СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИКА

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИКА


RU (11) 2280465 (13) C2

(51) МПК
A61K 35/74 (2006.01)
A23C 9/12 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/225 (2006.01)
C12R 1/25 (2006.01) 

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 
Статус: по данным на 17.09.2007 - действует 

--------------------------------------------------------------------------------

Документ: В формате PDF 
(14) Дата публикации: 2006.07.27 
(21) Регистрационный номер заявки: 2004131097/13 
(22) Дата подачи заявки: 2004.10.25 
(24) Дата начала отсчета срока действия патента: 2004.10.25 
(45) Опубликовано: 2006.07.27 
(56) Аналоги изобретения: Методические рекомендации. Применение молочного лактобактерина в лечении заболеваний, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника. - Горький, 1980, с.7-8. RU 2192269 C2, 10.11.2002. RU 2060673 C1, 27.05.1995. JP 6056679, 01.03.1994. US 2002015990, 07.02.2002. КОРОЛЕВА Н.С. КОНДРАТЕНКО М.С. Симбиотические закваски термофильных бактерий в производстве кисломолочных продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1978, с.105-148. 
(72) Имя изобретателя: Соловьева Ирина Владленовна (RU); Соколова Кира Яковлевна (RU); Ефимов Евгений Игоревич (RU); Иванова Татьяна Петровна (RU); Точилина Анна Георгиевна (RU); Белова Ирина Викторовна (RU) 
(73) Имя патентообладателя: Федеральное государственное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н.Блохиной" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU) 
(98) Адрес для переписки: 603950, г.Нижний Новгород, ул. Грузинская, 44,ФГУН ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, патентный отдел 

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИКА
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления биологически активных добавок и продуктов функционального питания на основе живых бактерий. Способ предусматривает внесение штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L. plantarum 8 PA 3 в питательную среду, совместное их культивирование на питательной среде, содержащей разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока, раффинозу, дрожжевой автолизат, агар-агар. Культивирование ведут в два этапа. На первом этапе разведенные в питательной среде штаммы соединяют в соотношении 1:1, культивируют 24 ч при 37°С. На втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000. Продолжают культивирование в течение 24 ч при той же температуре. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность бактерий, их антагонистическую активность и выход биомассы. 2 ил., 2 табл. 




ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ


Изобретение относится к лечебно-пищевой биотехнологии и может быть использовано для приготовления биологически активных добавок и продуктов функционального питания на основе живых бактерий.

Широко известны препараты, направленные на восстановление нормального биоценоза кишечника, в частности эубиотики - бактерийные препараты из живых микроорганизмов - представителей облигатной микрофлоры кишечника, это колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол и т.п. сухие препараты (см. книгу под ред. В.А.Княжева. Дисбактериозы. Теория и практика. Нижний Новгород, 1999, с.70-73).

При всех положительных качествах этих препаратов: длительный срок хранения, простота транспортировки и употребления и так далее, имеется ряд недостатков - во первых, за счет процесса лиофильной сушки клетки микроорганизмов находятся в глубоком анабиозе, для перехода их в активное физиологическое состояние требуется 8-10 часов (процесс пищеварения у детей - 4-6 часов), к тому же после процесса лиофилизации клетки теряют специфические рецепторы (адгезины), с помощью которых они закрепляются на слизистых, в итоге время их пребывания в кишечнике снижается, таким образом, уменьшается терапевтический эффект. Также в процессе сушки разрушается большая часть метаболитов (в частности, жирные кислоты), которые содержат дополнительные лечебные факторы.

Известно, что для улучшения качества препаратов, в частности усвояемости и терапевтического эффекта, готовят закваски из бифидо- и лактобактерий, которые вносят в молоко, см., например, способ приготовления пробиотика на основе живых бифидо- и лактобактерий по патенту РФ №2060673, А 23 С 9/12, С 12 N 1/20, 1996 г.

Недостаток этого способа состоит в том, что основой пробиотика является цельное молоко, в которое вносится закваска. РН конечного продукта 4,4-4,8, а концентрация живых бактерий всего 108.

В качестве прототипа принят способ приготовления закваски для получения кисломолочного лактобактерина (см. методические рекомендации «Применение молочного лактобактерина в лечении заболеваний, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника». Горький, 1980 год, с.7).

