этил-карбодиимида в 100 мкл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при -5oС и 48 ч при 20oС, разбавляют 2% Н2SO4 в 10 раз. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 2% Н2SO4 (3x6 мл), водой, нас. NaHCO3, водой, высушивают в вакууме, промывают этилацетатом (10 мл), этанолом (10 мл), снова высушивают в вакууме. Выход тетрадекапептида (XIII) 150 мг (64%).

Ундекапептид (XIV) получают конденсацией двух защищенных фрагментов тетрапептида (IX) и гептапептида (VIa) аналогично получению тетрадекапептида (XIII), см.пункт д.

Додекапептид (XV) получают конденсацией двух защищенных фрагментов пентапептида (X) и гептапептида (VIa) аналогично получению тетрадекапептида (XIII), см. пункт д.

Тридекапептид (XVI) получают конденсацией двух защищенных фрагментов гексапептида (XI) и гептапептида (VIa) аналогично получению тетрадекапептида (XIII), см. пункт д.

e. Получение Ac-Leu-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Pro-Leu-Glu-(OBzl)-Glu( OBzl)-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XIIIa).

88 мг (0,037 ммоль) тетрадекапептида (XIII) растворяют в 3 мл смеси уксусной и трифторуксусной кислот (3:7), выдерживают 1,5 ч при 20oС, упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира, промывают эфиром (50 мл), высушивают под вакуумом. Выход трифторацетата тетрадекапептида (XIII) 88 мг (количественный).

88 мг (0,037 ммоль) трифторацетата тетрадекапептида (XIII) растворяют в 2 мл трифторэтанола, прибавляют 8,0 мкм (0,074 ммоль) N-метилморфолина 352 мкл (0,37 ммоль) уксусного ангидрида. Реакционную смесь выдерживают 30 мин при 20oС, растворитель упаривают, остаток промывают водой (10 мл), высушивают под вакуумом. Выход тетрадекапептида (XIIIa) 86 мг (99%).

Ундека(XIVa), додека- (XVa), тридекапептиды (XVIa) получают как описано в п. е. деблокированием с последующим ацетилированием ундека- (XIV) додека- (XV) и тридекапептида (XVI) соответственно.

ж. Получение Pal-Leu-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu-(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Pro-Leu-Glu(OBzl)- Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XIIIб).

50 мг (0,021 ммоль) трифторацетата тетрадекапептида (XIII) растворяют в 1,5 мл свежеперегнанного, безводного диметилформамида, прибавляют при перемешивании 2,31 мл (0,021 ммоль) N-метилморфолина и 31,89 мл (0,105 ммоль) пальмитоилхлорида (Pal-Cl). В течение 1 ч к реакционной смеси прибавляют порциями, при интенсивном перемешивании 4,62 мл (0,042 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь выдерживают при перемешивании 1 ч при 25oС, деметилформамид упаривают, остаток промывают гексаном, водой, высушивают в вакууме. Выход тетрадекапетида (XIIIб) 49,64 мг (94%).

з. Получение Form-Leu-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Leu- Lys(Z)-Pro-Leu-Glu(OBzl)-Val-Leu-Asn-Leu-Ome (XIIIв).

100 мг (0,42 ммоль) трифторацетат тетрадекапептида (XIII) растворяют в трифторэтаноле, прибавляют 46,2 мкл (0,42 ммоль) N-метилморфолина, выдерживают 15 мин, трифторэтанол упаривают. Остаток высушивают досуха в вакууме, растворяют в 882 мкл 98% муравьиной кислоты, охлаждают до 0 5oC и прибавляют 294 мкл (3,11 ммоль) уксусного ангидрида порциями по 3 мкл в течение 1 ч. Реакционную смесь выдерживают при перемешивании 1 ч при 0oС и 48 ч при 25oС. Муравьиную кислоту упаривают, остаток промывают эфиром (210 мл), водой (310 мл), высушивают в вакууме. Выход тетрадекапептида (XIIIв) 82,21 мг (85%).