Способ включает приготовление молочно-дрожжевой среды, содержащей гидролизат обрата молока (гидролизат обезжиренного молока) + 5% дрожжевого автолизата и + 0,2% глюкозы (углевода). Используют штаммы лактобактерий Lb fermenti 90-TC-4 или Lb plantamm 8-PA-3, которые засевают в молочно-дрожжевую среду из расчета 200-300 млрд на 10 л среды и инкубируют 20-22 часа.

Закваска имеет вид мутной жидкости грязно-желтого цвета с кислым вкусом. В 1 мл закваски содержится не менее 106-108 живых бактерий, значит, в конечном продукте их меньше.

Продукт обладает довольно высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микробам.

Недостатком известного способа является довольно короткий срок годности закваски (1-2 суток). Закваска используется только в составе кисломолочного продукта.

Эти недостатки устраняются предлагаемым решением.

Решаемая задача - совершенствование способа приготовления пробиотика (лечебно-профилактического препарата) на основе живых штаммов микроорганизмов с повышенным сроком годности (до 60 суток).

Технический результат - повышение жизнеспособности бактерий, их антагонистической активности и выхода биомассы.

Этот результат достигается тем, что в способе приготовления пробиотика на основе живых штаммов лактобактерий с использованием молочно-дрожжевой питательной среды (МДС), включающей гидролизат обезжиренного молока, дрожжевой автолизат, углевод в качестве источника энергии, путем культивирования в ней штаммов-продуцентов при температуре 37±1°С, расфасовку препарата, питательная среда дополнительно содержит агар-агар, разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока с содержанием аминного азота 130-200 мг %, в качестве углевода используют раффинозу, причем совместное культивирование штаммов лактобактерий L. plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39 ведут в два этапа: на первом этапе разведенные в среде штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют 24 ±1 ч, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000 и продолжают культивирование в течение 24±1 ч при той же температуре.

Таким образом, предложен оптимальный комплекс, позволяющий получить препарат из живых бактерий с более длительным сроком хранения.

Совместное культивирование штаммов синергистов L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 позволило ускорить процесс наращивания биомассы и увеличить ее выход.

Также при совместном культивировании этих штаммов синергистов повысился их уровень анатагонистической активности по отношению к широко распространенному виду грибов рода кандида C.albicans. Этот вид этиологически значим в 60-80% случаев заболеваний грибковой этиологии. Известно, что антагонистические свойства лактобацилл обусловлены их способностью к продуцированию бактериоцинов или бактериоциноподобных субстанций. Штаммы L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39, L.fermentum 90-TC-4 являются продуцентами бактериоцинов. L.plantarum 8 PA 3 устойчив к бактериоцинам, как к своим, так и к бактериоцинам, вырабатываемым L.fermentum 39, L.fermentum 90-TC-4. L.fennentum 39 обладает устойчивостью к действию собственных бактериоцинов, a L.fermentum 90-ТС-4 проявляет чувствительность к действию собственных бактериоцинов. А штаммы лактобацилл, устойчивые к собственным бактериоцинам, создают селективные преимущества, как для собственного роста, так и для штаммов резистентных к действию их бактериоцидов. Таким образом, штаммы L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39 могут культивироваться совместно с высоким уровнем выхода биомассы в отличии от L.fermentum 90-ТС-4.

Другая причина выбора штамма L.fementum 39 - его высокая адгезивная активность (бактериосорбция ) к муцину и фибронектину, которые являются рецепторами для адгезинов лактобацилл на эукариотических клетках, что имеет важное значение в обеспечении колонизации лактобациллами желудочно-кишечного тракта.

Использование в качестве основы МДС разведенного очищенной водой гидролизата обезжиренного молока увеличивает интенсивность снабжения клеток лактобацилл (которые являются микроаэрофилами) водородом и кислородом, гидроокись натрия удовлетворяет потребность клетки в неорганических элементах, агар-агар позволяет увеличить вязкость среды, что позволяет лактобациллам расти равномерно по всей толще среды (на жидких средах придонный рост), то есть равномерно потреблять факторы роста и питательные вещества по всему объему, а замена углевода глюкозы на раффинозу (фруктоолигосахарид), кроме удовлетворения потребности клетки в углеводе, способствует селективной стимуляции роста и активизации метаболизма полезных представителей кишечной микрофлоры (в частности, лактобацилл).

Способ осуществляют следующим образом. Готовят среду МДС по следующей схеме: кипятят обезжиренное молоко в течение 2-3 минут, охлаждают до 45°С, устанавливают рН 20% раствором едкого натра, добавляют панкреатин, перемешивают, добавляют хлороформ, ставят в термостат, первый час постоянно перемешивают, затем фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают аминный азот, разводят очищенный водой 2:1, из части готовят раствор агар-агара, в оставшуюся часть добавляют дрожжевой автолизат из прессованных дрожжей, разведенных водой, настоянных в термостате, затем проавтоклавированных и профильтрованных, и раффинозу, все перемешивают и стерилизуют.