и. Получение Ac-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XVIIa).

86 мг (0,037 ммоль) тетрадекапептида (XIIIa) растворяют в HBr/AcOH (37), выдерживают 1 ч при 25oC, упаривают при t не выше 35oС, многократно промывают эфиром, высушивают в вакууме, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ на колонке SynChropak RР-4 (250x21,2 мм, SynChrom, Inc.). Выход тетрадекапептида (XVII) 27 мг (43%).

к. Получение Ac-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XVIIa).

92 мг (0,040 ммоль) тетрадекапептида (XIIIa) растворяют в 400 мкл TFA, прибавляют 12 мкл (0,114 ммоль) анизола и 17 мкл (0,190 ммоль) трифторметансульфокислоты, выдерживают 1 ч при 25oС. TFA удаляют в вакууме при t не выше 35oС, остаток многократно промывают эфиром, высушивают в вакууме, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ на колонке SynChropak RР-4 (250x21,2 мм, SynChrom, Inc.). Выход тетрадекапептида (XVII) 37 мг (53%).

Ундека- (XVIII), додека- (XIX), тридекапептиды (XX) получают деблокированием защищенных пептидов (XIVa), (XVa), (XVIa) соответственно, как описано в п.и. или к.

л. Получение Ac-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-NH2 (XXI).

27 мг (0,016 ммоль) тетрадекапетида (XVIIa) растворяют в метаноле, насыщенном аммиаком (безв.), выдерживают в вакууме (10 мм рт.ст.) при 25oC в течение 48 ч, метанол удаляют в вакууме (t не выше 30oС), остаток растворяют в воде и лиофилизуют. Выход тетрадекапептида (XXI) 27 мг (количественный).

м. Получение Form-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XVIIв).

80,0 мг (0,035 ммоль) тетрадекапептида (XIIIв) растворяют в 2 мл трифторэтанола, прибавляют при перемешивании 50 мкл муравьиной кислоты, 197 мкл (2,1 ммоль, 60 экв) 1,4-циклогексадиена и свежеприготовленную палладиевую чернь. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 25oС, катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток промывают эфиром (315 мл), этилацетатом (315 мл), растворяют в воде, подвергают очистке с помощью ВЭЖХ на колонке SynChropak RP-4 (250x21,2 мм, SynChrom, Inc. ). Выход тетрадекапептида (XVIIв) 41,30 мг (69%).

н. Получение Pal-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XVIIб).

Тетрадекапептид (XVIIб) получают деблокированием защищенного пептид (XIII) как описано в п. и или к. Выход и константы полученного тетрадекапептида (XVIIб) приведены в табл.1 и 2.

Получение Ac-Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-D-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-OMe (XXII).

Тетрадекапептид (XXII) получают аналогично тетрадекапептиду (XVIIa) за исключением того, что на стадии синтеза гексапептида (V) вместо Boc-Glu(OBzl)-ONp к трифторацетату пентапептида (IVa) присоединяют Boc-D-Glu-(OBzl)-ONp. Выход и константы полученного тетрадекапептида (XXII) приведены в табл.1 и 2.

Пример 2. Определение рост-стимулирующей активности перитонеальных макрофагов.

Рост-стимулирующую активность перитонеальных макрофагов определяют при посадке клеток-мишеней в концентрации субоптимальной для спонтанной пролиферации, которая составляет 103 клеток на мл.

Все пептиды препараты: С-1-3, С-1-4, С-1-5 и С-1-6 (соответствие химическим формулам см. в табл.12) растворяют в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл, непосредственно перед исследованием стерилизуют путем фильтрации и разводят в полной культуральной среде в концентрациях: 200 мкг/мл, 20 мкг/мл, 2 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,02 мкг/мл, 0,02 мкг/мл, 0,002 мкг/мл.