Культивирование штаммов-продуцентов L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 проводят при температуре 37±1°C совместно в два этапа, на первом этапе разведенные в МДС штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют 24±1 часа, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей МДС в соотношении 1:1000 и продолжают культивировать еще 24± 1 часа при той же температуре. В конечный препарат идет вторая генерация штаммов, далее по окончании культивирования биомасса расфасовывается по 5 мл с учетом суточной дозы пробиотика. Эксперименты показывают, что этот режим является оптимальным для достижения результата.

Пример осуществления способа.

На первом этапе готовят впрок цельный гидролизат обезжиренного молока и дрожжевой автолизат.

Цельный гидролизат обезжиренного молока готовят следующим образом: кипятят обезжиренное молоко (I-II категории) в течение 2-3 минут, охлаждают до 45± 1°C, добавляют панкреатин из расчета 1 г/л, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44± 1°С воды, размешивают, ставят в термостат и выдерживают при температуре 40±1°С, постоянно перемешивают в течение 4-х часов с коррекцией активной кислотности, далее добавляют 1-2% хлороформа, закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат. В течение первых часов обезжиренное молоко несколько раз перемешивают, (пробку после встряхивания прокалывают для удаления паров хлороформа). Через 4 часа доводят рН до 4,3 ±0,1 ЕД 30% раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200-300 мг/% аминного азота. Хранят гидролизат впрок под хлороформом (1% к объему) при температуре 4± 1°С.

Дрожжевой автолизат готовят следующим образом: 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1л воды и помещают в термостат при температуре 56±1°С на 72± 2 часа. После этого полученную суспензию обрабатывают в автоклаве при температуре 115±1°С в течение 15 ±1 минут. Автолизат фильтруют через ватно-марлевый фильтр, промывая осадок таким количеством воды, чтобы общее количество фильтрата составило 4,0±0,1 л (хранят впрок в холодной камере при температуре 4±1°С).

Из полученного основного сырья готовят следующую рецептуру питательной среды (МДС):

Гидролизат обезжиренного молока 0,633 л 658,32 г 63,27% 
Вода очищенная 0,32 л 320 г 30,75% 
Дрожжевой автолизат 0,05 л 51,5 г 4,95% 
Агар-агар 0,75 г 0,75 г 0,07% 
Раффиноза 10,0 Г 10,0 г 0,96% 
Итого: 1040,57 г 100% 


NaOH 20% раствор от 0,00005 до 0,001 л для установления рН 7,1-7,2 ЕД. Режим стерилизации питательной среды: 20 минут при 0,5 атм.

Порядок приготовления.

Для приготовления МДС разводят цельный гидролизат (аминный азот 200-300 мг %) очищенной водой из расчета на 0,633 л цельного гидролизата 0,32 л очищенной воды, то есть 2:1 (аминный азот 130-200 мг %).

Далее берут 100 мл разведенного гидролизата, добавляют 0,75 г агара-агара и нагревают на водяной бане до полного растворения агара.

К оставшейся части разведенного гидролизата 0,853 л добавляют дрожжевой автолизат 0,05 л и 10,0 г раффинозы, перемешивают, добавляют разведенный агар, перемешивают, доводят рН до 7,1 ЕД 20% раствором гидроокиси натрия, перемешивают, разливают в нужные объемы и стерилизуют 20 минут при 0,5 атм.

В качестве штаммов-продуцентов используют L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39, имеющие высокую антагонистическую активность по отношении к C.albicans.

Культивирование штаммов-продуцентов производят по следующему способу.

I генерация - сухой штамм L.plantarum 8 РА 3 разводят 0,007 л МДС, растворяют в течение 10 минут, встряхивая, при комнатной температуре, так же готовят штамм L.fermentum 39. Далее их вместе сливают в соотношении 1:1 в 0,3 л МДС и культивируют 24 часа при температуре 37± 1°С.

II генерация. По 0,001 л I генерации добавляют в 1 л свежей среды МДС (т.е. из 0,314 л I генерации получается 314 л II генерации) и культивируют 24 часа при температуре 37 ±1°С.