Перитонеальные макрофаги получают от мышей BALB/c и СЗН разводки питомника Рапполово путем промывания брюшной полости средой Хэнкса при t 4oС (12). Макрофаги и моноциты человека выделяют из периферической крови путем отбора ее из локтевой вены, у 14 практически здоровых доноров.

Полученную взвесь клеток пулируют от 3-4-х доноров соответствующей группы, после чего дважды отмывают средой Хэнкса (по 10 мин), ресуспендируют, окрашивают по Романову-Гимзе и подсчитывают в гемоцитомере количество прилипших (распластанных), окрашенных клеток после инкубации в течение 15 мин при t 37oС в атмосфере 98% влажности, содержащей 5% CO2 (газопроточный инкубатор ГПИ-01, экспериментальный завод аналитического машиностроения, г. Ломоносов). Полученную взвесь клеток доводят до концентрации 5- 105/мл (по распластанным, окрашенным клеткам) в среде Хэнкса, высеивают в лунки 96-луночного планшета (NUNC, Дания) в количестве 5x104 клеток/лунку. Планшеты инкубируют в газопроточном инкубатоpе в течение 2 ч, затем монослой моноцитов или макрофагов трижды отмывают средой Хэнкса при t 37oC от неприлипших клеток с последующим добавлением питательной среды Игла с 10% сыворотки крупного рогатого скота, 3% раствором L-глютамина (1 мл) и антибиотиками (пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл).

Для постановки экспериментов по оценке влияния препаратов на способность макрофагов производить факторы роста для клеток-мишеней макрофаги в концентрации 5x105 клеток/мл инкубируют в присутствии препаратов (в указанном выше диапазоне доз в течение 24 ч, в полной культуральной среде. Затем макрофаги трижды отмывают, в каждую лунку, содержащую макрофаги, добавляют среду Игла без сыворотки (200 мкл) и после 18 ч инкубации в стандартных культуральных условиях культуральную среду собирают и хранят при t -70oС до использования.

Клетки-мишени (клетки миеломы мышей РЗХ63-Аг/8, В-16 или эритромиелоидная линия клеток К-562) помещают в лунки 96-луночного планшета в концентрации 104 клеток/мл, по 100 мкл в лунку. В контрольные культуры добавляют по 100 мкл среды Игла, в опытные по 100 мкл супернатантов интактных макрофагов или макрофагов, преинкубированных с исследуемыми пептидами. В качестве положительного контроля используют сыворотку крупного рогатого скота (конечная концентрация 512). Клетки-мишени инкубируют в течение 48 ч, после чего к ним добавляют по 10 мкл 3Н-тимидина с удельной активностью 1,0 мкКюри/мл. Через два часа клетки снимают харвестером и содержание включенного изотопа определяют на жидкостном сцинтилляторном счетчике (Дельта, США). Влияние супернатантов определяют по формуле: (О-К)/К100, где O - средний уровень включения изотопа в три параллельные культуры клеток в присутствии соответствующей дозы препарата, а К тот же показатель у клеток без добавления препарата и сравнивают с влиянием сыворотки и эффектом нестимулированных макрофагов.

Результаты эксперимента, представленные в табл.3, 4 и 5 свидетельствуют, что исследованные пептиды С-1-3, С-1-4, С-1-5, С-1-6 проявляют способность ингибировать цитотоксичность и индуцировать сильную рост-стимулирующую активность преактивированных макрофагов, причем наиболее ярко эти свойства проявляет пептид, обозначенный как С-1-6.

Пример 3. Изучение влияния синтетических пептидов С-1-3, С-1-4, С-1-5, С-1-6 на регенеративно-репаративные процессы в печени.

Наиболее изученными экспериментальными моделями регенерации репарации печени являются восстановление после частичной гепатэктомии или токсического повреждения. Важно отметить, что эти модели позволяют анализировать не только регенеративный процесс (пролиферацию клеток, направленную на возмещение дефекта в результате операции или токсического повреждения), но и репаративный процесс (восстановление физиологических функций органа).

В работе используют белых мышей-самцов линии НР массой 22-25 г и белых беспородных крыс-самцов массой 180-200 г. Исследуемые пептиды вводят внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора в течение 3 дней, начиная через 36-40 ч после токсического повреждения или за три дня до гепатэктомии.

а. Изучение регенеративно-репаративных свойств синтетических пептидов С-1-3, С-1-4, С-1-5, С-1-6 на модели токсического повреждения печени.

Токсическое повреждение печени осуществляют однократным подкожным (в шейную складку) введением тетрахлорметана в виде 50% раствора в оливковом масле, в дозах 5 и 7,5 мл/кг веса. Известно, что сам CCl4 нетоксичен, но в микросомальных системах печени, осуществляющих детоксикационную функцию, метаболизируется в течение 24-36 часов с выделением свободных радикалов, повреждающих паренхиму органа в местах их образования (13,14). Поэтому исследуемый пептид начинают применяют через 40 ч после инъекции гепатотоксина и вводят в течение 3-х дней в дозах, указанных выше.

Эффективность исследуемых препаратов оценивают по их влиянию на длительность тиопенталового наркоза. Тиопентал барбитурат короткого действия, который метаболизируется исключительно в микросомальных системах гепатоцитов. Считают, что длительность тиопенталового наркоза, наряду с функциональной бромсульфолеиновой пробой, является адекватным интегральным критерием, позволяющим оценить функциональное состояние гепатоцитов. Тиопентал в эмпирически подобранной дозе 31-34 мг/кг при введении мышам внутривенно, в латеральную вену хвоста, вызывает у интактных животных наркотический сон длительностью 3-4 мин. Введение тиопентала осуществляют через сутки после последней инъекции исследуемых пептидов. О продолжительности наркотического сна судят по длительности бокового положения животных.

Для математической обработки полученных экспериментальных данных используют общепринятые методы параметрической и непараметрической статистики.

Все исследования пептиды, а особенно эффективно С-1-6, продемонстрировали способность быстро восстанавливать функцию печени в условиях ее повреждения CCl4 практически до интактного уровня (см. табл.6).

Для уточнения доза-зависимого характера действия наиболее эффективного из исследованных препаратов (С-1-6) его вводят по вышеописанной схеме в дозах: 0,5; 2,5; 12,5; 62,5 мг/кг. Гепатозащитный эффект максимален для пептида в дозе 0,5 мг/кг веса и дальнейшее увеличение дозы в 5, 25 и 125 раз не изменяют его (см. табл.7).

Для анализа механизмов гепатозащитного действия С-1-6 изучают его влияние на активность гепатоспецифических ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, а также на белоксинтезирующую функцию печени. Активность ферментов и содержание общего белка в крови определяют колориметрически на биохимическом анализаторе Expren-550 с использованием стандартных коммерческих наборов Ciba Corning (15).

По изменению уровня ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы в вышеописанном эксперименте определяют степень поврежденных гепатоцитов (см. табл.8). В случае повреждения печени уровень этих ферментов в крови значительно увеличивается за счет их выхода в кровь через поврежденную мембрану гепатоцитов. В данном эксперименте у животных контрольной группы содержание аланин- и аспартатаминотрансферазы было повышено в 1,8 и 4,5 раза соответственно. На фоне трехдневного лечебного применения С-1-6 уровень ферментов снижается на 36 и 41% соответственно. Содержание лактатдегидрогеназы снижается до уровня интактных животных, при увеличении в контрольной группе на 73% Эти результаты свидетельствуют о репаративном действии препарата С-1-6 на поврежденные мембраны гепатоцитов.

В ходе эксперимента измеряют также содержание общего белка в крови - показателя белоксинтезирующей функции гепатоцитов. Под действием CCl4 содержание общего белка достоверно снижается до 4,1 г/л,

в то время как при введении животным С-1-6 оно нормализуется и составляет 68,42,9 г/л.

Таким образом, очевидно, что препарат С-1-6 обладает выраженным стимулирующим влиянием на репаративные процессы в печени.