По окончании культивирования биомассы осуществляют расфасовку готового к употреблению препарата во флаконы по 5 мл, герметично закрывают резиновой пробкой и алюминиевым колпачком. Хранится препарат при температуре +6± 2°С до 60 суток с сохранением живых микробных клеток в 1 мл жидкого препарата 109-1011 КОЕ/мл.

Препарат может быть получен реакторным методом.

Результаты испытаний полученного по описанному примеру препарата приведены в таблицах 1,2 и на графиках фиг.1,2.

В табл.1 показана жизнеспособность бактерий в препарате, полученном по известному способу (прототип) и предлагаемому. Видно, что количество живых микробных клеток сохраняется с увеличением времени хранения.

В табл.2 приведена антагонистическая активность штаммов лактобацилл, их комплекса и прототипа по отношению к грибам C.albicans.

На графиках фиг.1,2 приведены соответственно динамика роста лактобацилл при раздельном и совместном культивировании (она активнее при совместном культивировании - по количеству КОЕ/мл) и по изменению показателя оптической плотности среды - она выше при совместном культивировании штаммов L.plantarum 8 PA 3 и L.fermentum 39).

Препарат может использоваться перорально в 1 или 2 приема по 1 флакону в день перед едой с водой, молоком, кефиром, киселем, компотом, творогом, йогуртом и др. с температурой не выше 30°С.

Показания к применению: все заболевания этиологическим фактором, которых является C.albicans (бактериологически подтвержденная), все гастроэнтерологические заболевания, применение антибиотиков при любой патологии, аллергические заболевания, гинекологические заболевания (молочница) и беременным при подготовке к родам.

Возможно местное применение препарата в качестве вагинальных тампонов (2,5 мл на тампон 2 раза в сутки на 2 часа) или для обработки полости рта и десен (3-4 раза в сутки между приемами пищи по 1-2,5 мл на тампон).

Клиническая апробация пробиотика, приготовленного по способу, представленному в заявке, была проведена в следующих лечебно-профилактических учреждениях города Нижнего Новгорода: Городская детская клиническая больница №27, Детская поликлиника № 49 Приокского Райздравотдела, Сормовский межрайонный кожно-венерологический диспансер.

Указанные результаты полностью подтвердились.

Полученный предлагаемым способом препарат условно назван LL-комплекс.

Таблица 1 
Количество живых лактобацилл КОЕ/мл (LL-комплекс) на различных модификациях среды МДС. 
Наименование среды Время Хранения в сутках МДС (классическая) По прототипу МДС по предлагаемому способу 
Количество живых микробных клеток лактобацилл в 1 мл препарата в КОЕ\мл 
1 10 12 1012 
10 10 10 1012 
20 10 9 1012 
30 10 9 1012 
40 10 9 1011 
50 10 8 1011 
60 10 7 1011 
70 10 7 1010 



Исследовали антагонистическую активность L.plantarum 8 PA 3, L.fermentum 39 LL-комплекса и закваски для получения кисломолочного лактобактерина (по прототипу) по отношению к штаммам C.albicans (41 штамм), выделенных из различных биотопов организма человека (зев, мокрота, кишечник, репродуктивный тракт и др.).

Таблица 2 
Антагонистическая активность штаммов лактобацилл, их комплекса по отношению к грибам C.albicans 
Исследуемый штамм Отсутствие антагонистической активности (%) Низкая степень антагонистической активности (%) Высокая степень антагон-истической активности (%) 
L.plantarum 8 РА 3 8,8 47,2 44 
L.fermentum 39 5,8 50 44,2 
LL-комплекс предлагаемый способ. 0 29,4 70,6 
Закваска для получения кисломолочного лактобактерина (по прототипу) 8,8 47,2 44 



ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способ приготовления пробиотика на основе живых штаммов лактобактерий с использованием молочно-дрожжевой питательной среды, включающей гидролизат обезжиренного молока, дрожжевой автолизат и углевод, путем культивирования лактобактерий при температуре (37±1)°С, расфасовку препарата, отличающийся тем, что питательная среда дополнительно содержит агар-агар, разведенный очищенной водой гидролизат обезжиренного молока с содержанием аминного азота 130-200 мг %, в качестве углевода используют раффинозу, причем совместное культивирование штаммов лактобактерий L. fermentum 39 и L.plantarum 8 PA 3 ведут в два этапа: на первом этапе разведенные в среде штаммы соединяют в соотношении 1:1 и культивируют (24±1) ч, на втором этапе полученную биомассу первой генерации смешивают со свежей питательной средой в соотношении 1:1000 и продолжают культивирование в течение (24±1) ч при той же температуре.