б. Изучение влияния синтетического пептида С-1-6 на процессы регенерации.

Для изучения влияния С-1-6 на процессы регенерации используют классическую модель частичной гепатэктомии по методу (16). Препарат в дозе 2,0 мг/кг вводят в течение 3-х дней до операции. Печень для гистологического исследования берут через 24 или 48 ч после операции, фиксируют в 20% формалине и окрашивают гематоксилин-эозином. Метотический индекс подсчитывают на 3000 гепатицидов и выражают в промилле. В некоторых экспериментах определяют влияние С-1-6 на индекс меченных ядер гепатоцитов. Для этого крысам за 1 ч до забоя вводят 3H-тимидин. Включение изотопа оценивают авторадиографически.

Митотический индекс и индекс меченых ядер показатели, характеризующие состояние печени, в контрольной группе животных через 24 ч после гепатэктомии увеличиваются по сравнению с интактными животными на 20 и 24% соответственно, а через 48 ч снижаются до 14 и 10% от интактного уровня соответственно. При введении С-1-6 наблюдают снижение обоих показателей через 24 ч после гепатэктомии (т.е. торможение регенерации) и последующее их увеличение через 48 ч в 2,5 и 2 раза по сравнению с контролем соответственно. Причем в первые 24 ч после гепатэктомии наблюдают значительное накопление в клетках гликогена основного энергетического субстрата гепатоцитов по сравнению с контролем (см. табл.9).

Полученные данные позволяют предположить, что в первые сутки после гепатэктомии С-1-6 способствует мобилизации углеводных ресурсов в гепатоцитах, что обеспечивает ускорение пролиферации на более поздних стадиях восстановления печени, и наблюдаемый на фоне С-1-6 более поздний пик пролиферации биологически обусловленный адаптивный процесс, являющийся следствием стимуляции функциональной активности гепатоцитов в условиях выраженной печеночной недостаточности.

в. Изучение влияния препарата С-1-6 на заживление полнослойных кожных ран у мышей.

При изучении влияния препарата на заживление полнослойных кожных ран у мышей используют методику, предложенную О.Д.Барнауловым (17). Под гексеналовым наркозом (80 мг) внутрибрюшинно круглым штампом диаметром 9 мм наносят на деэпилированную кожу послойное поражение и расправляют его, придавая округлую форму. Струп, образующийся на поверхности раны, снимают на 4 день. Затем, через день до 13-х суток, а далее ежедневно до конца опыта. Эта процедура, с одной стороны, за счет повторных травматизаций увеличивает сроки заживления ран, а, с другой стороны, при местном применении улучшает контакт препарата с поверхностью раны. Препарат С-1-6 вводят внутрибрюшинно или местно с 1 по 10 день после операции в дозе 2,5 мг/кг веса тела. При оценке эффективности препарата учитывают площадь ран (условно принимая ее равной произведению продольного и поперечного диаметров), а также количество мышей в группе, раны которых к данному сроку полностью заживают.

Изучение влияния С-1-6 на регенерацию полнослойных кожных ран проводят при периферическом и внутрибрюшинном введении in vivo, причем применяют действующие концентрации в 20 раз ниже, чем в случае стандартных препаратов такого действия. Хотя процесс заживления ран протекает гораздо медленнее, чем восстановление печени, при введении препарата С-1-6 наблюдается значительное ускорение процесса регенерации, особенно при периферическом введении (см. табл. 10). Одной из причин относительного запаздывания стимулирующего эффекта С-1-6 является тот факт, что при нанесении полнослойных кожных ран количество макрофагов в зоне дефекта определяется лишь степенью кровоснабжения поврежденного участка кожи. Капиллярная сеть в печени более развита, чем в коже и удельный кровоток значительно выше, что создает условия для более интенсивной миграции макрофагов в зоне повреждения.

Таким образом, препараты осуществляют индукцию ростстимулирующей активности макрофагов, как in vitro, так и in vivo. Их биологический эффект опосредован стимуляцией макрофагов, выделяющих ряд факторов роста, которые, в свою очередь стимулируют процессы регенерации и репарации. Из представленных данных можно заключить, что исследованные пептиды С-1-3 С-1-6 обладают ярко выраженной иммуномодулирующей активностью и могут найти широкое применение в медицине при лечении различных поражений печени, полнослойных кожных ран.

г. Изучение острой токсичности.

При изучении острой токсичности определяют влияние препарата на общее состояние животных в поведенческих тестах, гематологические и биохимические показатели крови, просудорожную активность препарата.

Изучение острой токсичности проводят в течение 10 дней в поведенческих тестах: открытое поле, аудиогенные судороги и психотическая реакция (тест climbing) на половозрелых самцах и самках мышей F1-СВА/Black весом 200,8 г. Животных содержат группами по 5 штук со свободным доступом к пище и воде при искусственном освещении с длительностью световой и темновой фаз по 12 ч. Формируют 4 группы по 10 животных в каждой (5 самок и 5 самцов):

1. Контрольная группа, животные которой 1 раз за 20 мин до начала первого поведенческого тестирования получали внутрибрюшинно инъекцию физиологического раствора Dulbecco в объеме 0,5 мл для мышей весом в 20 г.

2,3 и 4 группы получают однократно внутрибрюшинно инъекции препарата С-1-6 в дозе 250 мг/кг, 25 мг/кг, 2,5 мг/кг соответственно в объеме 0,5 мл за 20 мин до начала первого поведенческого тестирования. Наблюдение за поведением продолжают 4 мин, причем на последней отключают освещение. Оценивают горизонтальную (по числу пересеченных квадратов) и вертикальную (по числу подъемов на задние лапы) активности, являющиеся показателем двигательной и ориентировочной активности соответственно. Определяют число пересечений животным центра поля, позволяющее оценить уровень реакции тревоги и страха. Учитывают время груминга и число загрязнений в норки, показатели, отражающие возбуждение и уровень стрессированности животного.

Проведенное экспериментальное тестирование поведенческих эффектов разных доз препарата С-1-6 показывает, что:

наиболее выраженной активностью на поведение обладает доза 2,5 мг/кг, предлагаемая как терапевтическая,

препарат обладает некоторым возбуждающим действием с индукцией элементов психотической реакции на фоне снижения исследовательско-ориентировочной реакции и двигательной активности,

самцы в большинстве тестов более чувствительны к действию препарата, чем самки,

препарат не обладает просудорожной активностью,

для большинства поведенческих показателей эффекты препарата С-1-6 кратковременные и исчезают к 3-му дню после его введения.

В процессе изучения острой токсичности определяют также влияние препарата С-1-6 на биохимические и гематологические показатели крови лабораторных крыс при ежедневном внутрибрюшинном введении в течение недели в дозах 1 и 10 терапевтических (см. табл.11). Также проводят патоанатомическое исследование и патоморфологическое изучение образцов печени.

Таким образом не обнаружено токсического действия препарата по всем исследованным параметрам даже в дозе в 250 раз превышающей терапевтическую, что указывает на большую терапевтическую широту препарата С-1-6 (табл.12). ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7 


ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ



Пептиды общей формулы:

R-Glu-Leu-Lys-Pro-Leu-X-Glu-Val-Leu-Asn-Leu-R',

где

R CH3CO-(Ac), Ac-Glu, Ac-Glu-Glu, Ac-Leu-Glu-Glu-, HCO-(Form), Form-Glu-, Form-Glu-Glu, Form-Leu-Glu-Glu-, CH3(CH2)nCO-, CH3(CH2)nCO-Glu-, CH3(CH>2)nCO-Glu-Glu-, CH3(CH2)nCO-Leu-Glu-Glu-, n 8-18;

X L-Glu, D-Glu; R' OMe или NH2, обладающие регенеративно-репаративным действием.